מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

רצף mRNA של תא יחיד נמצא בשימוש נרחב כדי להבין את התהליכים הביולוגיים ברמת תא יחיד. הופעתן של אסטרטגיות multiplexing הרחיבה עוד יותר את ההגברות שלה על ידי מתן פרופיל של דגימות מרובות בניסוי אחד, הפחתת באופן דרמטי את העלות והימנעות אפקטי אצווה. הדגימה של ההליך תהיה וואי פנג, פוסט-דוק, ואנדרו פרזיינדה, טכנאי מהמעבדה שלי.

לאחר הספירה, לפצל את התאים מבודדים מיום עוברי 18.5 תאי לב לחמש פעמים 10 כדי aliquots החמישי ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS טרי לכל לשטוף. תוכלו להשתמש מחדש ב-180 מיקרוליטרים של PBS לדגימה ולהוסיף 20 מיקרוליטרים של תווי ברקוד עוגן לכל צינור עם ערבוב עדין. לאחר דגירה של חמש דקות על קרח, הוסיפו 20 מיקרוליטר של פתרון מלאי ברקוד משותף לכל צינור עם ערבוב עדין להדגירה נוספת של חמש דקות על קרח לפני שאתם שוטפים את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS קר בתוספת אלבומין סרום 1%bovine לכל שטיפה, ואז לסנן את הדגימות לצינורות חדשים באמצעות מסננת תאים אחת של 40 מיקרומטר לכל צינור.

לאחר הספירה, להרכיב שבב B לתוך מחזיק שבב, ולאחר מכן להוסיף 75 microliters של פתרון 50% גליצרול ל בארות שאינן שימוש בשורה אחת, 40 microliters ל בארות שאינן שימוש בשורה השנייה, ו 280 microliters ל בארות שאינן שימוש בשורה שלוש. שים לב כי שבב אימון משמש כאן כדי להדגים את ההליך. הוסיפו את הנפח המתאים של השעיית תאים ומים נטולי גרעין לתערובת האב עם צינורות עדינים.

הוסף 75 microliters של פתרון התא וכתוצאה מכך למרכז התחתון של המדגם גם בשורה אחת ללא בועות. Vortex גם גם חרוזים ג'ל במשך 30 שניות לפני הוספת לאט 40 microliters של חרוזים למרכז התחתון של חרוזים ג'ל גם בשורה השנייה ללא בועות. הוסף 280 microliters של חלוקת שמן במורד הצד של שמן החלוקה גם בשורה שלוש.

חבר את אטם לשבב מבלי ללחוץ על אטם ולשמור על אטם אופקית, כדי למנוע הרטבת אטם. טען את השבב שהורכב עם אטם בבקר הכרום והפעל את תוכנית הכרום יחיד תא B. שים לב כי המסך מראה אימון כרום עבור שבב האימון אבל עבור הניסויים האמיתיים המסך יציג כרום תא יחיד B.כאשר התוכנית הושלמה, מיד להסיר את השבב ולהשליך את אטם.

מקפלים את המכסה לאחור כדי לחשוף את בארות בזווית של 45 מעלות ולבדוק את רמות הנוזלים כדי לוודא שאין כפכפים נוכחים. לאט לאט שאף 100 microliters של חרוזים ג'ל אמולסיה מן הנקודות הנמוכות ביותר של ההתאוששות היטב ולבדוק את האחידות של חרוזים. לוותר על חרוזים אמולסיה במורד הקיר של צינור PCR חדש על קרח ולמקום את הצינור במחזור תרמי עבור שעתוק הפוך.

כדי להכין את cDNA להגברה, להוסיף 125 microliters של סוכן התאוששות לדגימה בטמפרטורת החדר. אין לראות נוזל אטום ולהימנע צינורות או מערבולת. המתן 60 שניות לפני הסרת לאט סוכן ההתאוששות מתחתית הצינור ולהוסיף 200 microliters של תערובת ניקוי חרוזים מערבולת לדגימה.

פיפטה את התערובת 10 פעמים לפני הדגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מניחים את הדגימות על מגנט במיקום גבוה. כאשר הפתרון מתנקה, להסיר את supernatant ולהוסיף 200 microliters של 80% אתנול גלולה.

לאחר 30 שניות, להסיר את האתנול ולחזור על לשטוף פעמיים נוספות. לאחר הכביסה האחרונה, לזמן קצר צנטריפוגה את המדגם מניחים את הצינור על המגנט במצב נמוך כדי לאפשר את המדגם לאוויר יבש במשך פחות משתי דקות. כאשר המדגם התייבש, להסיר את הצינור מן המגנט ולהוסיף 35.5 microliters של פתרון אלוטיון מוכן טרי.

לאחר דגירה של שתי דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את המדגם על המגנט בתדר הגבוה עד שהפתרון מתבהר לפני העברת 35 מיקרוליטרים של הדגימה לרצועת צינור חדשה. להגברת cDNA באמצעות אסטרטגיית הקידוד מבוססת השומנים, הוסיפו תערובת תגובת הגברה לדגימות CDNA של 35 מיקרוליטר עם ערבוב יסודי לפני צנטריפוגה קצרה. בסוף הספין, הדגירה את המדגם במחזור התרמי בעקבות הליך הגברה cDNA המתאים.

הוסף 120 מיקרוליטרים של רייגנט נבחר ו-100 מיקרוליטרים של מים אולטרה-חמים ל-100 מיקרוליטרים של דגימה ופיגט, 15 פעמים. לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את הדגימה על המגנט עד שהפתרון מתבהר. העבר את העל-טבעי לצינור איגוד נמוך של 1.5 מיליליטר לבניית ספריית cDNA מרובת-קידודים.

זכור לשמור הן את supernatants ואת הבסיס כמו התוכן של supernatant להרכיב cDNA ברקוד ואת cDNA אנדוגני תוכן הבסיס. נקה את cDNA אנדוגני עם 80%אתנול ולחמק ה-DNA עם 40 microliters של חיץ אלוטיון, ולאחר מכן להפעיל בדיקת בקרת איכות של cDNA אנדוגני לפני הכנת ספריית תעתיק אנדוגני. ריכוז cDNA צריך להיות מכמת ומוסמך לפני בניית הספרייה.

הספריות הבנויות, כולל ספריות cDNA וברקוד אנדוגני, צריך גם לכמת ולאשר לפני רצף. לאחר רצף, ניתן לנתח את ביטוי הברקוד בכל תא בודד. לדוגמה, בניתוח זה נצפו שמונה קבוצות של תאים בודדים שהתבטאו באופן ייחודי בסוג אחד של ברקוד המייצג תאים משמונה דגימות שונות.

בנוסף, תאים מסוימים לא הביעו ברקוד ולכן הוגדרו כתאים שליליים, בעוד שתאים אחרים ביטאו שני ברקודים שונים המייצגים כפילויות. באמצעות תאי סינגלט, ההטרוגניות התאית והתקנות המולקולריות ניתן להעריך על ידי ביאור סוג התא, זיהוי סוג תאים חדשני ונדיר, ניתוח השוואתי אזור אנטומי, וניתוח מסלול אונטולוגיה גנים, כגון הפרדות שלב מחזור התא. זה מועיל כדי דימוי גם גם את גם תותחי הג'ל באמולסיה אם אתה יכול, כמו תמונה תגיד לך אם ההליך הצליח עד לנקודה זו.

מולטי-שינג לדוגמה מוסיף גמישות רבה בתכנון הניסויים שלך. לאחר שצפית בהדגמה זו, אני מקווה שתהיה בטוח יותר להתחיל ניסויים משלך.