Name: Vivo לשעבר היפוקמאלקפיאל Arteriole הכנה למחקר פונקציונלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: למדו הכנת עורקים ונימים מהיפוקמפוס עכברים לחקר אקס ויוו. שיטה זו מאפשרת ניתוח תפקודי כלי דם במודל מבודד ללא הפרעות מרקמות מקיפות במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לז מורין על הערות תובנה על כתב היד. מחקר זה מומן על ידי פרסים מ CADASIL יחד יש לנו תקווה ללא מטרות רווח, המרכז לבריאות נשים ומחקר, ו NHLBI R01HL136636 (FD).

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת קולורדו, הקמפוס הרפואי אנוץ ובוצעו בהתאם להנחיות מטעם המכון הלאומי לבריאות.
1. פתרונות
<ol><li>השתמש המלח מאגור באגירה לניתוח ולשמור דגימות ב 4 ° c לפני ניצול שלהם. . אל תדלק את הפתרון להכין מלוחים מאגור באגירה עם הרכב בעקבות: 135 מ"מ, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ KH2PO4, 1 מ"מ mgso4, 2.5 mM cacl2, 5 מ"מ גלוקוז, 3 מ"מ מגבים, 0.02 mm edta, 2 מ"מ פירובט, 10 מ"ג/mL סרום של הפרה, pH 7.3 ב 4 ° c.</li>
	<li>השתמש בנוזל שדרתי מלאכותי (aCSF) כפתרון אמבטיה ותמיסת פיפטה. גז הן aCSF ו-Ca2 +-חינם acsf עם 5% CO2, 20% O2, ו N2 איזון. להכין את הפתרון עם ההרכב הבא: 125 mM הנאקל, 3 מ"מ KCl, 26 mM נחקו3, 1.25 mm נה2PO4, 1 מ"מ mgcl2, 4 מ"מ גלוקוז, 2 מ"מ cacl2, pH 7.3 (עם האנטנה 5% CO2, 20% O2, ו N2 איזון).</li>
	<li>השג את התארכות המקסימלי ב-Ca בו2 +-חינם acsf (0 מ"מ [Ca2 +]o, 5 מ"מ egta).</li>
</ol>2. הכנה לעוגב
<ol><li>הוספת נימים זכוכית בורוסיליקט (בקוטר מחוץ = 1.2 מ"מ; בתוך קוטר = 0.69 מ"מ; אורך = 10 ס מ) לתוך פולר זכוכית. משוך את הנימים כדי לעשות טיפ ארוך, דק בקצה אחד.</li>
	<li>לצד אחד של החדר, הוסף צינורית שיכולה להתחבר למשאבת פריסטלטית מוקטנת כדי להזרים את הכלי ללחץ. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, שבור את קצה הצינורית כך שהוא קטן מספיק כדי להתאים את כלי העניין, אך גדול מספיק כדי לאפשר לפתרונות לזרום דרך הקצה. ודא שהקצה הוא בערך 10-15 יקרומטר בקוטר.</li>
	<li>ממלאים את הצינורית באמצעות מזרק עם מסנן 0.22 יקרומטר מוצמד עם acsf חמצן. ודא שאין בועות אוויר או פסולת בצינורית.</li>
	<li>הוסיפו עוד שתי צינורית לצדו הנגדי של החדר. . אל תשבור את הטיפים שלהם</li>
</ol>3. ניתוח ההיפוקמפוס ובידוד
<ol><li>. המתת חסד וערוף את ראשו של עכבר לניסוי זה, השתמש בעכבר C57BL6/J בן 8 שבועות כדי להשוות בין הבדלים בין זכרים לנקבות. הכנס את העכבר עם פנטוברביטל וערוף את ראשו עם מספריים כירורגיים.</li>
	<li>באמצעות מספריים לחיתוך קטן, חותכים את העור לאורך קו האמצע בראש הראש. . תזיז את העור לצדדים</li>
	<li>מתחיל בצידו השני של הגולגולת, חותכים את הגולגולת לאורך קו האמצע עד שהגיעו לנורות הריח. להסיר חלקים של הגולגולת עד המוח נחשף.</li>
	<li>מסירים לאט את המוח, מתחילים. ליד האף של העכבר להפריד את המוח מן הנורות ריח, עצבי הגולגולת, ואת חוט השדרה ידי חיתוך דרך המבנים עם מספריים לחיתוך קטן.</li>
	<li>מניחים את המוח בצלחת הניתוח עם מספיק הפתרון של מגבים כדי להטביע אותו לחלוטין. בעזרת מיקרוסקופ לנתיחה, הניחו את המוח במרכז לוחית החיתוך עם הצד הגחוני הפונה כלפי מטה.</li>
	<li>חותכים את המוח לשניים. לאורך הקרע האורכי החזק את הלהב כך שהקצה החד יהיה מקביל לתחתית לוחית החיתוך. לחץ על הלהב דרך המוח במכה אחת. תזיז חצי כיתה אחת. לצד הצלחת</li>
	<li>בצע את השלבים הבאים עבור כל חצי כיתה בנפרד או במקביל.<ol>
<li>הניחו את כדור המחצית במרכז הצלחת כך שהקו המרכזי פונה כלפי מטה. ואז להשתמש להב תער כדי לחתוך לאורך הקרע הרוחבי כדי להסיר את המוח החלק המוח ואת הגזע. . תדחוף את הלהב ישר דרך הרקמה</li>
		<li>סובב את חצי הכדור כדי שהצד האמצעי יהיה פונה כלפי מעלה (איור 1א). השתמש במרית אחת. כדי להחזיק את המוח במקומו באמצעות מרית השנייה, הכנס את העצה מתחת למכסה הקורפוס וסקופ מתחת כדי להסיר את התלמוס, המחיצה וההיפותלמוס, כיסוי ההיפוקמפוס (איור 1B).</li>
		<li>ודא כי ההיפוקמפוס הוא כעת גלוי כמבנה מעוקל ליד הצד האחורי של המוח. באמצעות מרית אחת להחזיק את המוח במקום, להשתמש במרית השנייה כדי לגרוף את ההיפוקמפוס מתוך המוח (איור 1ג).</li>
	</ol>
</li>
	<li>העבר את ההיפוקמאני לצלחת הניתוח החדש מלאה בחצי הדרך עם הפתרון של מגבים. . להשליך את שאר המוח</li>
</ol>4. היפוקמאל arteriole בידוד
<ol><li>השלם את השלבים הבאים עבור כל ההיפוקמפוס.<ol>
<li>הצמד את אחד ההיפוקמאני באמצעות פינים קטנים בכל קצה של המקטע. . עורק ההיפוקמאל פונה כלפי מעלה</li>
		<li>באמצעות מלקחיים חדים מאוד, למתוח בעדינות חלקים קטנים של ההיפוקמפוס. זה ישחרר את הרקמה שמסביב לעורקי העורקים ויקל עליהם לבתר אותם.</li>
		<li>חיפוש דרך רקמת ההיפוקמאל לזהות את העורק הרוחבי החיצוני (איור 1ג)16,27.</li>
		<li>בעדינות לתפוס את העורק הרוחבי החיצוני, לאט למשוך אותו הרחק הרקמה כדי לאסוף את הארטיצילות ונימים מבשם CA3 אזור של ההיפוקמפוס.</li>
		<li>ברגע שאין עוד כלי להסרה מן הרקמה, להשליך את ההיפוקמאני. השאר את כלי השיט על קרח בצלחות כאשר לא בשימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. נימי היפוקמאל-מarteriole
<ol><li>מצא arteriole עם ענף שמסתיים בנימים. . תעביר את זה לתא האיברים ודא שarteriole הוא כ-15-30 יקרומטר כאשר מורחבים במלואו (איור 1D).</li>
	<li>לטעון בזהירות את כלי הדם על ידי דוחף את הצינורית הקצה דרך הקיר arteriole מתחת לאזור היעד. החליקו בזהירות את כלי הקיבול אל הצינורית עד שיש מספיק רקמות כדי לשים את העניבה.</li>
	<li>בצע קשר רופף עם 12-0 התפרים ניילון, כך שהוא מתאים את כלי הדם ואת צינורית. השתמש בקשר בחצי. התקלות כדי לאבטח קשרים ואז למשוך את הקצוות כדי להדק את הקשר ולאבטח את הarteriole לצינורית. הסר ענפים חיצוניים של כלי קיבול מתחת לעניבה על ידי משיכת אותם בעדינות עם מלקחיים.</li>
	<li>הפוך עוד עניבה ולאבטח אותו בקצה השני של arteriole לאטום אותו.</li>
	<li>הנמך את הצינורית עם הכלי המצורף עד שהוא שטוח כנגד הכיסויים בתחתית החדר. היזהרו לא להנמיך את הצינורית יותר מדי או שהוא יישבר.</li>
	<li>באמצעות צינורית אחת בצד השני של החדר, הורידו אותה כך שהנקודה בה היא מצמידה את העניבה לקצה הarteriole.</li>
	<li>השתמש בצינורית השלישית כדי להצמיד את ענף הנימים לכיסויים. מניחים את הקצה קרוב לסוף הסניף תוך כדי יציאה מקצות נימי הנימים החשופים (לא מתחת לצינורית).</li>
</ol>6. מיגרפיה ללחץ
<ol><li>הזיזו את החדר מטווח החיתוך למיקרוסקופ עם תוכנת ההקלטה.</li>
	<li>חבר את צינורות הזרימה הנכנס והזרימה היוצאת לחדר עבור הפרזיה. הפעל את הפרזיה עם aCSF מחומם (37 ° c) בקצב זרימה של 4 מ"ל/min.</li>
	<li>הצמד את צינורית הלחץ למשאבה פריסטטית עם מתמר לחץ והבא את הלחץ הפנימי ל -20 מ"מ כספית.</li>
	<li>הפעל את תוכנת ההקלטה. כוונן את המיקרוסקופ ואת הגדרות הדימות כדי להשיג את התמונה הברורה ביותר האפשרית. התחילו את ההקלטה לאחר שההגדרות ממוטבות לתוכנת האיתור.</li>
	<li>הגדילו את הלחץ של הכלי עד 40 מ"מ כספית בזמן הקלטת קוטר העורקים באמצעות תוכנת זיהוי קצוות.</li>
	<li>אפשר ~ 15-20 דקות כדי לשטוף את הפתרון של מנקה מתוך החדר עם aCSF, ולתת את ההכנה היקופה כדי ליצור ולפתח טון מיוגני.</li>
	<li>כדי לבדוק את הכדאיות של כלי קיבול, להחיל 1 μM NS309 פתרון לאמבט היתוך (ראה איור 2א, ב ובסעיף תוצאות הנציג). קטע arteriolar חייב להתרחב, הדגמת כ 30-40% טון מיוגני כפי שמתואר בעבר3,14,20.</li>
</ol>7. גירוי ממוקד בקצוות נימי
<ol><li>לאחר הטון הבסיסי של arteriole כבר הוקם הפונקציה אנדותל העריכו, לבדוק את התגובה של גירוי נימי.</li>
	<li>באמצעות פולר זכוכית, הפוך את הצינורית כך שתהיה נקודה טובה בקצה אחד. לשבור את הקצה של צינורית כך התרופה נבדק יכול לזרום דרך הקצה בצורה חלקה ב 5 psi.</li>
	<li>מלאו את הצינורית עם פתרון התרופות המעניין והוסיפו אותה למיקרומניפולציה של 3 צירים המצורפת למיקרוסקופ. לחבר את אבובים ממערכת הפליטה לחץ לצינורית.</li>
	<li>הנמך באיטיות את הצינורית לתוך האמבט שליד הנימים, והיזהר שלא לפגוע בשום חלק מכלי הקיבול או החומרה שבתא. התמרן את קצה הצינורית ליד קצות הנימים מבלי לגעת בהם. שמור את קצה הצינורית בדיוק ליד הכיסויים כדי למנוע גירוי של כלי הקיבול אם הצינורית דולפת.</li>
	<li>כאשר מוכנים לעורר את נימי הנימים, הורידו את הצינורית לכיסויים ובצמוד לנימים. הפעל את מערכת הפליטה לחץ עם זמן הפליטה הרצוי (כאן 20 s). לאחר סיום הגירוי, הרימו את הצינורית מעט כדי להימנע מגירוי נוסף.</li>
	<li>חזור על הגירוי בהתאם לצורך. שינוי צינורית הלחץ במערכת הפליטה כדי לבדוק תרכובות סמים שונות.</li>
	<li>כדי לוודא שרק הנימים ממריצים, ממלאים את הצינורית עם פתרון μM NS309 1 וחוזרים על הצעדים שלעיל. הערה: תאי האנדותל של נימי לא מבטאים את ערוצי K+ ערוצים שהופעלו על ידי NS309, כך שarteriole אסור להגיב לגירוי. אם arteriole dilates, הצינורית תצטרך להיות מיקומן או שקוטר החור יצטרך להיות קטן יותר (ראה איור 2א, ב ומקטע תוצאות הנציג).</li>
</ol>

<ol><li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation+%28New+York%2C+N.Y.%3A1994%29%22%5BJournal%5D)">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li>
<li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+and+IKCa+Channels%2C+Myogenic+Tone%2C+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles%3A+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li>
<li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li>
<li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li>
<li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors%2C+calcium+signaling%2C+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation+%28New+York%2C+N.Y.%3A1994%29%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li>
<li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries%3A+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li>
<li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging%3A+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smallest+stroke%3A+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li>
<li>Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoide%2C+M+%22Microcirculation+%28New+York%2C+N.Y.%3A1994%29%22">Microcirculation (New York, N.Y.:1994)</a>. 25 (1), (2018).</li>
<li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+endfoot+Ca2%2B+and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li>
<li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2%2C+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent%2C+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li>
<li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K%2B+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li>
<li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li>
<li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unitary+TRPV3+channel+Ca2%2B+influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li>
<li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia%3A+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li>
<li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).</li>
<li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age%3A+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li>
<li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li>
<li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+K%2B-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li>
<li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li>
<li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351(2018).</li>
<li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li>
<li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li>
<li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li>
<li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li>
<li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li>
<li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+the+K%28ir%292+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe%3A+the+discovery%2C+SAR%2C+and+pharmacological+characterization+of+ML133%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li>
<li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li>
<li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis%2C+potentially+impacting+cognitive+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הכנת הטאפה בלחץ (arteriole) הכנה המתואר בכתב היד הנוכחי היא הרחבה של ההליך הוקמה היטב שלנו כדי לבודד, לחצים, וללמוד העורקי העורקים29. אנו דיווחו לאחרונה כי קיר 2.1 ערוצי המוח בתאי נימי מוחי התחושה מגדילה ב [K+]o הקשורים הפעלה עצבית, וליצור אות היפרקטליזציה עולה כי מרחיב במעלה הצוק המעלה20. חשיפת תפקיד לא צפוי זה בעבר נימים היתה אפשרית בחלק על ידי פיתוח הכנת קאפה מיקרו מחזור הקורטיקלית20,21. כתב...

המחזור הפיטו על פני המוח היה מושא למידה רבה, בחלקו בשל הנגישות הניסיונית שלה. עם זאת, הטופולוגיה של ואצלב המוח יוצרת אזורים נפרדים. בניגוד לרשת הפיטו האיתנה העשירה באנסטוסים עם יכולת משמעותית לניתוב מראש של זרימת הדם, הגרם מהקיצילות (PAs) מהווה אספקה מוגבלת, כל אחד מהם מקיים נפח בדיד של רקמת העצבים1,2. זה יוצר אפקט צוואר בקבוק על זרימת הדם אשר, בשילוב עם תכונות פיזיולוגיות ייחודיות3,4,5,6,7,8, עושה גרם העורקי אתר חיוני עבור זרימת דם מוחין (cbf) תקנה9,10. למרות האתגרים הטכניים הכרוכים בבידוד ובצינורית של PAs, העשור האחרון ראה עניין מוגבר במחקרים לשעבר vivo תפקודית באמצעות כלי הלחץ11,12,13,14,15,16,17. אחת הסיבות לעניין מוגבר זה הוא מאמץ מחקרי ניכר שנערך על הזיווגים נוירוכלי (NVC), המנגנון העומד בראש תפקודי המוח היפראתרמיה18.
מאכלים, CBF יכול להגדיל במהירות בעקבות ההפעלה העצבית המקומית19. המנגנונים הסלולריים ומאפייני האיתות השולטים ב-NVC מובנים לחלוטין. עם זאת, זיהינו תפקיד בלתי צפוי בעבר עבור נימי המוח במהלך nvc בפעילות העצבית הרגישה ומתרגמת אותו לאות חשמלי מהקיטוב כדי להתרחב במעלה עורקי הראש20,21,22. פוטנציאל פעולה23,24 ופתיחה של מוליכות גדולה Ca2 +-מופעל K+ (BK) ערוצים על endcytic לאורך25,26 להגדיל את הריכוז יון האשלגן ביניים [K+]o, אשר תוצאות ההפעלה של חזקה מיישר פנימה מיישרים K+ (קיר) ערוצים של כלי הדם של נימים. ערוץ זה מופעל על-ידי החיצוני K+ אבל גם על ידי hyperpolarization עצמו. מתפשטת באמצעות צמתים הפער, הזרם המיקטריזציה ואז מחדש את התאים הסמוכים של נימי-הדם לarteriole, שם הוא גורם להרפיה מיציט ו-cbf להגדיל20,21. המחקר של מנגנון זה הוביל אותנו לפתח בלחץ קפיצ-מarteriole (קאפה) הכנה למדוד את קוטר arteriolar במהלך גירוי נימי עם סוכני vasoactive. ההכנה של קאפה מורכבת מפלח גרם arteriole קאננולה עם שלמות, מרמידות נימי במורד הזרם. קצות נימי הם דחוסים על קרקעית הזכוכית הקאמרית על ידי מיקרופיפטה, הסגר ומייצב את כל היווצרות כלי הדם20,21.
בעבר עשינו חידושים אינסטרומנטליים על ידי הדמיה של קאפה ההכנות מקליפת העכבר20,21 והעורקי המוח מהאמיגדלה של החולדה13 והיפוקמפוס16,17. כמו ההיפוקמאז ואצלב מקבל יותר תשומת לב בשל הרגישות שלה לתנאים פתולוגיים, כאן אנו מספקים שיטה צעד אחר צעד עבור הכנה קאפה מן ההיפוקמפוס העכבר (היקופה) כי לא ניתן להשתמש רק במחקרים NVC פונקציונלי אלא גם בביולוגיה מולקולרית, כימיה חיסונית, אלקטרופיזיולוגיה.

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; m מסנני מזרק</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229751</td><td></td></tr><tr><td>12-0 ניילון (12 ס"מ) מכשירי</td><td>מיקרו-כירורגיה שחורים, Inc</td><td>S12-0 NYLON</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה אוטומטי</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקט OD: 1.2 מ"מ, תעודת זהות: 0.68 מ"מ</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 דיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>היקף דיסקציה</td><td>אולימפוס</td><td>SZ11</td><td></td></tr><tr><td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &mdash; משאבה שלמה עם כונן ו-MS/CA 4-12 ראש משאבה</td><td>Ismatec</td><td>ISM 1090</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td></td></tr><tr><td>דוד מים מוטבע</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Integra&trade; Miltex&trade; רקמות מלקחיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-460-117</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>MgCl נטול מים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>ML 133 הידרוכלוריד</td><td>Tocris</td><td>4549</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>NS309</td><td>Tocris</td><td>3895</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III - מערכות חלוקת מיקרו-הזרקה תוך תאיות,</td> בקר סרוו לחץ <td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td></td>דו-ערוצי</tr><tr><td>עם משאבה פריסטלטית</td><td>מערכות חיות מכשור</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td> <td>סופר עדיניםFine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים - כלי מדע עדינים חדים-קהים</td><td></td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה אנכי</td><td>Narishige</td><td>PP-83</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo לשעבר היפוקמאלקפיאל arteriole הכנה למחקר פונקציונלי

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

מתוך שינויים התנהגותיים עדינים לדימנציה בשלב מאוחר, ליקוי קוגניטיבי כלי דם מתפתח בדרך כלל בעקבות איסכמיה מוחית. שבץ ודום לב הם מחלות מינית במידה ניכרת, ושניהם לגרום איסכמיה מוחית. עם זאת, ההתקדמות בהבנת ליקוי קוגניטיבי בכלי הדם, ולאחר מכן פיתוח טיפולים ספציפיים למין, כבר מוגבל בחלקו על ידי אתגרים בחקירת מיקרוסירקולציה המוח מדגמי העכבר במחקרים פונקציונליים. כאן, אנו מציגים גישה כדי לבחון את arteriole הקפילר בvivo לשעבר נימי-מarteriole (היקואפה) הכנה מהמוח של העכבר. אנו מתארים כיצד לבודד, צינורית, והלחץ על המיקרוסירקולציה כדי למדוד קוטר arteriolar בתגובה לגירוי נימי. אנו מראים אילו בקרות תפקודית מתאים ניתן להשתמש כדי לאמת את שלמות ההכנה של הסדר ולהציג תוצאות טיפוסיות, כולל בדיקת אשלגן כסוכן צימוד וסקולרית ואת ההשפעה של המעכב שאפיינו לאחרונה של Kir2 פנימה לתקן אשלגן משפחה הערוץ, ML133. יתרה מזאת, אנו נשווה את התגובות בהכנות שהתקבלו מעכברים זכרים ונקבות. בעוד שנתונים אלה משקפים חקירות פונקציונליות, ניתן להשתמש בגישה שלנו גם בביולוגיה מולקולרית, בכימיה חיסונית ובלימודי אלקטרופיזיולוגיה.

מוליכות אנתל קטנה (SK) ומוליכות ביניים (IK) Ca2 +-תלוי-K+ ערוצים להפעיל השפעה מאוד על הקוטר של PAs. היישום אמבטיה של 1 μM NS309, האגוניסט סינתטי וערוץ SK, שנגרמו ליד התרחבות מקסימלית (איור 2א, ב). עם זאת, תאים של נימי האנדותל חסרים בערוצי ה-IK ו-SK והיא לא היתה היפרקטזה בתגובה ל NS30920. כתוצאה מכך, מעורר מסתיים נימי עם 1 μM NS309 על ידי הוצאה ללחץ מוקד (20 s, 5 psi) לא לגרום התרחבות arteriolar<st...

כתב היד הנוכחי מפרט כיצד לבודד היפובין ונימים ממוח העכבר וכיצד ללחוץ אותם על מיגרפיה ללחץ, immunofluorescence ביוכימיה, מחקרים מולקולריים.

Vivo לשעבר היפוקמאלקפיאל Arteriole הכנה למחקר פונקציונלי

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

השיטה שלנו מאפשרת לחקור כלי דם הממוקמים במבנים שאחרת היה קשה לדמיין בוויבו, כגון ההיפוקמפוס. מכיוון כלי הדם מוסרים מן רקמת המוח, האיתות בין נימים העורקים ניתן ללמוד ללא השפעות מחוץ ליעד על הרקמה שמסביב. כדי לבודד את ההיפוקמפוס, השתמש מספריים ניתוח קטן לחתוך את העור לאורך קו האמצע בחלק העליון של הראש של העכבר ולהזיז את העור לצדדים.החל בצד caudal של הגולגולת, לחתוך את הגולגולת לאורך קו האמצע עד נורות הריח הם הגיעו ולהסיר חלקים של הגולגולת עד המוח הגדול נחשף. החל ליד האף של העכבר, לאט להסיר את המוח, באמצעות מספריים לחתוך דרך נורות הריח, עצבי הגולגולת, וחוט השדרה. להטביע את המוח, בצד הגחוני למטה ב- MOPS Buffered Saline, במרכז צלחת ניתוח, ולנחות את הצלחת תחת מיקרוסקופ ניתוח.מחזיקים את הקצה החד במקביל לתחתית המנה, משתמשים בסכין גילוח כדי לחתוך את המוח לשניים לאורך סדק האורך במכה אחת. מניחים חצי כדור אחד במרכז הצלחת כאשר קו האמצע פונה כלפי מטה ודוחפים את סכין הגילוח ישר דרך הרקמה לאורך סדק רוחבי כדי להסיר את המוח הקטן ואת גזע המוח. סובב את חצי הכדור כך שהצד המדילי פונה כלפי מעלה ולהשתמש במתית כדי להחזיק את המוח במקומו.הכנס את הקצה של מרית שנייה מתחת לקורפוס קאלוסום, סקופים מתחת לרקמה כדי להסיר את התלמוס, מחיצה, והיפותלמוס מן ההיפוקמפוס. ההיפוקמפוס צריך להיות גלוי כעת כמבנה מעוקל ליד הצד האחורי של המוח הגדול. באמצעות מרית אחת להחזיק את המוח הגדול במקום, להשתמש במתית השנייה כדי לגרוף את ההיפוקמפוס מתוך המוח הגדול.ואז להעביר את ההיפוקמפוס לצלחת ניתוח חדשה, מלא בערך באמצע הדרך עם פתרון MOP טרי. לבידוד עורקים בהיפוקמפוס, מניחים סיכות קטנות בכל קצה של היפוקמפוס אחד כדי לאבטח את צד העורק ההיפוקמפוס לדוגמה למעלה. באמצעות מדפים חדים מאוד, בעדינות למתוח חלקים קטנים של ההיפוקמפוס כדי לשחרר את הרקמה המקיפה את העורקים.ולחפש דרך רקמות ההיפוקמפוס הגבי כדי לזהות את העורקים הרוחליים החיצוניים. כאשר העורק אותר, לתפוס את העורק הרוחבים החיצוני מן ההיפוקמפוס לאט למשוך אותו מן הרקמה כדי לאסוף את העורקים נימים. העורק מכל היפוקמפוס מוסר בנפרד.כאשר אין יותר כלי להסרה, מניחים את הדגימות על הקרח ומשליכים את רקמת ההיפוקמפוס הנותרת. עבור cannulation של arterioles, לאתר עורקים עם ענף המסתיים עם נימים למקם את העורקים לתוך תא איברים. בזהירות לדחוף את קצה cannula דרך קיר העורקים מתחת לאזור היעד לעלות על כלי הדם.לאחר מכן, בזהירות להחליק את הכלי על cannula עד שיש מספיק רקמה שבו למקם את העניבה. השתמש 12-0 תפרים ניילון כדי להפוך קשר רופף שיתאים מעל כלי הדם ואת cannula, ולהשתמש קשר חצי תקלה כדי לאבטח את הקשרים, למשוך את הקצוות כדי להדק את הקשר כדי לאבטח את העורקים אל cannula. לאבטח עניבה נוספת בצד השני של העורקים כדי לאטום אותו.בצד הנגדי של התא, מנמיך cannula השני עד הנקודה של cannula סיכות במורד העניבה בקצה העורקים. לאחר מכן השתמשו בקנולה שלישית כדי להצמיד את ענף נימי לכיסוי, מניחים את הקצה קרוב לקצה הענף, תוך השארת קצות נימים חשופים. כמו microcirculation המוח הוא שביר להפליא, הקפד למזער את המתיחה והטיפול של כלי הדם במהלך הליך cannulation כדי להבטיח את הישרדותם של העורקים.לניתוח מיוגרפיה בלחץ, מעבירים את התא לשלב מיקרוסקופ אור עם תוכנת הקלטה ומחברים את צינורות הזרימה והזרימה לתא לצורך שפע. התחל את שפע עם 37 מעלות צלזיוס נוזל השדרתי מלאכותי בקצב זרימה של ארבעה מיליליטר לדקה, ולצרף את קנולה לחץ למשאבה peristaltic בשילוב עם מתמר לחץ. להביא את הלחץ הפנימי ל 20 מילימטרים של מרקורי ולהתחיל את תוכנת ההקלטה.התאימו את המיקרוסקופ ואת קביעות התמונה כדי להשיג את התמונה הברורה ביותר האפשרית. ולהשתמש בתוכנת זיהוי קצה כדי לבדוק כי העורקים הוא על 15 עד 30 מיקרומטר קוטר כאשר הוא הוסיף שליטה מלאה. לאחר ההגדרות כבר אופטימיזציה, להתחיל את ההקלטה ולהגדיל את הלחץ החוץ וסקולרי בכלי עד 40 מילימטרים של מרקורי, תוך הקלטת קוטר העורקים עם תוכנת זיהוי קצה.לאחר מכן שפע את התא במשך 15 עד 20 דקות כדי לשטוף את פתרון MOP. כדי לבדוק את הכדאיות של כלי השיט, להחיל פתרון אחד micromolar NS309 על שפע האמבטיה, קטע העורקים צריך להתהוות, הוכחת טון 30 עד 40%myogenic. לאחר הטון הבסיסי עבור העורקים הוקמה, להשתמש מושך זכוכית כדי להפוך cannulas עם נקודה עדין בקצה אחד, ולהשתמש מטליות כדי לשבור את הקצה של כל cannula, כך התרופה של עניין יכול לזרום בצורה חלקה דרך הקצה ב 5 ק"ג של לחץ לאינץ 'מרובע.מלא את ה Cannula עם התרופה של עניין. ותטען את הקנולה על מיקרומניפולטור תלת-צירי המחובר למיקרוסקופ. חבר את הצינורות ממערכת פליטת הלחץ לתוך הצינורית, ולאט לאט להוריד את הצינורית לתוך האמבטיה ליד נימים, דואג לא לפגוע בכל חלק של כלי השיט או התא.כדי לעורר את נימי, להוריד את cannula כדי coverslip ממש ליד נימים ולהפעיל את מערכת פליטת הלחץ עם זמן הפליטה הרצוי. בסוף הגירוי, להעלות את cannula מעט, כדי למנוע גירוי נוסף. כדי לאשר כי רק נימים היו להיות מגורה, למלא את הקנולה החדשה עם מיקרומולר אחד של פתרון NS309 ולעורר את נימים כפי שהוכח.לאחר מכן להשיג את vasodilation מקסימלית על ידי רחצה את ההכנה עם פתרון ללא סידן. יישום אמבטיה של NS309 micromolar אחד גורם תאט כמעט מקסימלית של העורק עקב תעלות אשלגן רגיש סידן ב אנדותל. תאים אנדותל נימי עם זאת, חסר ערוצי מוליכות ביניים וקטנים ולא hyperpolarize בתגובה ליגון, כתוצאה מכך, מגרה קצוות נימיים עם NS309, אינו גורם תרכובת העורקים במעלה הזרם תרכובת, זה מצביע על כך NS309 לא הגיע לעורקים, והוא יכול לשמש כבקרה כדי לגשת להגבלה מרחבית של המתחם להחיל על נימים על ידי פליטת לחץ.באמצעות הכנת עורקים נימי נימי ההיפוקמפוס כפי שהודגם, היישום של נוזל השדרתי מלאכותי בתוספת 10 מילימולר אשלגן לקצוות נימי, תוצאות תיאדול עורקים במעלה הזרם שאינו שונה בין ההכנות של עכברים זכר ונקבה. כמו כן, התוספת של מעכב Kir2 ML 133, למעשה מבטלת את תיעוב העורקים הנגרמת נימי, בתגובה 10 מילימולר אשלגן בהכנות מעכברים זכר ונקבה. בעת הרכבה של וסת הדם, להגביל אינטראקציות ישירות עם כלי הדם כדי למזער את הנזק, ולהגדיל את הכדאיות של הכלי.לאחר כלי הדם כבר מבודד, תרכובות סמים שונות ניתן לבדוק או כלי הדם יכול להיות מעובד עוד יותר עבור ביולוגיה olecular, אימונוכימיה, או מחקרים אלקטרופיזיולוגיה.

ex-vivo-pressurized-hippocampal-capillary-parenchymal-arteriole

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול לתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס, המאפשר לשחזר היבטים רבים של פגיעה המוחית איסכמי, מוצג. על ידי לימוד לשינויים בתאי עצב שינויים של neurovasculature בנוסף, פרוטוקול זה הוא כלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

מאמר זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניתן לכמת את ארכיטקטורת כלי הדם במוח באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני in vivo ו-ex vivo.

כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה HIV

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט וניתן לשחזור לבידוד של עורקים תוך-מוחיים (קבוצת כלי דם הכוללת עורקים פרנכימליים, עורקים חודרים ועורקים קדם-נימיים) מעכברים, לשימוש במיוגרפיה בלחץ, אימונופלואורסצנטי, ביוכימיה ומחקרים מולקולריים.

בידוד Cannulation של שיתוק Parenchymal arterioles

בעוד שדימות מולטיפוטונים יעיל רק בעומקים מוגבלים מפני השטח של הרקמה, ניתן להשיג הדמיה ברזולוציה של 3 מיקרומטר בכל עומק באמצעות pCLE. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הדמיית pCLE למדידת דינמיקה מיקרו-וסקולרית בהיפוקמפוס של עכברי איקטל ועכברי בר.

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-Scanning Endomicroscopy (pCLE) של נימי היפוקמפוס בעכברים ערים

המוח מבודדים נימים מרקמות המוח האנושי יכול לשמש כמודל פרה ללמוד מכשול הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי טריים.

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

אנו מציגים שיטה אשר יכול לספק עוד תובנות האירועים בתחילת שבבסיס הקשורים ניוון מוחיים, המבוססת על הטכניקה המוח הוקמה לשעבר-vivo , המשלב את היתרונות של ניסויים ב- vivo ו- in vitro לקשרי . יתר על כן, הוא מייצג הזדמנות ייחודית השוואה ישירה של קבוצת טיפול ללא טיפול באותו מישור אנטומיים.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוטה עבור בידודו של רבים מן הרשתית עכברוש יכול לשמש אלקטרופיזיולוגיות, סידן הדמיה ואת הלחץ myography מחקרים.

בידוד של רבים ברשתית ללימודי פיזיולוגיה של התא Vivo לשעבר

הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטה פשוטה להתחקות אחר תחזיות גלוטמט אזור טגמנטלי גחוני (VTA) להיפוקמפוס. פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA שולב עם הקלטת CA1 כדי להדגים כיצד מסופי גלוטמט VTA לווסת CA1 קצב ירי פירמידלי putative ב vivo.

מעקב אנטומי ותפקודי משולב של מסופי גלוטמט באזור הגונטם הגחמני בהיפוקמפוס

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca2+] ופוטנציאל הממברנה.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

הפרוטוקול כאן מספק דגימה דינמית מפורטת בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי מההיפוקמפוס של חולדות ערות באמצעות מערכת מיקרודיאליזה.

איסוף דינמי בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי בהיפוקמפוס מחולדות מודעות באמצעות מערכת מיקרודיאליזה

למדו הכנת עורקים ונימים מהיפוקמפוס עכברים לחקר אקס ויוו. שיטה זו מאפשרת ניתוח תפקודי כלי דם במודל מבודד ללא הפרעות מרקמות מקיפות במוח.

Vivo לשעבר היפוקמאלקפיאל Arteriole הכנה למחקר פונקציונלי

גלה סרטונים נוספים