Name: ניתוח אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מלאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: למדו שיטה מהירה וחסכונית לניתוח אוכלוסיית הצד בתאים סרטניים מוצקים. השיטה מאפשרת בידוד וזיהוי של תאי גזע סרטניים ותורמת להבנת תכונות הגזעיות של תאי הגידול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין 81572599, 81773124 81972787; הקרן למדעי הטבע של העיר טיינג'ין (סין) 19JCYBJC27300; בית החולים העממי טיינג'ין & Nankai אוניברסיטת מחקר משותף מענק 2016rmnk005; קרנות מחקר בסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות, אוניברסיטת ננקאי 63191153.

1. הכנת תאים
<ol><li>עיכול ונטרול תאים<ol>
<li>זרע תאים סרטניים (כגון MDA-MB-231 תאים) בצלחת 6 באר, ותרבות אותם באינקובטור 37 °C (37 °F) מסופק עם 5% CO2.</li>
		<li>תאי קציר כאשר הצפיפות שלהם מגיעה לכ -90%. לשאוף את מדיום התרבות ביסודיות ולשטוף את התאים 2x עם 3 מ"ל של מלוחים אגירה פוספט (PBS). הערה: כדי לבחון את ההשפעות של מעכבי מסלול איתות (למשל, מעכב FRA1), או מפעילים (למשל, מפעיל STAT3) על תכונות גזע של תאים סרטניים, תאים סרטניים הם זרע בצלחת 6 גם pretreated עם מעכבים או מפעילים במשך כמות מסוימת של זמן לפני הקציר.</li>
		<li>מוסיפים 500 μL של 0.25% טריפסין-EDTA לכל באר של צלחת 6 גם, מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 דקות (דקה), בעדינות הקש על הצלחת כדי לנתק את התאים. הערה: עיכול ממושך ישפיע על פרופיל SP עקב שינויים בכדאיות התא.</li>
		<li>הוסף 3 מ"ל של PBS בתוספת 2% סרום שור עוברי (FBS) לכל באר של צלחת 6 גם כדי לסיים את העיכול בעדינות pipette התאים למעלה ולמטה 3-5x כדי לפזר את גושי התא.</li>
		<li>הוסף 0.5 מ"ל של השעיית תאים לבאר אחת של צלחת 6 באר חדשה ובדוק אותה תחת מיקרוסקופ. אם גושים התא נצפו, להעביר את המתלה התא דרך מסננת תא μM 70. הערה: זהו שלב אופציונלי.</li>
		<li>להעביר את התאים לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. תאי צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות לתאי גלולה. הסר את supernatant ולהשתיל אותם מחדש ב 3 מ"ל של PBS בתוספת 2% FBS. פיפטה התאים למעלה ולמטה 3-5x לערבב ביסודיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ספירת תאים<ol>
<li>הוסף 50 μL של השעיית התא לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ומערבבים אותו עם 50 μL פתרון כחול trypan. פיפטה 10 μL של התערובת לספור את מספר התאים החיים בשיטה סטנדרטית, כגון hemocytometer.</li>
		<li>לדלל את התאים PBS בתוספת 2% FBS לריכוז הסופי של 1 x 106 תאים / מ"ל. הוסף 1 מ"ל של השעיית התא למבחנה 5 מ"ל פוליסטירן עגול התחתון ולהכין שתי צינורות מדגם.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. כתמי תאים עם הוכסט 33342
<ol><li>הוסף Hoechst 33342 לצינור אחד כדי להגיע לריכוז הסופי המתאים. הערה: לדוגמה, הריכוז המתאים של Hoechst 33342 הוא 3 מיקרוגרם / מ"ל עבור תאי MDA-MB-231.</li>
	<li>הוסף חוסם (למשל, Fumitremorgin C, Verapamil, או Reserpine) לצינור אחר לריכוז הסופי המתאים דגירה הצינור ב 37 °C (70 °F) במשך 30 דקות לפני הוספת אותו ריכוז של Hoechst 33342 כמתואר בשלב 2.1. הערה: עבור תאי MDA-MB-231, החוסם המתאים הוא Reserpine (40 מיקרומטר). Reserpine משמש כפקד חסימה כדי לאמת את היעדר התאים באזור SP מגודר.</li>
	<li>הכינו מספר צינורות המכילים תאים והוסיפו את Hoechst 33342 למדרגי ריכוז שונים. לאחר מבחני זרימה cytometry, לבחור את הריכוז הנכון על פי הפרופיל ואת הפרופורציה של SP. הערה: זהו שלב אופציונלי המשמש להגדרת הריכוז הנכון של Hoechst 33342.</li>
	<li>להכין כמה צינורות המכילים תאים, להוסיף את החוסם שיפוע ריכוז שונים, דגירה הצינורות ב 37 °C (60 °F) במשך 30 דקות, ולאחר מכן להוסיף Hoechst 33342 לריכוז המתאים. לאחר מבחני cytometry זרימה, לבחור את הריכוז הנכון על פי היעדר תאים באזור SP מגודר. הערה: זהו שלב אופציונלי המשמש להגדרת הריכוז הנכון של חוסם.</li>
	<li>מניחים את הצינורות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ומדגרים אותם במשך 60 דקות, מנערים את הצינורות כל 10 דקות. הערה: טלטול צינורות ביסודיות חשוב להכתמת, כי זה מבטיח מגע מלא בין התאים ואת הצבע לקבלת תוצאות מכתימות טובות יותר.</li>
	<li>לאחר הדגירה, צנטריפוגה התאים ב 200 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, ולשאוף את supernatant בזהירות, כי התאים יוצרים כדורי רופף מאוד ולא יציב.</li>
	<li>Resuspend תאים של כל צינור ב 1 מ"ל של PBS קר כקרח בתוספת 2% FBS ופיפט התאים למעלה ולמטה 3-5x לערבב ביסודיות. הוסף 1 μL של 1 מ"ג / מ"ל propidium יודיד (PI) להשעיה של כל צינור לזהות תאים מתים. הערה: כל ההליכים בשלב זה צריך להתבצע ב 4 מעלות צלזיוס כדי לעכב את הקולח של Hoechst 33342 מתאי הגידול. יש להגן על הצינורות מפני חשיפה ישירה לאור.</li>
</ol>3. ניתוח לפי ציטומטריית זרימה
הערה: הוראות לשימוש בתוכנת ציטומטר זרימה (ראה טבלת חומרים)מתוארות בסעיף זה ובמספרים משלימים 1-10.
<ol><li>בתוכנת ציטומטר זרימה, לחץ על לחצן תיקיה. לחץ על לחצן התנסה ולאחר מכן לחץ על ניסוי חדש (איור משלים 1A,B).</li>
	<li>לחץ על לחצן אישור. "Experiment_001" יופיע תחת התיקיה (איור משלים 2A,B).</li>
	<li>לחץ על לחצן Experiment_001 כדי לשנות את שם התיקיה לשם מסוים (למשל, "20191118-SP"). לחץ על הזן. השם החדש ("20191118-SP") יופיע תחת FOLDER (איור משלים 3A,B).</li>
	<li>לחץ על לחצן דגימה חדשה כדי להוסיף דגימה לתיקיית הניסוי החדשה ("20191118-SP"). לחץ על לחצן צינור חדש כדי להוסיף צינור לדגימה. לחץ על לחצן ראש חץ (איור משלים 4A-C).</li>
	<li>לחצו על הלחצן Parameters והגדירו את הפרמטרים של ציטומטר הזרימה (איור משלים 5).<ol>
<li>השתמש במראה 610 ננומטר דיכרית מעבר קצר (DMSP) כדי להפריד את אורכי הגל פליטה. השתמש במסנן BP של 450/20 ננומטר כדי לאסוף את הפלואורסצנטיות הכחולה ו- EFLP של 675 ננומטר כדי לאסוף את הפלואורסצנטיות האדומה. הערה: Hoechst 33342 מתרגש עם לייזר UV ב 355 ננומטר PI הוא נרגש ב 488 ננומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>הפעל את דגימות התא על סייטומטר הזרימה. הערה: ניתן למיין תאי SP לפי מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) בתנאים סטריליים. בסך הכל יש לאסוף 100,000–500,000 תאים לניסויי המעקב.<ol><li>הפעל תאים מוכתמים עם Hoechst 33342 על ציטומטר זרימה.<ol>
<li>מניחים צינורות המכילים תאים מוכתמים Hoechst 33342 על cytometer.</li>
			<li>לחץ על לחצן התוויית נקודה כדי להציג את התוויית הנקודות ולאחר מכן לחץ על ציר ה- X והגדר אותו כ "FSC-A"; לחץ על ציר Y והגדר אותו כ "PI-A". הצג את התוויית הנקודה של אזור פולס פיזור קדימה (FSC-A, ציר X המוגדר למצב ליניארי) לעומת פלואורסצנטיות ה- PI (ציר Y מוגדר לקנה מידה לוגריתמי). כוונן את המתחים כדי להראות את התאים החיים בצד ימין ואת התאים שאינם חיים, אשר מוכתמים בבהירות עם PI, בפינה השמאלית העליונה. לאחר מכן, הקם שער מצולע כדי לא לכלול תאים מתים ופסולת תאים (איור 1A) על-ידי לחיצה על לחצן שער המצולע כדי לגייט את קבוצת המשנה P1, הידועה גם בשם FSC-A, קבוצת משנה PI-A (איור משלים 6A,B).</li>
			<li>לחץ על לחצן התוויית נקודה כדי להציג את התוויית הנקודות, לחץ על ציר ה- X והגדר אותו כ "FSC-A"; לחץ על ציר Y והגדר אותו כ "FSC-W". הצג את התוויית הנקודות של FSC-A (ציר X) לעומת רוחב פולס פיזור קדימה (FSC-W, ציר Y). לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התוויית הנקודה, לחץ על לחצן P1 תחת לחצן הצג אוכלוסיות. לחץ על לחצן שער מלבני כדי ליצור שער מלבני כדי לשער את קבוצת המשנה P2 (הידועה גם בשם FSC-A, קבוצת משנה FSC-W). פעולה זו לא תכלול תאים עם כמויות גדולות (איורים משלימים 7A-C ואיור 1A).</li>
			<li>לחץ על לחצן התוויית נקודה כדי להציג את התוויית הנקודות, לחץ על ציר ה- X והגדר אותו כ "SSC-A"; לחץ על ציר Y והגדר אותו כ "SSC-W". הצג את התוויית הנקודה של אזור פולס פיזור צדדי (SSC-A, ציר X) לעומת רוחב פולס פיזור צדדי (SSC-W, ציר Y). לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התוויית הנקודות ולחץ על לחצן P2 תחת לחצן הצג אוכלוסיות. לאחר מכן לחצו על הלחצן 'שער מלבני' ליצירת שער מלבני כדי לשוער קבוצת המשנה P3 (הידועה גם בשם SSC-A, קבוצת משנה SSC-W). כך תשיג אוכלוסיית תאים עם צפיפות אחידה (איור משלים 8A-C ואיור 1A).</li>
			<li>לחץ על לחצן התוויית נקודה כדי להציג את התוויית הנקודות, לחץ על ציר ה- X והגדר אותו כ "Hoechst Red-A"; לחץ על ציר Y והגדר אותו כ "הוכסט כחול-A". הצג את התוויית הנקודות של הוכסט אדום-A (ציר X) לעומת הוכסט כחול-A (ציר Y). לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התוויית הנקודה, לחץ על לחצן P3 תחת לחצן הצג אוכלוסיות. לחץ על לחצן שער מצולע כדי ליצור שער מצולע כדי לשער את קבוצת המשנה P4 (הידועה גם בשם Hoechst Red-A, קבוצת המשנה Hoechst Blue-A). לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התוויית הנקודות, לחץ על לחצן הצג הירארכיית אוכלוסין כדי להציג את הירארכיית האוכלוסין. הערה: תרשים הנקודות יציג שלוש אוכלוסיות שונות: 1) אוכלוסיית פאזה G0-G1 ליד מרכז הגרף; 2) אוכלוסיית שלב S-G2/M ליד הפינה הימנית העליונה; 3) SP. לאחר מכן SP מגודר לניתוח נוסף (איור משלים 9A-D ואיור 1A). אם עלילת הנקודות של Hoechst Red-A לעומת Hoechst Blue-A אינה מציגה פרופיל SP דומה לזה המוצג באיור 1A, יש להתאים את המתחים עד להצגה של פרופיל דומה. בינתיים, להתאים את כל השערים לעיל בהתאם.</li>
			<li>לאחר קביעת אזור השער של תאי SP, לחץ על השגת נתונים כדי לאסוף 20,000–100,000 אירועים מכל מדגם כדי לנתח את אחוז תאי SP(איור משלים 10).</li>
		</ol></li>
		<li>הפעל את Hoechst 33342-תאים מוכתמים שטופלו עם חוסם על ציטומטר הזרימה.<ol>
<li>מניחים צינורות המכילים חוסם על הסייטומטר ולהפעיל תאים באמצעות אותם מתחים ושערים כדי לבדוק עוד יותר אם המתחים והשערים נבחרים כראוי. הערה: בהשוואה להוצ'סט 33342 המכתים לבדם, רק חלק קטן מאוד מהתאים, אם בכלל, אמורים להופיע באזור המגודר של SP (איור 1B).</li>
			<li>אסוף 20,000–100,000 אירועים מכל מדגם כדי לנתח את אחוז תאי SP.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוח נתונים
הערה: הוראות לשימוש בתוכנת ניתוח cytometry זרימה (ראה טבלה של חומרים)מתוארים בסעיף זה ומספרים משלימים 11–16.
<ol><li>העתק את הקבצים בתבנית fcs למחשב, פתח את תוכנת ניתוח cytometry זרימה וגרור קובץ לדוגמה אחד לתוכנה (איור משלים 11A,B).
</li>
	<li>גייט תאים והשג את אחוז תאי SP.<ol>
<li>לחץ פעמיים על קובץ לדוגמהזה , לחץ על ציר ה- X והגדר אותו כ "FSC-A"; לחץ על ציר Y והגדר אותו כ "PI-A". לאחר מכן, צרו שער מצולע ולחצו על הלחצן 'אשר' כדי להשיג את קבוצת המשנה FSC-A, PI-A (איור משלים 12A-E).</li>
		<li>לחץ פעמיים על קובץ FSC-A, קובץ קבוצת משנה PI-A, לחץ על ציר ה- X והגדר אותו כ "FSC-A"; לחץ על ציר Y והגדר אותו כ "FSC-W". לאחר מכן, צרו שער מלבני ולחצו על הלחצן 'אשר' כדי להשיג את קבוצת המשנה FSC-A, FSC-W (איור משלים 13A-E).</li>
		<li>לחץ פעמיים על קובץ קבוצת המשנה FSC-A, FSC-W, לחץ על ציר ה- X והגדר אותו כ "SSC-A"; לחץ על ציר Y והגדר אותו כ "SSC-W". לאחר מכן, צרו שער מלבני ולחצו על הלחצן 'אשר' כדי להשיג את קבוצת המשנה SSC-A, SSC-W (איור משלים 14A-E).</li>
		<li>לחץ פעמיים על קובץ ערכת המשנה SSC-A, SSC-W, לחץ על ציר ה- X והגדר אותו כ "Hoechst Red-A"; לחץ על ציר Y והגדר אותו כ "הוכסט כחול-A". לאחר מכן, צרו שער מצולע ולחצו על הלחצן 'אישור' כדי להשיג את קבוצת המשנה Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A (איור משלים 15A-E).</li>
		<li>פתח את עורך הפריסה על-ידי לחיצה על לחצן פתח עורך פריסה. גרור את קובץ ערכת המשנה SSC-A, SSC-W לעורך הפריסה ולאחר מכן לחץ על לחצן לחץ כדי לשמור את חלון הפריסה בקובץ כדי לשמור את תוצאות התמונה (איור משלים 16A-C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>שמור את סביבת העבודה כדי לשמור את מידע הג'ינג בעת סגירת התוכנה.</li>
	<li>בצע ניתוחי t-test עם תוכנת ניתוח סטטיסטי כדי להשוות את ההבדל בין שתי קבוצות. ערך של P < 0.05 הוגדר כמשמעותי סטטיסטית.</li>
</ol>

<ol><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li>
<li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li>
<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2FCD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li>
<li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li>
<li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B+CD24%28-%29+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor%2Fstem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+CD90%2B+cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li>
<li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology%3A+can+we+translate+into+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncolcology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16(2015).</li>
<li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+%28SP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18(2005).</li>
<li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells%3A+Beyond+Chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362(2017).</li>
<li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li>
<li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2%2FBCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li>
<li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp%2C+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li>
<li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+side+order+of+stem+cells%3A+the+SP+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li>
<li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li>
<li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+is+enriched+in+tumorigenic%2C+stem-like+cancer+cells%2C+whereas+ABCG2%2B+and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li>
<li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK2%2FSTAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44%28%2B%29CD24%28-%29+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li>
<li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Lead+to+Drug+Candidate%3A+Optimization+of+3-%28Phenylethynyl%29-1H-pyrazolo%5B3%2C4-d%5Dpyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicnal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li>
<li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li>
<li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+%28SP%29+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li>
<li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+the+side+population+%28SP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23(2013).</li>
<li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li>
<li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li>
<li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624(2019).</li>
<li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li>
<li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li>
<li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+%3A+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li>
<li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity%3A+A+Quantitative%2C+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188(2016).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li>
<li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li>
<li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li>
<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%22side+population%22+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
<li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+minor+groove-binding+ligands%3A+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

קיימות מספר נקודות מפתח שיש לזכור עבור ה- SP assay. הראשון הוא הבחירה של חוסם מתאים, כגון Verapamil או Reserpine, עבור כל קו תא, מכיוון שמיקום "השער" של תאי SP נקבע בהתאם למיקום שבו מספר גדול של תאי SP נעלמים לאחר הוספת החוסם. עבור קו התא MDA-MB-231, Reserpine עובד היטב. עם זאת, עבור קווי תאים אחרים, חוסמים שונים עשויים לפעול טוב יותר.
השני הוא הריכוז של הוצ'סט 33342. אחוז תאי SP גדל ככל שריכוז הכתמים של Hoechst 33342 ירד, כפי שהראו הנתונים הייצוגיים. תופעה זו יכולה להיות מוסברת על ידי קינטיקה...

תאי גזע סרטניים (CSCs) הם תת-קבוצות של תאים עם יכולת התחדשות עצמית ופוטנציאל בידול מרובה, אשר ממלאים תפקיד חיוני בצמיחת הגידול, גרורות והישנות1,2. נכון לעכשיו, CSCs זוהו להתקיים במגוון רחב של גידולים ממאירים, כולל ריאות, מוח, לבלב, הערמונית, השד, וסרטן הכבד3,4,5,6,7,8,9. זיהוי של CSCs בגידולים אלה מבוסס בעיקר על נוכחות של חלבוני סמן פני השטח, כגון ביטוי גבוה ו / או נמוך של CD44, CD24, CD133, ו Sca-19,10, אבל סמן ייחודי שיכול להבחין בין CSCs שאינם CSCs לא דווח עד כה. כיום, מספר טכניקות משמשות כדי לזהות ולטהר CSCs ברקמת הגידול או קווי תאים סרטניים. טכניקות אלה מתוכננות בהתבסס על המאפיינים הספציפיים של CSCs. ביניהם, מבחנים ומיון של תאי אוכלוסיית צד (SP) הם שתיים מהשיטות הנפוצות.
תאי SP התגלו במקור על ידי גודל ואח'11, כאשר הם אפיינו תאי גזע hematopoietic בתאי מח עצם העכבר. כאשר תאי מח העצם של העכבר סומנו עם צבע פלואורסצנטי Hoechst 33342, קבוצה קטנה של תאים מוכתמים באפלולית Hoechst 33342 הופיעו בעלילת נקודה דו מימדית של מבחני ציטומטריה זרימה. Hoechst 33342 הוא צבע מחייב DNA ויש לו לפחות שני מצבי קשירה שמובילים למאפיינים ספקטרליים שונים. בעת צפייה פליטת פלואורסצנטיות בשני אורכי גל בו זמנית, אוכלוסיות מרובות ניתן לחשוף12. במהלך ההסתערות שלהם, Hoechst 33342 היה נרגש ב 350 ננומטר ואת הפלואורסצנטי נמדד באמצעות מסנן פס 450/20 ננומטר (BP) ו 675 ננומטר קצה מסנן ארוך לעבור (EFLP)11. בהשוואה לאוכלוסייה שלמה של תאי מח עצם, קבוצה זו של תאים הועשרה בתאי גזע hematopoietic בשם תאי SP11. תאי SP מסוגלים לגרש במהירות את Hoechst 33342. הקולח של צבע זה קשור לקלטת מחייבת ATP (ABC) טרנספורטרים13, אשר יכול להיות מעוכב על ידי סוכנים מסוימים כגון Fumitremorgin C14, Verapamil ו Reserpine15,16. לאחר מכן, פרופורציות שונות של תאי SP זוהו במגוון רקמות, איברים, רקמות גידול, וקווי תאים סרטניים17,18,19. לתאי SP אלה מאפיינים רבים של תאי גזע17,19.
כתב יד זה מתאר Hoechst 33342 תיוג וכתמים של תאים סרטניים מתורבתים וניתוח של תאי SP על ידי cytometry זרימה. יתר על כן, אופטימיזציה של ריכוז Hoechst 33342 ואת הבחירה חוסם הנכון עבור קו תא גידול ספציפי באמצעות גישה זו מוצגים. לבסוף, ההשפעות של קידום stemness או אותות עיכוב על חלקם של SP בתאי הגידול מודגמים. הדוגמאות הניסיוניות מראות שניתוח של SP יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של אותות שונים, כגון ביטוי גנים, מעכבים קטנים, מפעילים, ציטוקינים וכימוקינים, על גזע הגידול. בהשוואה לשיטות אחרות לבידוד וטיהור של CSCs, כגון מיון של CD44+/CD24– אוכלוסייה, ניתוח אלדהיד דהידרוגנאז (ALDH) ומבחני היווצרות כדור הגידול, שיטה זו קלה יותר למניפולציה והיא חסכונית.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית תאים 6 באר</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td>9.5 ס"מ2 (בערך)</td></tr><tr><td>Colivelin</td><td>MCE</td><td>HY-P1061A</td><td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>תעשיות ביולוגיות (BIOIND)</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD LSRתוכנת</td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSתוכנת</td></tr><tr><td>ניתוח ציטומטריית זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FlowJo</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>bisBenzimide H 33342</td></tr><tr><td>מבחנה תחתונה עגולה</td><td>פוליסטירן CORNING</td><td></td><td>352054 12 x 75 מ"מ, 5 מ"ל</td></tr><tr><td>פרופידיום יודיד (PI)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4170</td><td>3,8-דיאמינו-5-[3-(דיאתילמתילאמוניו)פרופיל]-6-פנילפננתרידיניום דיודיד</td></tr><tr><td>רסרפין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>83580</td><td>(3&בטא;, 16&בטא;, 17&אלפא;, 18&בטא;, 20&אלפא;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-חומצה קרבוקסילית מתיל אסטר</td></tr><tr><td>SKLB816</td><td>מסופק על ידי ד"ר שנגיונג יאנג, אוניברסיטת</td><td></td><td></td>סצ'ואן</tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]
-2-(3,4-דימתוקסיפניל)-2-איזופרופילואלרוניטריל הידרוכלוריד</td></tr></tbody></table>

ניתוח אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מלאים

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

תאי גזע סרטניים (CSCs) הם גורם חשוב לצמיחה הגידול, גרורות, הישנות. בידוד וזיהוי של CSCs הם בעלי משמעות רבה למחקר הגידול. כיום, מספר טכניקות משמשות לזיהוי וטיהור של CSCs מרקמות הגידול וקווי תאים סרטניים. הפרדה וניתוח של תאי אוכלוסיית צד (SP) הם שתיים מהשיטות הנפוצות. השיטות מסתמכות על היכולת של CSCs לגרש במהירות צבעים פלואורסצנטיים, כגון Hoechst 33342. הקולח של הצבע מזוהה עם משגרים ATP מחייב (ABC) והוא יכול להיות מעוכב על ידי מעכבי טרנספורטר ABC. שיטות להכתמת תאים סרטניים בתרבית עם Hoechst 33342 וניתוח חלקם של תאי SP שלהם על ידי cytometry זרימה מתוארים. הבדיקה הזו נוחה, מהירה וחסכונית. נתונים הנוצרים במהלך מבחנים אלה יכולים לתרום להבנה טובה יותר של השפעתם של גנים או אותות חוץ-תאיים ותאיים אחרים על תכונות הגבעול של תאים סרטניים.

ארבעה ניתוחי SP ניסיוניים בוצעו על פי שיטה זו. בראשון, זיהינו את חלקם של תאי SP במד"א-MB-231, שהוא קו תאים שלילי משולש של סרטן השד האנושי, בתנאים רגילים. לאחר ספירת תאים, Hoechst 33342 נוסף לתוך צינור אחד המכיל 1 x 106 תאים לריכוז הסופי של 3 מיקרוגרם / מ"ל. Reserpine ו Hoechst 33342 נוספו צינור אחר לריכוזים הסופיים של 40 מיקרומטר ו 3 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה. PI נוסף לשני הצינורות. התוויית הנקודות של FSC-A (ציר X) לעומת PI-A (ציר Y) הראתה שלוש אוכלוסיות: 1) אוכלוסיית תאים חיובית ל- PI, שייצגה את התאים המתים; 2) ...

מוצגת שיטה נוחה, מהירה וחסכונית למדידת חלקם של תאי אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מוצקים.

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

ניתוח של תאי אוכלוסייה בצד היא אחת השיטות הנפוצות לבודד ולזהות תאי גזע סרטניים מרקמות הגידול וקווי תאים סרטניים. הבדיקה הזו נוחה, מהירה וחסכונית. שיטה זו יכולה לתרום להבנה טובה יותר של ההשפעה של גנים או אותות חוץ תאיים אחרים על תכונות גזע של תאים סרטניים.גורמים רבים יכולים להשפיע על אחוז תאי SP בניתוח זה, ולכן חיוני לחקור את התנאים המתאימים לפני הניסוי הפורמלי. זרע תאים סרטניים בצלחת שש בארות, ולהדגיר אותם באינקובטור 37 מעלות צלזיוס מסופק עם 5% פחמן דו חמצני. כאשר צפיפות התא מגיעה כ 90%לשאוף את מדיום התרבות, ולשטוף את התאים פעמיים עם שלושה מיליליטר של PBS.לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של 0.25%trypsin-EDTA לכל באר, ולהדגיר את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך דקה עד שלוש דקות. הקש בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים, הוסף שלושה מיליליטרים של PBS בתוספת 2%FBS לכל באר, ופיפט התאים למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים כדי לפזר את גושי התא. בחן את השעיית התא מתחת למיקרוסקופ.אם גושי תאים קיימים, להעביר את ההשעיה דרך מסננת 70 מיקרומטר. להעביר את התאים לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, וצנטריפוגה אותם ב 200 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את supernatant, ו resuspend התאים בשלושה מיליליטר של PBS בתוספת 2%FBS, pipeting התאים למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים כדי לערבב.לספור תאים מתחת למיקרוסקופ באמצעות hemocytometer, לדלל אותם PBS בתוספת 2%FPS לריכוז הסופי של פעם אחת 10 לשישה תאים למיליליטר. הכינו שני מבחנות של חמישה מיליליטר, פוליסטירן, תחתית עגולה, והוסיפו מיליליטר אחד של השעיית התא לכל צינור. סמן צינור אחד כמבחנה והשני כמצינור בקרה חוסם.הכן פתרון של חוסם על ידי דילול אותו לריכוז המתאים. מוסיפים אותו לצינור הבקרה חוסם ומערבבים היטב, ולאחר מכן דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לנער את הצינור כל 10 דקות.הכן פתרון של Hoechst 33342 על ידי דילול אותו לריכוז המתאים. מוסיפים אותו למבחנה ולשיטת החוסם בנפרד ומערבבים היטב, ואז דגירה את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. לנער את הצינורות כל 10 דקות.לאחר הדגירה, צנטריפוגה התאים במשך חמש דקות ב 200 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס, ואז בזהירות לשאוף את supernatant. לשים מחדש את התאים בכל צינור עם מיליליטר אחד של PBS קר כקרח בתוספת 2%FBS, ואז פיפטה התאים למעלה ולמטה לערבב. הוסף מיקרוליטר אחד של מיליגרם למיליליטר פרופידיום יודיד, או PI, לכל צינור ומערבבים.לחץ על הכרטיסיה פרמטרים בתוכנת סיטרומטר זרימה. ראשית, בחר את הפרמטרים של FSC, SSC, Hoechst כחול, Hoechst אדום, ו PI, בהתאמה. שנית, בחר בסולם הלוגריתמי עבור הפרמטר PI.לבסוף, בחר סרגלי שטח ורוחב עבור הפרמטרים FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red ו- PI, בהתאמה. הפעל את התאים מהמבחנה תחילה, ולאחר מכן להפעיל את התאים מצינור הבקרה חוסם באמצעות מתחים ושערים זהים. אסוף 20 עד 100,000 אירועים מכל מדגם כדי לנתח את אחוז תאי SP.שיטה זו שימשה לגילוי חלקם היחסי של תאי SP בקו התאים של סרטן השד האנושי MDA-MB-231. העלילה נקודה של FSC-A לעומת PI-A הראה אוכלוסייה של תאים מתים, פסולת תאים, ואת האוכלוסייה העיקרית של תאים שליליים PI, אשר היה נתון לניתוח נוסף. אוכלוסיית תאים בודדים מגודרת מהתווית הנקודות של FSC-A לעומת FSC-W ותווית הנקודות של SSC-A לעומת SSC-W שימשה לניתוח היחס של תאי SP, שהיה כ- 0.9% בתאים לא מטופלים וכ- 0.09% בתאים שטופלו ב- reserpine.ריכוזי כתמים שונים של Hoechst 33342 נבדקו על תאי מד"א-MB-435, ונקבע כי שני מיקרוגרם למיליליטר היו אופטימליים לניתוח SP. ריכוזים נמוכים הקשו על ההבחנה בין תאי SP לבין אוכלוסיות אחרות, בעוד שריכוזים גבוהים גרמו לתאי SP להיעלם. Verapamil ו reserpine נבדקו כדי לקבוע את החוסם הנכון עבור תאים MDA-MB-435.כ -0.4% מהתאים גירשו את הצבע לאחר טיפול verapamil, אבל היחס ירד לכ 0.1% לאחר טיפול reserpine, הוכחת כי reserpine הוא חוסם מתאים יותר עבור קו התא הזה. פרוטוקול זה שימש גם כדי לקבוע את חלקם של תאי SP בתאי אדנוקרצינומה ריאות אנושי A549 שטופלו קוליבלין מפעיל STAT3 ובתאי סרטן השד האנושי T47D שטופלו במעכב FRA1 SKLB816. בדיקה זו מספקת רמזים להשפעה הרגולטורית של איתות מסלולים על התכונות של תאי גזע סרטניים ומאפשרת גילוי של מנגנונים חדשים, אשר בסופו של דבר יכול להנחות את הטיפול הממוקד של גידולים.

analysis-of-side-population-in-solid-tumor-cell-lines

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

הפרוטוקול הבא מתאר שיטה לבידוד אוכלוסיית הצד של תאי T Acute Lymphoblastic Leukemia (T-ALL), המורכבת מתאי גזע, מדגי זברה בוגרים. אוכלוסיית הצד חסרה סמני תאים בולטים ולכן אנו משתמשים בבדיקת צבע אפלוקס Hoechst 33342 כדי לבודד אותם.

בדיקת אוכלוסיית צד: שיטה לבידוד אוכלוסיית צד של תאי גידול מדגי זברה

בסרטון זה, אנו מתארים את הבידוד של תת-אוכלוסייה של תאים דמויי גזע סרטניים משורות תאי קרצינומה קשקשיים בראש ובצוואר באמצעות ממיין תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות או FACS. אוכלוסיית הצד המבודדת של תאים יכולה לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם.

Cancer Side Population Discrimination Assay: שיטה לבידוד תאים סרטניים דמויי גזע באמצעות Hoechst Dye Efflux Assay

ניתוחים מעמיקים של פרוטאומים של תאים סרטניים מקלים על זיהוי מטרות תרופות חדשות וסמנים ביולוגיים אבחוניים. אנו מתארים זרימת עבודה ניסויית לניתוח כמותי של פרוטאומים (פוספו-) בתת-אוכלוסיות של תאים סרטניים שמקורם בגידולים נוזליים ומוצקים. זה מושג על ידי שילוב של אסטרטגיות העשרה תאיות עם ספקטרומטריית מסה כמותית מבוססת Super-SILAC.

Mass כמותי spectrometric פרופיל של Proteomes סרטן התאים נגזרים מנוזלים וגידולים מוצקים

הבנת תפקידם של תאים דמויי גזע סרטניים בהישנות גידול ועמידות לטיפולים הפכה לנושא בעל עניין רב בעשור האחרון. מאמר זה מתאר את הבידוד והאפיון של תת-אוכלוסייה של תאים דמויי גזע סרטניים מקווי תאי קרצינומה קשקשית בראש ובצוואר (HNSCC).

בידוד ואפיון של ראש וצוואר קשקש Cell Carcinoma-אוכלוסיית מאפייני תאי גזע לאחר

שיטות המאפשרות אפיון ובידוד של אוכלוסיות תאי גזע מדגימות ביולוגיות הן קריטיות לקידום טיפולים מוכווני תאי גזע בסרטן ומעבר לו. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גזע סרטניים באמצעות פנוטיפ האוכלוסייה בצד מופעלות בצד.

רתימת DNA- מופעלות בצד האוכלוסייה פנוטיפ לזהות ולטהר תאי גזע סרטניים מ דוגמאות ביולוגיות

כאן, אנו מתארים טכניקה לבודד את האוכלוסייה תאים בצד מ מודל דג הזברה של myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL). זה assay האוכלוסייה בצד רגיש מאוד מתואר דג הזברה T-ALL, אבל זה עשוי להיות ישים סוגים אחרים של תאים ממאירים ולא ממאיר דג הזברה.

בידוד של האוכלוסייה בצד Myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה דג הזברה

פיתחנו פרוטוקול חדש לחקר הדינמיקה האוכלוסייה הטרוקלולרית בתגובה הפרעות. כתב יד זה מתאר פלטפורמה מבוססת הדמיה המייצרת מערכי נתונים כמותיים לאפיון סימולטני של פנוטיפים סלולריים מרובים של אוכלוסיות הטרוסלריות בצורה חזקה.

אפליה ואפיון אוכלוסיות הטרוסקלריות באמצעות טכניקות הדמיה כמותית

כאן אנו מתארים שיטה כדי להפריד ולהעשיר את מרכיבי microenvironment המערכת החיסונית והחיסון של הגידול גידולים הוקמה תת עורית. טכניקה זו מאפשרת ניתוח נפרד של הגידול לחדור המערכת החיסונית ושברים -החיסון הגידול אשר יכולים להרשות אפיון מקיף של microenvironment מערכת החיסון הגידול.

העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

האפיון של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) הוא נושא פופולרי במחקר טרנסלtional. פרוטוקול זה מתאר את הטיפול באופן אוטומטי למחצה החיסונית (IF) לאפיון PD-L1 וספירה של CTCs בסרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC) מטופלים דגימות.

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

כאן, אנו מראים כי לייזרים בהספק גבוה של 375 ננומטר ו- 405 ננומטר יכולים לעורר ביעילות את Hoechst 33342 ולשמש חלופה בת קיימא ללייזר 355 ננומטר לזיהוי תאי אוכלוסיית צד (SP), ובכך להרחיב את טווח הלייזרים הזמינים ביישומי ציטומטריית זרימה.

זיהוי יעיל של תאי אוכלוסיית צד Hoechst על ידי ציטומטריית זרימה

למדו שיטה מהירה וחסכונית לניתוח אוכלוסיית הצד בתאים סרטניים מוצקים. השיטה מאפשרת בידוד וזיהוי של תאי גזע סרטניים ותורמת להבנת תכונות הגזעיות של תאי הגידול.

ניתוח אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מלאים

גלה סרטונים נוספים