Name: בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: למד אלגוריתם לבדיקת יעילות טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ריצוף גנום מלא ו-Xenografts ממטופלים. שיטה זו מאפשרת זיהוי שינויים גנומיים ואימות תרופות במודלים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מרכז המרפאה של מאיו עבור הרפואה האישית (CIM) ד ר. לין יאנג ופיי R. האריס, MS, על העזרה בביצוע ניסויים. העבודה הזאת נתמכת על ידי מר וגברת ניל א ' מתנה למרכז הקליניקה של מאיו לרפואה אישית (CIM).

רקמות טריות מן ההסכמה חולים עם סרטן השחלות נאספו בזמן של ניתוח debulking על פי פרוטוקול שאושרו על ידי מאיו קליניק מוסדי סקירה הלוח (IRB). כל ההליכים בעלי חיים וטיפולים המשמשים בפרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים מרפאת מיונז והשתמש הוועדה (IACUC) ואחריו הנחיות לטיפול בבעלי חיים.
1. הצמד רצף וניתוח של זוג
הערה: יש להשתמש ברקמה הטרייה או הקפואה לצורך שימוש ברצף משני הצדדים (MPseq). פרפין חומר מוטבע אינו מתאים משום שהוא מכיל דנ א מפוצל.
<ol><li>. בידוד דנ א מרקמת הגידול הקפואה השתמש בדגימה האדם המקורי שהתקבל מחומר כירורגי או ביופסיה36.</li>
	<li>השתמש 1000 ng של DNA כדי להפוך את הספריות MPseq ורצף כמו 2 דגימות למסלול על ברצף הדור הבא (ראה טבלת חומרים)36.</li>
	<li>ניתוח נתונים באמצעות ערכת אלגוריתמים כדי לזהות סטיות כרומוזומליות גדולות (מחיקות, הוספות, הגברה, היפוכיהם וטרנסמייקומים) כמתואר לעיל36,37.</li>
</ol>2. מבחר מטרות טיפוליות
<ol><li>השתמש בכלי הגישה הפתוחה Panda (נתיב וביאור) או בכלי מקביל לזיהוי שינויים בטבלת היעד (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda).<ol>
<li>הפוך רשימה של גנים המזוהים על-ידי MSeq כשינוי, כקובץ פשוט המופרד בטאבים, תוך שימוש בסמלי גנים סטנדרטיים מקובלים. הערה: הדוגמה הכלולה כוללת ניתוח של הגברה ורווחים.</li>
		<li>הוסף סימן "" לשורת הכותרת של הרשימה כדי לוודא שכותרת הטבלה מועברת לתצוגת רמת הנתיב של התוכנה.</li>
		<li>העלה את הקובץ על-ידי לחיצה על הכרטיסיה ' טען ערכת ביאור לניווט '.</li>
		<li>הקצה סמל בודד מהתפריט כדי לייצג את הנתונים המשמשים כבסיס על-ידי לחיצה על סמל הבחירה ולאחר מכן לחיצה על הכרטיסיה סיום .</li>
		<li>לאחר העלאת קבצי הביאור, זהה עמודה המציגה את מספר הגנים המוארים לכל מסלול. . זו העמודה האחרונה מימין</li>
		<li>השתמש מסנן מסלול בפינה השמאלית העליונה של החלון הראשי כדי להציג מסלולים המכילים גנים של עניין.</li>
		<li>זיהוי מסלולים בעלי גנים מוערת יותר מהצפוי במקרה. השתמש בפונקציה הממוקמת תחת הכרטיסיה העשרה .</li>
		<li>בחר מסד נתונים להצגת druggable גנים שעלולים להיות מוגדרים מראש על-ידי בדיקת סמל מתאים משמאל לחלון הראשי (לדוגמה, DGIdb, PharmGKB).</li>
		<li>בחר מסלול להדמיה על-ידי לחיצה על שמו המוצג בעמוד ' מציג הנתיב '. הערה: סמלים המייצגים כל ערכת ביאור מוצגים לצד הגן המשויך. לחץ על גן העניין כדי לפתוח את דף האינטרנט המתאים.</li>
		<li>בחר את מסלולים שהראו את הגנים מסומן של עניין (כלומר, שונה בגידול נתון) ו "להיטים" עבור תרופות פוטנציאליות לניתוח נוסף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש במסד נתונים המכיל תרופות המאושרות עבור יישום קליני (https://clinicaltrials.gov/) כדי להצליב הפניות למטרות שזוהו.</li>
	<li>קביעת עדיפות שינויים היעד לבדיקה נוספת במודלים PDX על ידי ביצוע סקירה ספרות (למשל, פומד) כדי לאשר רלוונטיות לביולוגיה של סוג מסוים של הגידול.</li>
</ol>3. ואלידציה של הסדרי גנומית על ידי רצפי PCR ו-Sanger
<ol><li>עיצוב בצבעי יסוד בעזרת רצף קריאות שהתקבלו מנתוני MPseq.<ol>
<li>בחר צומת מעניין עבור האימות (כלומר, יעד טיפולי פוטנציאלי) המבוסס על ניתוחי MPseq.</li>
		<li>עיצוב כיוון התחל לעצב כגון האמפליצין מכיל את הצומת. עיצוב 2 התחל בכל צד של הצומת, בסכום של 4, כדי להגדיל את הסיכויים של הגברת הצומת. הערה: שם התחל בהתאם למקרה ולמיקום הכרומוזום.</li>
		<li>השתמש בפרמטרי PCR סטנדרטיים עבור העיצוב התחל ותוכנה של בחירה. בחר טמפרטורת התכה (60-62 ° c) ותוכן ה-GC (40-60%). ודא שהרצף הפריימר אינו יוצר מפלינדרומים, לולאות בלתי מיוצרות.</li>
		<li>ודא כי הרצף הפריימר חסר הומולוגיה לתחומים אחרים של הגנום האנושי על ידי בדיקת השימוש בבלט (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל את ה-PCR כדי להגביר את צומת הריבית.<ol>
<li>לדלל את התחל עם מים כדי 10 מ"מ ולשלב 10 מ ל של כל פריימר, כך כל פריימר קדימה מזווג עם כל פריימר הפוכה לתערובת פריימר. הערה: רצפי הצבעי היסוד עבור הדוגמה שנבחרה מוצגים בטבלה 1.</li>
		<li>תווית 0.2 mL שפופרות הרצועה כמו: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 ו-T4 שבו C = בקרת DNA גנומית האדם (מסחרי), T = DNA הגידול, מבודד מסרטן או הגידול PDX, ואת המספר מציין את התמהיל פריימר.</li>
		<li>הוסף 1 מ ל של כל שילוב פריימר לתוך הצינורות שלו התווית.</li>
		<li>להכין את המיקס Taq ידי שילוב ריאגנטים המפורטים בטבלה 2, להשאיר את האנזים במקפיא עד הצורך, הוספת אותו לערבב בסוף.</li>
		<li>הפוך 2 תערובות מאסטר, אחד עבור כל ה-DNA תבנית, בקרת דנ א אנושי הגידול DNA. הוסף 24 מ ל של כל תערובת בסיס Taq לצינור הרצועה המתאים שלה. נפח התגובה הכולל הוא 25 מ ל. מערבולת לזמן קצר מאוד ואז לסובב את הצינור העירום למטה.</li>
		<li>תריץ את הסרט הPCR. בתוך מפעל התרמותרמי השתמש בפרמטרים המוצגים בטבלה 3. התאימו את טמפרטורת הריפוי כדי להגיע ללפחות 1 ° צ' קר מטמפרטורת ההיתוך של התחל.</li>
		<li>אחסן את מוצר ה-PCR המלא ב-20 ° צ' (טווח ארוך) או בקירור ב-4 ° צ' (טווח קצר) עד לצורך.</li>
		<li>לבצע אלקטרופורזה ב 1-5 V/cm כדי להמחיש את המוצר PCR באמצעות 1.5% agarose ג'ל. השאר 2 mL סדרת מחלקים של המוצר כדי לשמש רצף של sanger.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בצעו רצף של Sanger כדי לאשר את הצומת ולזהות את נקודת העצירה המדויקת38.<ol>
<li>השתמש במוצר ה-PCR אם ה-PCR יצר מוצר אחד (רצועה). לחילופין, לחתוך את הלהקה מתוך ג'ל, לטהר ולהגיש לרצף שסנגר יחד עם הפריימר המשמש הגברה. הערה: גידולים שעבורם ניתוחים גנומית בוצעו אז משמשים השרשה בעכברים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הטיפול בתיאום ואחזקה של הגידול
<ol><li>הגדרת ההכנות לגידולים עפיל לתוך מודלים של עכבר PDX. בחר עבור גידולים בתיאום שעבורם ניתוחים גנומית יהיו או בוצעו.<ol>
<li>ודא שתשתית תומכת נמצאת במקום בזמן תחילת הפיתוח של כל דגמי PDX, כולל מתקני מעבדה ובעלי חיים ייעודיים, צוות טכני מיומן ונוהלי הפעלה סטנדרטיים מפורטים.</li>
		<li>להבטיח את התחבורה המהירה ואת העיבוד של דגימות כמו מהירות היא חיונית לכדאיות התא והעפילה מוצלחת.</li>
		<li>השתמש בסביבה סטרילית כדי להפחית זיהום חיידקי ופטרייתי לעיבוד וחרט דגימות.</li>
		<li>לטפל בדגימות של בני אדם בזהירות, בהתאם למדיניות המוסדית בנוגע לחומרים העלולים להיות מסוכנים, כאשר הם עלולים להיות בעלי פתוגנים הנישאים בדם.</li>
		<li>הכן את הרקמה (0.5-0.7 ס"מ3 בגודל) עבור חרט על ידי הצבת דגימה כירורגית לתוך צינור מקורר 50 mL עם 20 מ ל של מדיה תרבות רקמות. הערה: רקמת הגידול יכול להיות טרי או התאושש בעבר חומר הקפאה5.</li>
		<li>לאשר את תכולת הגידול בדגימה על ידי ייעוץ פתולוגית.</li>
		<li>מניחים את רקמת הגידול בקערה המכילה 10-15 mL של הקרים PBS, או מדיה תרבות רקמות כגון RPMI 1640 או DMEM המכילים אנטיביוטיקה (1% פניצילין ו-סטרפטומיצין).</li>
		<li>לזהות ולבודד חומר הגידול קיימא מרקמת נורמלי ונמק סמוכים עם עזרה של הפתולוג. השתמש מלקחיים סטרילי אזמל להסיר חומר נקרוטי הצביע על ידי הפתולוג. הערה: הגידול יכול להיות מושתל או intraperitoneally או תת-עורי לתוך העכברים. בצע את השלבים 4.2 כדי לבצע השרשה הצפק או דלג לשלב 4.3 לביצוע החרט תת עורי. במחקר זה, טיפולים ייעודיים שנבחרו על בסיס ניתוחים גנומים נבדקו בסדרה של מודלים pdx לסרטן השחלות נסיובי גבוה בכיתה עם השרשה הצפק.</li>
	</ol></li>
	<li>הכן את הרקמה עבור השרטת הצפק (IP) לערבב את הרקמה עם מלקחיים סטרילית אזמל על הקרח כדי ליצור חתיכות כ 1-1.5 מ"מ3 בגודל וערבוב עם מדיום התרבות הקרה. הכנס 0.3 – 0.5 מ ל של שאיפה הגידול באמצעות מחט 16-17 למדוד. הערה: כל ההליכים המנתחים מתבצעים באמצעות טכניקות אספטיות. כפפות סטרילי, מכשירים סטריליים, אספקה, חומרים מושתלים שימשו כדי להפחית את הסבירות של זיהום.<ol>
<li>מערבבים את החלקים 1:1 עם בינונית התרבות קרח קר להזריק 100 mL intraperitoneally לפחות שלוש עכברים SCID נקבה.</li>
	</ol></li>
	<li>חותכים את רקמת הגידול עבור חרט תת עורית באמצעות מלקחיים סטרילי, אזמל, או מספריים כירורגיים לתוך שברים קטנים, בערך 2 x 2 x 2 מ"מ בגודל, ולהעביר את הרקמות מפוצל לצלחת פטרי מראש מקורר על קרח.<ol>
<li>הוסף את מטריצת הממברנה הקרה במרתף לתוך המנה עם רקמת מפוצל (כ 200 mL לכל 10 חתיכות של רקמה), לערבב היטב, ולתת את שברי הרקמה להשרות מטריקס קר קרום המרתף עבור 10 דקות.</li>
		<li>כיצד להכין את העכברים לצורך הכנת הראש.</li>
		<li>להזריק כל עכבר intraperitoneally עם קטמין (150 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) שילוב.</li>
		<li>אשר את העכבר מורדם כראוי על ידי צובט את קצה הזנב עם מלקחיים atraumatic.</li>
		<li>הסרת עכבר בעדינות מורדם לחלוטין מן התא ולשים על העכבר חרוט אף אשר יש קלט מ אידוי ופלט ממערכת ניקוי גז פסולת.</li>
		<li>לשים משחה וטרינר על העיניים העכבר כדי למנוע יובש בזמן הרדמה. הכינו את האזור בו הניתוח יבוצע. השתמש בטכניקה אספטי כדי לבצע את הניתוח.</li>
		<li>ודא כי המשטח שבו הניתוח הולך לקחת הוא לא נקבובי, אטום וחוטא לפני הניתוח.</li>
		<li>להתחיל לנתח עם סטרילי (על ידי החיטוי, גז או עיקור כימיים) כלים.</li>
		<li>השתמש בכפפות כדי לטפל במכשירים ולשמור על עקרות של טיפים המכשיר במהלך ההליך על ידי מיזוג אותם באתנול בין שלבי הניתוח.</li>
	</ol></li>
	<li>לחטא את האתר כירורגי ידי החלת 3 לסירוגין מקרצף של יוד ואלכוהול. השתמש מספריים ניתוח סטרילי מלקחיים לעשות חיתוך עור אנכי 5-10 מ"מ בשני האגפים של העכבר.<ol>
<li>הכנס מלקחיים ישר בעדינות לתוך החלל התת עורי כדי ליצור כיס גדול מספיק כדי רסיס הגידול להיות ממוקם תחת פד שומן.</li>
		<li>השתמש מלקחיים ישר סטרילי להוסיף שברי הגידול לתוך כיס שהוכן בעבר בכל אחד 5 עכברים. הערה: מקום 3-4 חתיכות של רקמת הגידול בכיס אחד.</li>
		<li>סגרו את החתכים בעור באמצעות דבק רקמות.</li>
		<li>Intraperitoneally להזריק כל עכבר עם 100 mL של Rituximab לאחר השרשה כדי לעכב את התפשטות הימפוציט.</li>
	</ol></li>
	<li>למקם את העכבר לתוך כלוב תחת מנורת חום במשך כ 20 דקות עד התאושש מן ההרדמה. לנטר את הסימנים החיוניים לעכבר ולהבטיח מחות מספיקה.</li>
	<li>להחזיר את העכבר לחברה של עכברים אחרים לאחר שהוא התאושש מהרדמה והחל לאכול ומים. לספק טיפול פוסט-פעיל וניטור בהתאם להנחיות המוסדיים. בדקו סימנים של כאב ומצוקה מדי יום למשך 3 ימים רצופים לאחר הניתוח. הערה: קריטריונים של כאב או מצוקה כוללים נמק או כיבית, הרזיה/מצב גוף הבקיע, סימני התנהגות כגון רמת הפעילות, תפקוד מנוע ויציבה.</li>
	<li>בדוק באופן שגרתי את העכברים עבור היווצרות הגידול bi-שבועי עד הגידולים להגיע לגודל של 0.5 ס מ קוטר כפי שנמדד על ידי caliper.</li>
	<li>להעריך את תוצאת הבריאות של כל עכבר כפי שנגזר מן המראה, התנהגות, ואת מצב הגוף39. השימוש עשרות ≤ 6 כקריטריון עבור עכברים מוריקה להיות הקריב על ידי פחמן דו חמצני שאיפת.</li>
</ol>5. בדיקת תגובות genomically מטרות שזוהו בדגמי PDX
<ol><li>הפעל את הטיפולים הייעודיים שנבחרו כאשר הגידולים הם מוחשי ולהגיע 0.5 ס"מ3 כפי שנמדד על ידי סריקת אולטרסאונד.<ol>
<li>לפני ביצוע סריקת אולטרסאונד של הבטן להסיר את פרוות הבטן העכבר ולהחיל חומר סיכה סטרילי ג'לי.</li>
		<li>השתמש במכונת אולטרה סאונד עם מתמר כדי להשיג תמונות עם הגידול ממוקם בחתך רוחב. לבצע 3 מדידות לכל הפעלה עבור כל בעל חיים והממוצע ערך עבור הערכה מדויקת יותר של גודל הגידול.</li>
		<li>לנתח את התמונות באמצעות תוכנה זמינה40.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניהול כימותרפיה המורכבת של תערובת של קראופלטין ב 51 מ"ג/ק"ג ו פקליטקסל ב 15 מ"ג/ק"ג intraperitoneally (IP) פעם בשבוע עבור משך הטיפול הכולל של 4-6 שבועות. ודא כי אמצעי האחסון הכולל להזרקה אינו עולה על 0.2 mL.</li>
	<li>הפוך את MK-220641 מניות פתרון ב 30% cyclodextrin (למשל, Captisol) ולספק דרך הפה gavage ב 120 מ"ג/ק"ג מדי יום עבור 4 שבועות רצופים.</li>
	<li>להכין את העכבר לgavage אוראלי על ידי להחזיק אותו על ידי צובט את העור בגב והצמדת אותו בחזרה, כך הראש והגפיים של העכבר הם ללא קיבוע.<ol>
<li>הכנס את gavage לחקור לאורך החלק האחורי של הגרון של העכבר עד הגשוש מגיע הוושט. ודא כי המכשיר אינו מוכנס רחוק מדי, כמו הריאות של העכבר עשוי לנקב, גרימת מוות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע a MK-866942 פתרון המניה באתנול ב 25 מ"ג/mL. לדלל אותו ברכב המכיל 5.2% רצף 80, 5.2% PEG400 במים סטרילי עבור זריקות IP ב 10 מ"ג/ק"ג עבור 5 ימים בכל שבוע אחר, עם משך כולל של הטיפול של 4 שבועות. הערה: נפח מוזרק לעכברים צריך להיות 50-120 mL, בהתאם למשקל של בעל החיים.</li>
	<li>השתמש 7-8 עכברים לכל קבוצת טיפול יש מספיק כוח סטטיסטי כדי לזהות43הבדלים 43,44.</li>
	<li>להעריך את משקל הגוף ואת המצב הכללי של העכברים בטיפול מדי יום. למנוע סמים אם משקל החיה צונח 20% או יותר ממשקלם הראשון.</li>
	<li>להעריך את גודל הגידול שבועי באמצעות סריקת אולטרסאונד. ודא כי הפרט ביצוע הניטור של צמיחת הגידול הוא עיוור לטיפול כדי להבטיח את הניקוד משוחדת של תגובות. הערה: מעבדות קטנות יותר עשויות להעסיק 2 אנשים שונים כדי לנהל את ניטור הטיפול והאולטרסאונד.</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.

אנו מתארים את הגישה ואת הפרוטוקולים השתמשנו לבצע "ניסוי קליני" ב PDX מודלים שלוקח את היתרון של מאפיינים מולקולריים של הגידול כפי שהושג על ידי יצירת פרופיל גנומית כדי לקבוע את הבחירה הטובה ביותר של תרופות לבדיקה. פלטפורמות רצף מרובות משמשות כעת עבור אפיון גנומית של גידולים ראשוניים כולל רצף הגנום השלם, RNAseq ולוחות גנים מותאמים אישית. עבור קרצינומה של השחלות נסיובי בדרגה גבוהה, mpseq לזיהוי שינויים מבניים, DNA הסדרים מחדש והעתק מספר שינויים, שימושי במיוחד בגלל הרמה הגבוהה של אי-יציבות גנומית נצפתה בסוג זה של הגידול. היתר...

המטופל נגזר xenografts תלי (pdxs), אשר נוצר מן ההשתלה של חתיכות הסרטן החולה לתוך עכברים לקויה, התפתחה כמו מודל רב עוצמה פרה לסייע אישית אנטי סרטן טיפול. מודלים PDX פותחו בהצלחה עבור מגוון רחב של ממאירות אנושית. אלה כוללים סרטן השד והשחלות, מלנומה ממאירה, סרטן המעי הגס, אדנוקרצינומה הלבלב, ו סרטן ריאות תאים לא קטנים1,2,3,4,5. רקמת הגידול יכול להיות מושתל אורתולמריחה או הטרועור. לשעבר, נחשב מדויק יותר אבל מבחינה טכנית קשה, כרוך השתלת ישירות לתוך איבר של מוצא הגידול. סוגים אלה של מודלים מאמינים בדיוק לחקות היסטולוגיה של הגידול המקורי בשל "טבעי" מיקרו הסביבה עבור הגידול6,7. לדוגמה, השתלת הנושא אורתוגרקציה לתוך בורסה של השחלה העכבר הביא הפצת הגידול לתוך חלל הצפק וייצור של מיימת, אופייני לסרטן השחלות8. באופן דומה, הזרקה של גידולים בשד לתוך החזה במקום בלוטת הפטמות הבטן השפיעו על שיעור ההצלחה PDX והתנהגות9. עם זאת, מודלים אורתוטופית דורשים מערכות דימות מתוחכמות כדי לפקח על צמיחת הגידול. הטרוההשתלת הגידול מוצק מבוצעת בדרך כלל על ידי השתלת רקמת לאגף תת עורית של העכבר המאפשר ניטור קל יותר של צמיחת הגידול והוא פחות יקר זמן רב7. עם זאת, גידולים הגדלים תת-עורי לעתים נדירות גרורות בניגוד לציין במקרה של השרשה אורתודפית10.
שיעור ההצלחה של החרט הוכח להשתנות ומאוד תלוי בסוג הגידול. גידולים אגרסיביים יותר ודגימות רקמות המכילות אחוז גבוה יותר של תאים סרטניים דווחו יש שיעורי הצלחה טובה יותר12,13. בהתאם למצב זה, גידולים שמקורם באתרים גרוניים הוכחו להיחרט בתדרים של 50 – 80%, בעוד אלה מהאתרים העיקריים העפילו בתדרים נמוך כמו 14%12. לעומת זאת, הרקמה המכילה את התאים נקרוטיק ופחות תאים סרטניים קיימא חרט גרוע. צמיחה הגידול יכול גם להיות מקודם על ידי תוספת של המרתף קרום מטריקס חלבונים לתוך תערובת רקמות בזמן הזריקה לתוך עכברים14 מבלי להתפשר על מאפיינים של הגידול המקורי. הגודל ומספר הרקמה שנועדו לשרשה נמצאו גם הם להשפיע על שיעור ההצלחה של החרט. גידול גדול יותר לקחת-שיעורי דווחו על השרשה בקפסולה תת כליות לעומת השתלת תת עורית בשל היכולת של קפסולת תת כליות לשמור על משתית הגידול המקורי ולספק את התאים סטרומה המארח גם15.
רוב המחקרים להשתמש בעכברים חיסוני SCID הלקוי, אשר חסר תאים הרוצח טבעי16 הוכחו להגדיל את הגידול בתאום, צמיחה גרורות לעומת זנים אחרים14. עם זאת, ניטור נוסף נדרש כפי שהם עשויים לפתח לימפומה הרתי מוקדם ככל 3-4 חודש של גיל13. ב השתלות גידול השחלות גדל בעכברים SCID, הצמיחה של התאים B היה מעוכב בהצלחה על ידי rituximab, מניעת פיתוח של לימפומה אך מבלי להשפיע על העפילה של גידולים בשחלות17.
לאחרונה, NSG (הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/szj) עכברים, נושא מוטציה null בקידוד הגן של האינטרלוקין 2 שרשרת גמא הקולטן18, הפך להיות זן שימוש תכוף עבור הדור של מודלים pdx. גידולים מדגמי pdx הוקמה לדורות הבאים של עכברים מדווחים לשמור על תכונות היסטולוגית ומולקולרית עבור 3 עד 6 דורות19,20. מחקרים רבים הראו כי התוצאות הטיפול ב pdx מודלים לחקות את אלה של המטופלים המתאימים שלהם2,3,4,21,22,23. שיעור התגובה כימותרפיה ב pdx מודלים עבור סרטן ריאות לא קטן קרצינומות המעי הגס היה דומה לזה בניסויים קליניים עבור תרופות אותן24,25. מחקרים שנערכו בדגמי pdx, שפותחו עבור חולים שנרשמו בניסויים קליניים, הפגינו תגובות תרופות בדוקות דומה לאלה שנצפו קלינית בחולים המתאימים2,3,4.
גבוהה – התפוקה גנומית ניתוח של גידול החולה בשילוב עם מודלים PDX לספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את היחסים בין שינויים גנותיים ספציפיים תגובה טיפולית. אלה תוארו במספר פרסומים26,27. לדוגמה, התגובות הטיפוליות ל-egfr מעכב ארביטוקס בקבוצה של מודלים pdx המעי הגס נושא הגברה egfr, וקרב התגובות הקליניות כדי ארביטוקס בחולים28.
ישנם כמה אתגרים הקשורים לפיתוח ויישום של מודלים PDX. בין אלה הוא גידול טרוגניות29,30 זה עלול לפגוע בדיוק של פרשנות תגובת הטיפול כמו שיבוט תא יחיד עם קיבולת ההתרבות גבוה יותר בתוך pdx יכול לעבור את אלה אחרים31, ובכך התוצאה היא אובדן של טרוגניות. בנוסף, כאשר ביופסיות הגידול בודד משמשים לפיתוח PDX, חלק מאוכלוסיית התאים עלולים להיות מחמיץ ולא יהיה מיוצג בשתל הסופי. דגימות מרובות מאותו גידול מומלצות להשתלה כדי לפתור את הבעיה. למרות הגידולים PDX נוטים להכיל את כל סוגי התא של גידול תורם המקורי, תאים אלה הם הוחלף בהדרגה על ידי אלה של מקור murine3. הגומלין בין מסטרומה מורטין ותאי הגידול האנושיים בדגמי PDX לא מובנים היטב. למרות זאת, תאים סטרומה הוכחו באופן מסכם מיקרו סביבה גידול33.
למרות מגבלות אלה, מודלים PDX להישאר בין הכלים החשובים ביותר עבור מחקר טרנסלtional, כמו גם רפואה אישית לבחירת טיפולים החולה. יישומים עיקריים של PDXs כוללים גילוי סמנים ביואריקר ובדיקות סמים. Pdx מודלים משמשים גם בהצלחה כדי ללמוד התנגדות לסמים מנגנונים ולזהות אסטרטגיות כדי להתגבר על עמידות לסמים34,35. הגישה המתוארת בכתב היד הנוכחי מאפשרת לחוקר לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות בגידולים אנושיים ולהעריך את היעילות של התרופות המתאימות בvivo, בעכברים המייצגים גידולים מנופה שgenomically בתחילה. הפרוטוקול משתמש גידולים השחלות המנופה intraperitoneally אבל הוא ישים לכל סוג של הגידול אגרסיבי מספיק כדי לגדול בעכברים2,3,12.

<table><tbody><tr><td>3M Vetbond</td><td>3M, Co.</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים נגד AKT</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>9272</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד GAPDH (G-9)</td> <td>סנטה קרוז ביוטק בע"מ</td><td>sc-365062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAPK נוגדנים</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>9926</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים אנטי-פוספו-AKT</td><td>טכנולוגיות איתות תאים, בע"מ</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mTOR נוגדנים</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2972</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-mTOR Anti-Phospho-mTOR</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2971</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-S6</td><td>נוגדנים Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>4858</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rictor Anti-Rictor Anti-Rictor</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S6</td><td>נוגדנים Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2217</td><td></td></tr><tr><td>קפטיזול</td><td>ChemScene, בע"מ</td><td>cs-0731</td><td></td></tr><tr><td>קרבופלטין</td><td>NOVAPLUS, בע"מ</td><td>61703-360-18</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Easy-A Hi-Fi PCR אנזים שיבוט</td><td>Agilent, Inc.</td><td>600404-51</td><td></td></tr><tr><td>חומר סיכה</td><td>Cardinal Healthcare</td><td>82-280</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td></td>356234</tr><tr><td>המדיה של מקוי</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>MK-2206</td><td>ApexBio, Inc.</td><td>A3010</td><td></td></tr><tr><td>MK-8669</td><td>אריאד פרמצבטיקה, בע"מ</td><td></td><td></td>AP23573</tr><tr><td>כנסיית נאיר לעור רגיש</td><td>& דווייט ושות'</td><td>מסיר שיער Nair מקלחת רגיש</td><td></td>לכוח</tr><tr><td>עכברי NOD/SCID</td><td>צ'ארלס ריבר, בע"מ</td><td>הנהון. CB17-Prkdcscid/NCrCrl</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>NOVAPLUS, Inc.</td><td>55390-304-05</td><td></td></tr><tr><td>PEG400</td><td>Millipore Sigma, Inc.</td><td>88440-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>פרג'טה</td><td>ג'נטק, ושות'</td><td>פרטוזומאב</td><td></td></tr><tr><td>ריטוקסימאב</td><td>ג'נטק, ושות'</td><td>ריטוקסן</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>מדיה-טק בע"מ</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>עכברי SCID</td><td>מעבדות הרלן, בע"מ</td><td>C.B.-17 / IcrHsd-PrkdcscidLystbg</td><td></td></tr><tr><td>SLAx 13-6MHz מתמר ליניארי</td><td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td><td>HFL38xp</td><td></td></tr><tr><td>SonoSite מכונת אולטרסאונד מסדרת S</td><td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td><td>SonoSite SII</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Millipore Sigma, Inc.</td><td>P4780-100 מ"ל</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי dna מבנית והמטופל נגזר xenografts

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

אנו מציגים כאן גישה אינטגרטיבית לבדיקת יעילות של טיפולים ייעודיים המשלב הדור הבא ברצף technolo-, ניתוחי היעד הטיפולית וניטור תגובת התרופה באמצעות מטופל הנגזר xenografts תלי (PDX). אסטרטגיה זו אומתה באמצעות גידולים בשחלות כדוגמה. פרוטוקול רצף הדור הבא (MPseq) של זוג הזוגות שימש לזיהוי שינויים מבניים ולאחריו ניתוח של שינויים שעלולים לגרום לשימוש בטבלה. גידולים אנושיים שגדלו בעכברים בסיכון חיסוני טופלו תרופות שנבחרו מבוסס על ניתוחים גנומית. תוצאות הפגינו מתאם טוב בין התגובות החזוי והנצפים במודל PDX. הגישה המוצגת ניתן להשתמש כדי לבדוק את היעילות של טיפולים שילוב וסיוע טיפול מותאם אישית עבור חולים עם סרטן חוזרים, במיוחד במקרים שבהם טיפול רגיל נכשלת ויש צורך להשתמש בסמים מחוץ לתווית.

רקמות מפני גידולים השחלות מחדש בזמן של ניתוחים debulking נאספו בהתאם הדרכה IRB ומשמש 1) האפיון גנומית ו 2) חרט עכברים החיסונית (איור 1). 36,37 שימש לזיהוי שינויים מבניים ב-DNA כולל הפסדים, רווחים והגברה. מגרש הגנום נציג הממחישות נוף של שינויים גנומית בגידול אחד (המיועדים כ OC101) מוצג באיור 2. אופייני לגידולים ברמה גבוהה נסיובי סוג, רווחי מרובים (קווים כחולים) ומחיקות (קווים אדומים) נמצאו, המציין רמות גב...

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבדוק את היעילות של טיפולים ייעודיים שנבחרו על בסיס האיפור גנומית של הגידול. הפרוטוקול מתאר זיהוי ואימות של הסדרים מבניים של ה-DNA, חרט גידולים של חולים לתוך עכברים והתגובות בדיקה לתרופות המתאימות.

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

הפרוטוקול המתואר כאן נועד להדגים אלגוריתם לבדיקת יעילות הטיפול באמצעות מודלים של סרטן vivo. הפרוטוקול מורכב משילוב של מספר טכניקות. רצף ביולוגי שלם של הגנום של דגימות גידול אנושי משמש לזיהוי שינויים גנומיים.אלה כוללים גם סידורים מחדש של גנים וגם שינויים במספר עותקי הגנים. אז הניתוח של שינויים מזוהים מבוצע על מנת לבחור שינויים שעשויים להיות ניתנים לסמים. התרופות שנבחרו על סמך ניתוח גנומי משמשות לאחר מכן לטיפול in vivo בגידולים מקבילים הגדלים בעכברים immunocompromised.האלגוריתם המפותח מייצג גישה מבטיחה לסיוע בהחלטות טיפול בטיפול בחולים בסרטן. השתמש בכלי Panda או בתוכנה אנלוגית כדי לזהות שינויים הניתנים למטרה. אנחנו יכולים לפרט את הגנים שזוהו על ידי microsequencing הביא כקובץ מסוים טאב פשוט באמצעות סמלי גנים מקובלים סטנדרטיים.הוסף את סימן הפאונד לכותרת העליונה של הרשימה כדי להבטיח שכותרת הטבלה תועבר לרמת הנתיב U של התוכנה. העלה את הקובץ על-ידי לחיצה על כרטיסיית הניווט המתאימה. הקצה סמל יחיד כדי לייצג את הנתונים המשמשים כבסיס על-ידי לחיצה על סמל הבחירה ולאחר מכן לחיצה על הכרטיסיה 'תהפוך לסופי'.לאחר מכן מועלים קבצי מטופל, הצג את הדף בתצוגה מקדימה כדי לזהות עמודה המציגה את מספר הגנים המוערים לכל מסלול. זו העמודה האחרונה מימין. השתמש במסנן מסלול בפינה הימנית העליונה של החלון הראשי כדי להגביל את מספר הנתיבים המוצגים לאלה המכילים את הגנים המעניינים.כדי לזהות מסלולים שיש להם יותר גנים מבוארים מהצפוי במקרה, השתמש בפונקציה הממוקמת תחת לשונית ההעשרה. לאחר מכן, עמודה נוספת לטבלה הראשית המציגה ערך p תואם מהבדיקה המדויקת של פישר. בחר את מסד הנתונים כדי להציג גנים פוטנציאליים לתרופה מהביאור המוגדר מראש על-ידי בדיקת סמל מתאים בצד שמאל של החלון הראשי.כדי לבחור נתיב לפריט חזותי, לחץ על שמו המוצג בדף מציג הנתיבים. סמלים המייצגים כל ערכת ביאורים מוצגים לצד הגן המשויך. לחיצה על כל גן במסלול תפתח את דף כרטיסי הגנים המתאים.בחר את המסלולים שהראו גנים מבוארים של עניין להיטים עבור תרופות פוטנציאליות לניתוח נוסף. בצע את עבודת הרקמה במכסה המנוע לזרימת למינאר כדי לשמור על תנאים סטריליים. הנח את רקמת הגידול בצלחת המכילה PBS קר או מדיה תרבות רקמות, כגון RPMI, DMEM, המכיל אנטיביוטיקה.לזהות ולבודד חומר גידול בר קיימא מרקמה נורמלית ונמקית סמוכה בעזרת פתולוג. השתמש מלקעות סטריליות ואזמל כדי להסיר חומר נמק הצביע על ידי פתולוג. כדי לבצע חריטה תת עורית, לחתוך את רקמת הגידול עם ממטרים סטריליים, אזמל או מספריים כירורגיים לרסיסים קטנים, בערך 2 x 2 x 2 מילימטרים בגודל.מעבירים את הרקמה המפוצלת לצלחת פטרי מצוננת מראש על קרח. תן מטריגל קר לתוך המנה עם הרקמה מקוטעת, כ 200 microliters לכל 10 חתיכות של רקמה. מערבבים היטב ולתת שברי הרקמה להשרות את המטריגל במשך 10 דקות.השתמש מספריים כירורגיים סטריליים מדפים לעשות חתך עור אנכי 5-10 מילימטרים על שני האגפים של העכבר. הכנס מדפים ישרים בעדינות לחלל התת עורי כדי ליצור כיס גדול מספיק כדי שבר הגידול להיות ממוקם מתחת כרית השומן. השתמש במדפים סטריליים ישרים כדי להכניס שברי גידול בכיס שהוכן בעבר בכל אחד מחמשת העכברים.סגור את חתך העור באמצעות דבק רקמות. לאחר ההשתלה, כדי לעכב התפשטות לימפוציטים, להזריק לכל עכבר עם 100 microliters של rituximab. הכן את העכבר עבור gavage אוראלי על ידי צביטת העור של הגב וכיפוף אותו לאחור, כך הראש והשפתיים של העכבר משותקים.הכנס את בדיקה gavage במורד החלק האחורי של הגרון של העכבר עד החללית מגיעה הוושט. ודא כי החללית אינה מוכנסת רחוק מדי כמו הריאות של העכבר עלול לניקוב גרימת מוות. צף הגנום הייצוגי ממחיש את הנוף של שינויים גנומיים בגידול אחד.אופייני לגידולים סרוסוביטיפ בדרגה גבוהה, רווחים מרובים קווים כחולים והפסדים קווים אדומים, זוהו המציין רמות גבוהות של חוסר יציבות גנומית. שינוי המגמה העליון להתערבות טיפולית בגידול OC101 היה הגברה כרומוזום 17, מעורבים ERBB2, גן אשר קודים עבור קולטן HER2. כדי לאמת את התוצאות ברמת הדנ"א, מספר קבוצות של פריימרים ספציפיים תוכננו עבור הקצוות של האזור המוגבר.ו PCR בוצע. שום מוצר הגברה לא נספג בעת שימוש בדנ"א אנושי. להקות ספציפיות זוהו עבור DNA גידול OC101.בגידול גרסה אחרת, T14, רווחי DNA רבים נצפו. אלה כללו AKT2 בגנים RICTOR. אימות שבוצע ברמת החלבון, באמצעות immunoblotting הראה רמות גבוהות של AKT ב RICTOR.ירידה משמעותית בנטל הגידול נצפתה בקבוצה לטיפול כימותרפי עד סוף השבוע השישי. היה יתרון נוסף על כימותרפיה לבד בקבוצות שקיבלו טיפול משולב. רקמת הגידול נאספה לניתוח מולקולרי של תגובת הטיפול בסוף ניסוי הטיפול.רמות סה"כ וזרחן של S6, AKT, ו mTOR נקבעו באמצעות immunoblotting. השוואה של רמות של חלבונים אלה בטיפול לא מטופל, כימותרפיה, וטופלו עם מעכבי AKT או mTOR הראו ירידה ניכרת עבור שני האחרונים. הגישה המוצגת שימושית מאוד כדי לנהל את הניסוי הקליני במודלים PDX.זה מנצל את המאפיינים המולקולריים של הגידול כפי שהושג על ידי פרופיל גנומי כדי לקבוע את הבחירה הטובה ביותר של תרופות לבדיקה.

testing-targeted-therapies-cancer-using-structural-dna-alteration

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

כתב יד זה מפרט שיטה המשמשת ליצירת קסנוגרפלים שמקורם בחולי סרטן הערמונית (PDX) מתאי גידול במחזור (CTCs). יצירת מודלים PDX מ-CTCs מספקת מודל ניסיוני חלופי לחקר סרטן הערמונית; הגידול המאובחן השכיח ביותר וסיבת מוות שכיחה מסרטן אצל גברים.

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

Xenografts הסרטני האנושי הוא vascularized ו הסתננו תאים ממוצא העכבר במהלך שלב צמיחת in vivo. כדי לעקוף את ההטיה הנגרמת על ידי תאי זיהום אלה במהלך ניתוח במורד זרם, פתחנו שיטה המאפשרת דלדול מקיף של כל תאי העכבר על ידי מיון תא מגנטי.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

ניצול גידולים שמקורם המטופל במודל פרה-קליני תת עורית הוא דרך מצוינת ללמוד את היעילות של טיפולים חדשניים, גילוי סמן ביולוגי חזוי, ושבילי סמים עמידים. מודל זה, בתהליך פיתוח התרופות, יש חשיבות רבה לקביעת גורלו של טיפולים חדשניים נגד סרטן רבים לפני למחקר קליני.

פיתוח ותחזוקה של גידול נגזר החולה פרה xenograft דגם לחקירת Novel טיפולים נגד סרטן

המטופל נגזר מבע (pdx) דגמים נוספים ביותר בסדר מלנומה מולקולרית תכונות ביולוגיות, הם ניבוי יותר של תגובת הטיפול לעומת רקמה פלסטית מסורתית התרבות מבוסס assays. כאן אנו מתארים את פרוטוקול ההפעלה הסטנדרטית שלנו להקמת דגמי PDX חדשים ואפיון/ניסויים של דגמי PDX קיימים.

מלנומה מטופלת-נגזר מודל Xenograft

שיטה מתוארת כדי ליצור אורגנואידים באמצעות קסנוגרפטים שמקורם בחולה (PDX) עבור הקרנת במבחנה, וכתוצאה מכך זוגות תואמים של מודלים in vivo / in vitro. גידולי PDX נקצרו/ עובדו לחתיכות קטנות באופן מכני או אנזימטי, ואחריו השיטה של החכמים לגדל אורגנואידים גידולים שהיו מעבר, cryopreserved ומאופיין נגד PDX המקורי.

יצירת זוגות מודלים תואמים של PDX ו-PDX לחקר פרמקולוגיה של סרטן

מאמר זה מתאר שיטות לדור, טיפול תרופתי וניתוח של explants נגזרים על ידי המטופל להערכת תגובות לתרופות גידול במערכת מודל חי, רלוונטי למטופל, פרה-קלינית.

גידול שמקורו במטופל explants כפלטפורמה פרה-אקלינית "חיה" לחיזוי עמידות לתרופות בחולים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע נוקאאוטים של גנים שהם in vivo קטלניים עובריים בגידולים שמקורם במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, ולאחר מכן מעריכים את ההשפעה שיש לנוקאאוט על צמיחת הגידול, התפשטותו, הישרדותו, הגירה, פלישה, והתעתיק in vitro ו- in vivo.

הגדרת תפקודי גנים בגידולים סרטניים על ידי אבלציה Ex vivo של אללים פלוקסים בתאי גידול מעטפת עצב היקפית ממאירה

פרוטוקול זה מתאר הערכה מתוקננת של רגישויות לתרופות למעכבי איתות ממוקדים במודלים אורגנויד שמקורם בחולה NSCLC.

רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-EGFR-Mutant NSCLC

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ולא כירורגית להשתלה אורתוטופית של קסנוגרפים שמקורם בחולה סרטן השד בעכברים. הטכניקה כוללת דיסוציאציה אנזימטית של הגידול ואחריה הזרקה ישירה לרפידות השומן של החלב, מה שמאפשר השתלה בתפוקה גבוהה. אימות מקיף מבטיח נאמנות למודל, ומאפשר מחקרים קפדניים על פני תת-סוגים שונים של סרטן השד.

דיסוציאציה בתפוקה גבוהה והשתלה אורתוטופית של קסנוגרפים שמקורם בסרטן השד

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה ISO15189 אוטומטית ומוסמכת של הדור הבא לאיתור שינויים גנומיים ממוקדים ברקמות משובצות פרפין קבועות בפורמלין של סרטן תאים לא קטנים (NSCLC).

זיהוי שינויים ממוקדים בסרטן ריאות של תאים לא קטנים באמצעות ריצוף מהדור הבא

למד אלגוריתם לבדיקת יעילות טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ריצוף גנום מלא ו-Xenografts ממטופלים. שיטה זו מאפשרת זיהוי שינויים גנומיים ואימות תרופות במודלים חיים.

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts

גלה סרטונים נוספים