Name: בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: למדו פרוטוקול לבידוד אסטרוציטים ומיקרוגליה ראשוניים מקליפות מוח של עכברים נולדים. השיטה מאפשרת השוואת תגובות תאי גליה לזיהומים טפיליים במערכת העצבים המרכזית באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

היינו רוצים להודות לפרופסור ד ר רנאטו A. Mortara מהאוניברסיטה הפדרלית של סאו פאולו (UNIFESP) עבור mAb 2C2 אנטי-Ssp-4. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מפונדסאו דה Amparo à Pesquisa do Estado דה סאו פאולו (FAPESP, להעניק 2017/25942-0 ל K.R.B.), Conselho הלאומי דה Desenvolvimento Cientfico e Tecnológico (CNPq, להעניק 402100/2016-6 ל K.R.B.), המכון הלאומי לצ דה ווקאינאס דה ואקנאס (בטלוויזיה/CNPq) וכורדניצ דה אפרטפייטןדה פאויאל מעולה (שכמיות, מימון קוד 001). M.P.A. מקבל מלגת CNPq, A.L.O.P. מקבל האחווה מ שכמיות, ו-I. S. F ו L.Z.M.F.B. מקבל מלגת מ FAPESP.

כל ההליכים הניסיוניים הכרוכים בעכברים בוצעו בהתאם למשפט הלאומי הברזילאי (11.794/2008) ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ושימוש בוועדות (IACUC) של האוניברסיטה הפדרלית של סאו פאולו (UNIFESP).
1. הפקת תאים גליאל, תחזוקה ודיסוציאציה
הערה: מספר העכברים המשמשים להפקת התאים הגליאל תלוי בכמות התאים הדרושים לביצוע הניסויים הרצויים. בפרוטוקול זה, סך של 2.7 x 107 אסטרוציטים ו 4 x 106 מיקרוגלייה התקבלו שישה C57BL/6 עכברים. כל ההליכים בוצעו במצב סטרילי בארון בטיחות II class.
<ol><li>היום הראשון
	<ol>
<li>הכינו תמיסת מלח מאוזנת טהורה של האנק (HBSS) ו-HBSS + 10% של סרום העוברי חום בלתי מופעל (FBS) (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>להכין מדיום הנשר השונה של dulbecco (dmem)/f12 (10% fbs + 0.08 מ ל פניצילין + 0.09 mm סטרפטומיצין + 12.5 mm הhepes + 30 מ"מ נתרן ביקרבונט, pH 7.2) ולסנן אותו עם מסנן ב0.22 יקרומטר (ראה טבלת חומרים). הערה: יש לאחסן את כל מדיית התרבות ב-4 ° c, אך יש צורך לחמם אותן מראש ב-37 לפני 20 דקות לפני תחילת הניסוי.</li>
		<li>לחטא את כל כלי הניתוח (מספריים, מרית ופינצטה) ב החיטוי ולהשתמש 70% אתנול במהלך ההליך.</li>
		<li>לשים ילודים (עד 3 יום בן) עכברים בחדר אטום המכיל כותנה ספוגה isof, 5 דקות להרדמה מעמיקה.</li>
		<li>רסס את גור העכבר עם 70% אתנול וערוף את ראשו של בעל החיים עם מספריים.</li>
		<li>לגרום משונן cut (אחורי לקדמי) עם מספריים לאורך הגולגולת כדי לפתוח אותו ולחשוף את המוח. הפרידו את הגולגולת מהמוח באמצעות מלקחיים. להסיר את המוח באמצעות מיקרו מרית כדי לשמור על שלמות המוח.</li>
		<li>מניחים את המוח בצלחת פטרי יבשה (6 ס מ קוטר). להסיר את הנורה ואת המוח הזעיר באמצעות מיקרו מרית. הזיזו את הקליפה לצלחת פטרי אחרת (בקוטר 6 ס מ) המכילה HBSS + 10% FBS (2 מ ל/צלחת פטרי).</li>
		<li>חותכים את רקמת המוח לחתיכות קטנות עם מספריים סטרילית באמצעות p1000 מיקרופיפטה להעביר כל רקמת המוח עם HBSS + 10% FBS שונים 15 מ"ל שפופרות חרוט. ודא שאמצעי האחסון הסופי הוא 2 mL/tube. אם לא, להשלים עם HBSS + 10% FBS. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. אם כן, צינורות חרועם רקמת ה-CN חייבים להיות ממוקמים על הקרח עד 1 h.</li>
		<li>רוחצים את רקמת המוח לחתוך עם 3 מ ל של HBSS + 10% FBS (לכל צינור) ולאחר ההתרוממות. הסר בזהירות את הסופרנטאנט. חזור על שלב זה 3 פעמים. הערה: שלב זה נועד להסיר את הפסולת כדי לשחזר את הרקמה המחולצים.</li>
		<li>רוחצים את רקמת המוח לחתוך עם 3 מ"ל של HBSS טהור (לצינור) ואחרי היין, להסיר בזהירות את supernatant. חזור על שלב זה 3 פעמים. הערה: שלב זה נועד להסיר את הנסיוב הנותר מן השטף הקודם, כמו תאים יהיה טריסינטזציה בשלב הבא.</li>
		<li>הוסיפו 3 מ ל טריפסין לצינור ומניחים באמבט מים ב-37 ° c למשך 30 דקות, מנענעת בעדינות את הצינורות כל 5 דקות. הימנע בועות על ידי היפוך או לפתע ערבוב צינורות. הערה: שלב זה נועד לעכל את הרקמה שנאספה.</li>
		<li>כדי להשבית את הטריפסין, שטוף את הרקמה עם 3 מ ל לצינור של HBSS + 10% FBS, ולאחר שהיה בקבוקי הרקמה, הסר בזהירות את הסופרנטאנט. חזור על שלב זה 3 פעמים.</li>
		<li>שטוף את הרקמה עם 3 מ ל לכל שפופרת של HBSS טהור ובזהירות להסיר supernatant. חזור על שלב זה 2 פעמים.</li>
		<li>הוסף 7 מ"ל לכל שפופרת של hbss טהור ו המגון לסדר את הרקמה באמצעות מעברים רצופים ב פיפטות: הראשון עם הצינור 10 ml סרולוגית, ואחריו 5 מ ל ולבסוף עם p1000 micropipette.</li>
		<li>לאחר הומוקות, צינורות צנטריפוגה ב 450 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.</li>
		<li>השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה עם 4 מ ל של HBSS + 10% FBS לכל צינור.</li>
		<li>העברת תאים לבקבוקון T-75 מטופל עבור הדבקה מיטבית של תרבות התא (ראה טבלת חומרים). הערה: רקמת התהליך מכל בעל חיים לכל בקבוקון.</li>
		<li>הניחו את הבקבוקון בחממה ב-37 ° c ו -5% CO2 ל -30 דקות לצורך הדבקות.</li>
		<li>הוסף 10 מ ל של שנוספו DMEM/F12 לבקבוקון ו-דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2. הערה: אמצעי האחסון הסופי הוא 14 מ ל לכל בקבוקון.</li>
	</ol></li>
	<li>היום השלישי
	<ol>
<li>הסרת 7 מ ל של התרבות בינונית מ-T-75 בקבוקון ולהוסיף 7 מ ל של חדש שנוספו Dמאמ/F12. הערה: מבחנות יכיל הרבה פסולת תאית מראה מעונן.</li>
	</ol></li>
	<li>היום החמישה
	<ol>
<li>להסיר את כל המדיום מ-T-75 בקבוקון ולהוסיף 14 מ ל של חדש שנוספו Dמאמ/F12. הערה: בינוני מוחלף מבחנות כדי להסיר הריסות ותאים לא מחסיד.</li>
		<li>לאחר כל 48 h, להסיר 6 מ ל של supernatant ולהוסיף 7 מ ל של טריים שנוספו DMEM דיום/F12 בינוני עד יום 14 של תרבות.</li>
	</ol></li>
	<li>. היום ה -14
	<ol>
<li>לאחר הסרת 6 מ ל של סופרנטאנט והוספת 7 מ ל של מדיום טריים בתוספת/F12, סגור את T-75 מבחנות הדוק.</li>
		<li>מניחים אותם ברצפה מסלולית שייקר ב 200 סל ד ו 37 ° c לילה כדי מכנית הנתק המיקרוגליה מ astrocytes.</li>
	</ol></li>
	<li>. היום ה -15
	<ol><li>לקחת את מבחנות מן השייקר ובמרץ לשטוף אותם עם המדיום שלהם כדי למטב את דיסוציאציה התאים ואת הקציר המספר המירבי של microglia. לאחר מכן, לאסוף את supernatant (המכיל microglia) ולהעביר לשפופרת חרוט 50 mL.</li>
		<li>לאחר מכן, להוסיף 4 מ ל טריפסין לתוך כל בקבוקון ו דגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c כדי לנתק את האסטרוציטים.</li>
		<li>הוסף 5 מ ל לכל בקבוקון של בתוספת Dמאמ/F12 כדי להשבית את טריפסין. לשטוף את מבחנות עם המדיום שלהם ואת התוכן להעביר לשפופרת חרוט 50 mL.</li>
		<li>צנטריפוגה את כל הצינורות המכילים מיקרוגלייה הנתק ו אסטרוציטים ב 450 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.</li>
		<li>. מחק את הסופרנטאנט השהה מחדש את הגלולה מיקרוגלייה ב 1 מ ל ו אסטרוציטים ב 10 מ ל של שנוספו dמאמ/F12.</li>
		<li>המשך לספירת תאים בתוך תא נויבאואר או מונה תאים אוטומטי. לוחית את התאים עם בתוספת DMEM/F12 בצפיפות הרצויה בלוח התאים התחתון שטוח התחתונה הטבלה (מראש עבור המצורף לתא אופטימלי; ראה טבלת חומרים). התאים הדגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות כדי לאפשר להם לצרף. הערה: שריין 1.5 x 106 של כל אחד מאוכלוסיית התאים כדי לאשר את הטוהר שלהם על ידי זרימה cy, try.</li>
		<li>בצע ניתוח ציטומטרי זרימה כדי לאמת את טוהר אוכלוסיית התאים. הערה: אנו מחשיבים מיקרוגלייה CD11b+/cd45+/gfap- ו אסטרוציטים CD11b-/cd45-/gfap+. Iba1 ו TMEM119 כתמים עשוי להיחשב על מנת לאפיין במלואו מיקרוגלייה22.</li>
		<li>הוסף FMO (זריחה פחות אחת)23 ומדגם לא מוכתם עבור כל האוכלוסייה תא (astrocytes ו microglia) כפקדים של זרימה cy, לנסות שיטת הפעולה.</li>
		<li>עבור כל אחד מאוכלוסיית התאים, הזמינו 5x 10 תאים עבור כל הדגימות המוכתמת והבלתי מוכתמות. עבור fmo, הזמינו שתי שפופרות אחרות של מיקרוגלייה המכיל 2.5 x 105 תאים כל אחד ושמור גם שפופרת אחר של 5 x 105 astrocytes. הערה: מאחר שמספרי מיקרוגלייה יכולים להיות גורם מגביל, ניתן להשתמש בפחות תאים עבור פקדים בלתי מוכתמים ו-fmo.</li>
		<li>צנטריפוגה את כל microtubes ב 450 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה עם 500 μL/microtube של מאגר FACS (פוספט באגירה מלוחים (PBS) + 0.5% בסרום שור (BSA) + 2 מ"מ EDTA, pH 7.2).</li>
		<li>צנטריפוגה את כל microtubes ב 450 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה עם 100 μl/microtubes של ANTI-CD16/CD32 (שיבוט 93) (1:50) מדולל במאגר facs. מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הוסף 500 μL/microtube של מאגר FACS לתוך כל מיקרוצינורות וצנטריפוגה ב 450 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. השעיה מחדש אסטרוציטים ו מיקרוגלייה מכתים צינורות וגם אסטרוציט fmo הצינור עם 50 μl/מיקרוגלייה של משטח סמנים לערבב: anti-CD45 (PE, שיבוט 30-F11) ו anti-CD11b (efluor 450, שיבוט M1/70) (שניהם מדולל ב 1:100 במאגר facs).</li>
		<li>עבור תאים שאינם מוכתמים, השהה מחדש עם אותו כמות של מאגר FACS. עבור מיקרוגלייה fmo, דגירה כל שפופרת מיקרוגלייה עם anti-CD45 או anti-CD11b. דגירה כל הדגימות ב 4 ° c עבור 20 דקות בחושך.</li>
		<li>הוסף 500 μL של מאגר FACS לכל מיקרו-צינורית. צנטריפוגה ב 450 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. לבטל את supernatant ולהשעות את הגלולה עם 100 μl/microtube של מאגר קיבעון (ראה טבלת חומרים) עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
		<li>הוסף 500 μL/microtube של מאגר החדירות 1x (ראה טבלת חומרים) ו הדגירה ב 4 ° c עבור 5 דקות בחושך.</li>
		<li>צנטריפוגה את כל המיקרוצינוריות ב 450 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. השעיה מחדש אסטרוציטים ו מיקרוגלייה מכתים צינורות וגם מיקרוגלייה fmo צינורות עם 50 μl/מיקרוגלייה של נוגדן תאיים anti-gfap (APC, שיבוט GA5) ב 1:100 דילול במאגר החדירות 1x. עבור תאים בלתי מוכתמים ו-אסטרוציט fmo, השהה מחדש את התאים באותו כמות של מאגר facs. מודטה את כל הדגימות ב 4 ° c עבור 30 דקות בחושך.</li>
		<li>לשטוף את כל הצינורות על ידי הוספת 500 μL/microtube של מאגר חדירות 1x. צנטריפוגה את כל המיקרוצינוריות ב 450 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° c. השהה מחדש כל מיקרוצינורית ב-200 μL של מאגר FACS. לרכוש 1 x 105 אירועים/מדגם על הזרימה cytometer.</li>
		<li>לצורך ניתוח, התאים חייבים להיות מגודרת הראשון על CD11b x CD45 ולאחר מכן GFAP היסטוגרמה. הערה: שליטה בלתי מוכתמת ובקרת FMO מועילה לקביעת השערים.</li>
	</ol></li>
</ol>2. זיהום והערכה של שיעורי זיהום
<ol><li>זיהום של תאים גליאל עם T. gondii
	<ol>
<li>צלחת 3 x 104 מיקרוגלייה או אסטרוציטים עם שיושלם dמאמ/F12 ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות בלוח מקדים 96-ובכן שטוח (ראה לוח חומרים).</li>
		<li>הדביקו כל אחד מאוכלוסיית התאים בעזרת טכיון מ -T. gondii RH זן המבטא חלבון פלורסנט צהוב (yfp) בריבוי של זיהום (משרד הבית) של 1:1 (טפיל: תא) מדולל ב 200 μl/טוב של תוספת RPMI (3% fbs + 0.16 mm פניצילין + 0.18 mm סטרפטומיצין + 12.5 MM hepes + 30 מ"מ נתרן ביקרבונט, pH 7.2) (ראה לוח חומרים). מודטה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 48 h.</li>
		<li>לאחר מכן, למחוק את supernatant ולתקן את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של 1% פאראפורמלדהיד (התחתית) מדולל ב-PBS ב 4 ° צ' עבור 24 h.</li>
		<li>החלף את התחתית עם 100 μL/טוב של PBS ב-pH 7.2.</li>
		<li>בזהירות להסיר את supernatant ואת התאים הכתם ' גרעינים על ידי pipetting 50 μL/טוב של DAPI (5 מ"ג/mL) מדולל ב-PBS pH 7.2 (1:1000) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
		<li>החלף פתרון DAPI מכתים עם 100 μL/טוב של PBS (pH 7.2) ולנתח אותו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהום של תאים גליאל עם T. cruzi
	<ol>
<li>צלחת 3 x 104 מיקרוגלייה או אסטרוציטים עם שיושלם dמאמ/F12 ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות בלוח מקדים 96-ובכן שטוח (ראה לוח חומרים). הערה: עבור כל נקודה של זיהום, להשתמש בצלחת אחרת.</li>
		<li>להדביק את התאים גליה עם טריאואסטיגוטים מ T. cruzi Y זן ב-מע של 5:1 (טפילים: תא) מדולל ב 200 μl/טוב של בתוספת RPMI ו דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 2 h. הערה: שלב זה חשוב עבור הפלישה התא על ידי הטפיל.</li>
		<li>הסר את כל supernatant ולשטוף את הבארות על ידי הוספת 200 μL/טוב של בתוספת RPMI כדי להסיר את כל טפילים מסחטות. הסר supernatant ולהוסיף 200 μL/טוב של טריים שנוספו RPMI. הערה: שלב זה מתכוון להסיר את כל הטפילים שלא פלשו לתאי החסיד.</li>
		<li>התאים הנגועים דגירה עבור 2 h, 48 h ו 96 h כדי להעריך את שכפול T. cruzi בתאי גליה11.</li>
		<li>לאחר כל נקודת זמן, להסיר את supernatant ולתקן את התאים עם 100 μL/טוב של מתנול עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להחליף מתנול עם 100 μL/טוב של PBS (pH 7.2).</li>
		<li>לאחר קיבעון, להכין את התאים עבור התיקון האימונוoforas כדלקמן.<ol>
<li>כדי למנוע התאמה אוטומטית, לטפל בתאים עם 100 μL/טוב של 50 mM NH4Cl מדולל ב-PBS (pH 8.0) עבור 15 דקות. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 μl/טוב של PBS ומיד להסיר אותו (לחזור על שלב זה 3 פעמים).</li>
			<li>הבא, לחלחל את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של 0.5% טריטון מדולל ב-PBS עבור 15 דקות. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של PBS ומיד להסיר אותו (לחזור על שלב זה 3 פעמים).</li>
			<li>לאחר מכן, מודלת את תרבות התא עם 100 μL/טוב של פתרון חסימה (5% לא שומן חלב + 2% BSA מדולל ב-PBS [pH 7.2]) עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של PBS ומיד להסיר אותו (לחזור על שלב זה 3 פעמים).</li>
			<li>על מנת להכתים את amastigotes, דגירה עם 30 μL/טוב של אנטי מסחרי נוגדן חד שבטיים (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 חלבון (1:200) מדולל בפתרון חסימת עבור 1 h בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של PBS ומיד להסיר אותו (לחזור על שלב זה 3 פעמים). מודלת את הצלחת עם 30 μL/היטב של הנוגדן נגד העכבר משני (1:500) מדולל ב-PBS עבור 1 h בטמפרטורת החדר. הערה: החלבון שאינו מסחרי mAb 2C2 אנטי-Ssp-4 היה מתנה אדיבה מפרופסור ד ר רנאטו א. מורטרה מהמחלקה למיקרוביולוגיה, אימונולוגיה ו פרזיטולוגיה של האוניברסיטה הפדרלית של סאו פאולו.</li>
			<li>הסר בזהירות את הגרעין ואת גרעיני הכתם על ידי הוספת 50 μL/טוב של DAPI (5 מ"ג/mL) מדולל ב-PBS pH 7.2 (1:1000) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
			<li>החלף פתרון DAPI מכתים עם 100 μL/טוב של PBS-pH 7.2 ולנתח אותו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Azevedo, F. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equal+numbers+of+neuronal+and+nonneuronal+cells+make+the+human+brain+an+isometrically+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).</li>
<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glia%2Fneuron+ratio%3A+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li>
<li>Jäkel, S., Dimou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+Cells+and+Their+Function+in+the+Adult+Brain%3A+A+Journey+through+the+History+of+Their+Ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40 (2), 133-139 (2002).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).</li>
<li>Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVirchow%2C+R+%22Verlag+von+August+Hirschfeld%2C+Berlin%22">Verlag von August Hirschfeld, Berlin</a>. , (1858).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Samartino, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+abortus+induces+the+secretion+of+proinflammatory+mediators+from+glial+cells+leading+to+astrocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).</li>
<li>Jamilloux, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome+activation+restricts+Legionella+pneumophila+replication+in+primary+microglial+cells+through+flagellin+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection.</a> Glia. 61 (4), 539-549 (2013).</li>
<li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li>
<li>Pacheco, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impairment+in+the+NLRP3-induced+NO+secretion+renders+astrocytes+highly+permissive+to+T.+cruzi+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication.</a> Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).</li>
<li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).</li>
<li>Lian, H., Roy, E., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Primary+Microglial+Culture+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Protocol for Primary Microglial Culture Preparation.</a> Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).</li>
<li>Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+in+primary+rat+CNS+cells%3A+Differential+contribution+of+neurons%2C+astrocytes%2C+and+microglial+cells+for+the+intracerebral+development+and+stage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation.</a> Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).</li>
<li>Chagas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nova+tripanozomiaze+humana%3A+estudos+sobre+a+morfolojia+e+o+ciclo+evolutivo+do+Schizotrypanum+cruzi+n.+gen.%2C+n.+sp.%2C+ajente+etiolojico+de+nova+entidade+morbida+do+homem%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).</li>
<li>Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurologic+manifestations+of+the+neglected+tropical+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases.</a> Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).</li>
<li>Jones, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmic+encephalitis+in+HIV-infected+persons%3A+risk+factors+and+trends.+The+Adult%2FAdolescent+Spectrum+of+Disease+Group%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group.</a> AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).</li>
<li>Luft, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmic+Encephalitis+in+Patients+with+the+Acquired+Immunodeficiency+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).</li>
<li>Madalosso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chagasic+meningoencephalitis%3A+Case+report+of+a+recently+included+AIDS-defining+illness+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+do+Instituto+de+Medicina+Tropical+de+Sao+Paulo%22%5BJournal%5D)">Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil.</a> Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).</li>
<li>Rocha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+patients+with+Chagas%E2%80%99+disease+and+acquired+immunodeficiency+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).</li>
<li>Yasukawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+report%3A+Trypanosoma+cruzi+meningoencephalitis+in+a+patient+with+acquired+immunodeficiency+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+in+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Compensation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).</li>
<li>Silva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+astrocytes+with+TNF+enhances+their+susceptibility+to+Trypanosoma+cruzi+infection+and+creates+a+self-sustaining+inflammatory+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).</li>
<li>Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honeybee+retinal+glial+cells+transform+glucose+and+supply+the+neurons+with+metabolic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).</li>
<li>Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-site+energy+supply+at+synapses+through+monocarboxylate+transporters+maintains+excitatory+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).</li>
<li>Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+astrogliosis+in+the+mouse+hypothalamus+in+response+to+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity.</a> Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).</li>
<li>Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+active+role+of+astrocytes+in+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The active role of astrocytes in synaptic transmission.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).</li>
<li>Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathophysiological+Role+of+Microglia+in+Dynamic+Surveillance%2C+Phagocytosis+and+Structural+Remodeling+of+the+Developing+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191(2017).</li>
<li>Floden, A. M., Combs, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+repetitively+isolated+from+in+vitro+mixed+glial+cultures+retain+their+initial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50079(2013).</li>
<li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+refined+CD11b+magnetic+isolation+of+primary+microglia+with+enhanced+purity+and+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55364(2017).</li>
<li>Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+microglia+isolation+from+mixed+glial+cell+cultures+of+neonatal+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3814(2012).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

החשיבות של לימוד תאים גליאל מבודדים פונקציות בהקשרים ביולוגיים נפרדים התרחב בשני העשורים האחרונים. הבנה מעבר לנוירונים הוא עדיין תחום הולך וגדל בביולוגיה של התא, במיוחד תחת זיהומים או מצבים דלקתיים8,9,24. התאים glial חיוניים לא רק עבור הנוירונים תמיכה פיזית (כפי שהיה ידוע בעבר), אבל גם במצבים רבים אחרים פיסיולוגיים כגון אספקת אנרגיה תא העצב, neurometabolism, מעקב החיסונית, גיזום סינפטית, עיצוב ואפנון של הרקמה, בין אחרים<sup clas...

ה-cn מורכב בעיקר מנוירונים ותאי גלאל1,2,3. Microglia ו אסטרוציטים הם התאים הנפוצים ביותר של גליה ב-cn. Microglia, מקרופאג תושב, הוא החיסוני ואת התאים של הphagocytic ב-cn3,4, בעוד אסטרוציטים אחראים לשמירה על הומאוסטזיס ולהפעיל פונקציות תומכות5.
למרות התאים גליה הידוע באופן קלאסי להיות אחראי על תמיכה והגנה של נוירונים6,7, פונקציות המתעוררים של תאים אלה תוארו בספרות האחרונות, כולל התגובות שלהם זיהומים8,9,10,11. כך, יש דחיפה לפתח שיטות כדי לבודד אלה התאים גליה כדי להבין את הפונקציות שלהם בנפרד.
יש כמה דגמים חלופיים כדי ללמוד תאים גליה ולא התרבויות הראשיות, כמו לספירת תאים מונצח ומודלים vivo. עם זאת, תאים מונצח נוטים יותר לעבור שינויים גנטיים נסחף מורפולוגיים, בעוד במחקרים vivo להטיל תנאים מניפולציה מוגבלת. לעומת זאת, התרבויות הראשיות קל לטפל, טוב יותר להידמות vivo תאים וגם לאפשר לנו לשלוט גורמים ניסיוניים12,13. כאן, אנו לתאר הנחיות על איך לחלץ, לשמור ולנתק את מורטין אסטרוציטים ואת התאים הראשוניים מיקרוגלייה באותו פרוטוקול. יתרה מזאת, אנו גם מספקים דוגמאות לעבודה עם זיהום פרוטותים בתרבויות אלה.
תאי ה-cn שחולצו מעכברים הנמצאים במצב של עד 3 ימים, היו מתורבתים במשך 14 יום על מדיה דיפרנציאלית המאפשרת צמיחה מועדפים של התאים ה אסטרוציטים ו מיקרוגלייה. מאז השאר מיקרוגלייה מעל האסטרוציטים המצורפת, אוכלוסיות תאים היו מונתק מכנית בחממה מסלולית. לאחר מכן, אספנו את כל הסופרנטנט המכיל מיקרוגלייה וטריפסין שנוספו לניתוק האסטרוציטים. תאים גליה מבודדים היו פנופנזה בדרך כלל הוערך על ידי cy, לנסות ומצופה על פי הניסוי הרצוי.
כמו כן סיפקנו דוגמאות על איך להדביק אלה מיקרוגלייה מבודדים ו אסטרוציטים עם טפילים פרוטותים. T. gondii הוא מאוד נוירוטרופי פרוטומי אחראי לטוקסופלזמוזיס14, בעוד T. cruzאני אחראי על מחלת הצ אשר יכול להיות מוביל להתפתחות של הפרעות נוירולוגיות בתוך המוח15,16. יתר על כן, זה גם דווח כי זיהום עם T. gondii17,18 או T. cruzi19,20,21 היו הגורם אני של מוות בחולים בסיכון חיסוני. לכן, ההסבר של התפקיד החיסוני של התאים גליה מתוך ה-cn בשליטה בזיהומים פרוטותים הוא בעל חשיבות רבה.

<table><tbody><tr><td>70% אתנול</td><td>Din&acirc; נציץ Qu&iacute; נציץ עכשווי; חתול nea</td><td>: 2231</td><td>לעקר</td></tr><tr><td>75 ס"מ 2 בקבוק</td><td>קורנינג</td><td>חתול: 430720U</td><td>חומר פלסטי</td></tr><tr><td>96 באר צלחת תרבית תאים</td><td>גריינר Cellstar</td><td>Cat: 655090</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד (NH4Cl)</td><td>Din&acirc; נציץ Qu&iacute; נציץ עכשווי; חתול nea</td><td>: C10337.01.AH</td><td>הסר נוגדן אוטופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>נגד GFAP</td><td>Abcam</td><td>Cat.: ab49874</td><td>אימונופלואורסצנציה נוגדן בקבוק</td></tr><tr><td>מסנן עליון 0.22 &mu; מ"מ CA</td><td>קורנינג</td><td>חתול: 430513</td><td>תרבית מסנן בינוני</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>חתול: A7906</td><td>FACS הכנת חוצץ</td></tr><tr><td>CD11b (FITC)</td> <td>BD Pharmigen</td><td>Cat.: 553310</td><td>נוגדן ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>CD45 (PE)</td> <td>Invitrogen</td><td>Cat.: 12-0451-83</td><td>נוגדן ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>חתול: 5810R</td><td>צנטריפוגה צנטריפוגה</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>צנטריפוגה</td></tr><tr><td>Class II ארון בטיחות ביולוגית</td><td>Pachane</td><td>Cat: 200</td><td>ארון בטיחות ביולוגית להליכים סטריליים</td></tr><tr><td>CO2 חממה</td><td></td><td>ThermoScientific דגם: 3110</td><td>תחזוקת תאים ראשוניים</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>חתול: 430766</td><td>חומר פלסטי</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>חתול: 352070</td><td>חומר פלסטי</td></tr><tr><td>מונה תאים אוטומטי</td><td>של רוזנת Invitrogen</td><td>Cat: C10281</td><td>מונה תאים</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: D1306</td><td>אימונופלואורסצנציה אנטידובי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיגיטלי מצלמת</td><td>ניקון</td><td>חתול: DS-RI1</td><td>צלם תמונות במיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Cat: 12800-058</td><td>מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>חתול: E9884</td><td>FACS הכנת חיץ</td></tr><tr><td>F12 תערובת חומרים מזינים</td><td>Gibco</td><td>Cat: 21700-026</td><td>מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>ציטומטר זרימה</td><td>בלתי זמין</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>LGC ביוטכנולוגיה</td><td>Cat: 10-bio500-1</td><td>תוסף מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>Flow Jo (תוכנה)</td> <td>Flow Jo</td><td>גרסת: זרימה Jo_9.9.4</td><td>ניתוח נתונים</td></tr> אור <tr><td>פלואורסצנטי</td><td>אינטנסיבי ניקון</td><td>חתול: C-HGFI</td><td>מקור פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>GFAP (APC)</td> <td>Invitrogen</td><td>Cat.: 50-9892-82</td><td>נוגדן ציטומטריה זרימה</td></tr><tr><td>עז - אנטי עכבר IgG (FITC)</td> <td>Kirkeegood& מעבדת פרי (KPL)</td> <td>קטלוג: 172-1806</td><td>אימונופלואורסצנציה נוגדת</td></tr><tr><td>HBSS - תמיסת המלח המאוזנת של האנק</td><td>ג'יבקו</td><td>חתול: 14175079</td><td>מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>חתול: H4034</td><td>תוסף בינוני תרבית תאים</td></tr><tr><td>מאגר קיבוע IC</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8222-49</td><td>קיבוע תאים לזרימה ציטומטריה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>ניקון</td><td>דגם: ECLIPSE TS100</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Crist&aacute; </td><td>lia Cat: 21.2665</td> חומר <td>הרדמה</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סינת'ס</td><td>בשאיפה חתול: 01A1085.01.BJ</td><td>קיבוע לאימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>מיקרו מרית</td><td>ABC נירוסטה</td><td>חומר כירורגי</td><td>בלתי זמין</td></tr><tr><td>Microtube 1.5 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>Cat: MCT-150-C</td><td>חומר פלסטי</td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי (mAb) 2C2 anti-Ssp-4</td><td>לא מסחרי</td><td>לא מסחרי</td><td>תרופת נגד אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>פיפטה רב-ערוצית (p200)</td><td>קורנינג</td><td>קאט: 751630124</td><td>ריאגנטים לפיפטה</td></tr><tr><td>NIS Elements תוכנה</td><td>Nikon</td><td>גרסה 4.0</td><td>לרכוש ולנתח תמונות</td></tr><tr><td>חלב דל שומן</td><td>Nestl&eacute;</td><td>חתול: 9442405</td><td>תמיסת חסימה לאימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>חממת שייקר אורביטלית</td> דגם <td>תרמו-מדעי</td><td>: 481 חתול: 11</td><td>ניתוק מיקרוגליה מאסטרוציטים</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>חתול: P6148</td><td>קיבוע לאימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>PBS</td><td>לא מסחרי</td><td></td><td>לא מסחרי מאגר ניטרלי</td></tr><tr><td>פניצילין G</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>חתול: P-7794</td><td>תוסף בינוני לתרבית תאים</td></tr><tr><td>מאגר פרמביליזציה (10x)</td> <td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8333-56</td><td>חדירות תאים לצלחת פטרי ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>60 מ"מ x 15 מ"מ (חד פעמי, סטרילי)</td> <td>Prolab</td><td>Cat: 0303-8</td><td>מד pH של חומר פלסטי</td></tr><tr><td></td><td>Kasvi</td><td>K39-1014B</td><td>כיול תמיסת pH</td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני</td><td>Gibco</td><td>Cat: 31800-014</td><td>מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>ABC חתול אל חלד</td><td>: LO9-W4</td><td>חומר כירורגי</td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 10 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>חתול: 4101</td><td>חומר פלסטי</td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 5 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>חתול: 4051</td><td>חומר פלסטי</td></tr><tr><td>פיפטה חד ערוצית (p1000)</td> <td>גילסון פיפטמן</td><td>חתול: F123602</td><td>ריאגנטים פיפטה</td></tr><tr><td>יחיד ערוץ פיפטה (p200)</td><td>גילסון פיפטמן</td><td>חתול: F123601</td><td>ריאגנטים פיפטה</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>חתול: S6297</td><td>תוסף בינוני תרבית תאים</td></tr><tr><td>סטרפטומיצין סולפט מלח</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>חתול: S9137</td><td>תוסף בינוני תרבית תאים</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>חתול: T9284</td><td>חדירות לאימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>Cat: 27250-018</td> פינצטה <td>של אנזימי עיכול</td></tr><tr><td></td><td>ABC נירוסטה</td><td>חתול: L28-P4-172</td><td>חומר כירורגי</td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>Novatecnica</td><td>דגם: 09020095</td><td>לעכל רקמה ב-37 מעלות; C עם טריפסין</td></tr></tbody></table>

בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes ו מיקרוגלייה הם התאים השופעים ביותר גליה. הם אחראים על תמיכה פיזיולוגית והומאוסטזיס תחזוקה במערכת העצבים המרכזית (CN). העדויות הגדלות של מעורבות שלהם בשליטה של מחלות זיהומיות להצדיק את העניין המתעוררים לשיפור של מתודולוגיות כדי לבודד אסטרוציטים הראשי מיקרוגליה כדי להעריך את התגובות שלהם זיהומים המשפיעים על ה-cn. בהתחשב ההשפעה של טריאנוסומה cruzi (t. cruzi) ו טוקסופלזמה gondii (t. gondii) זיהום ב-cn, כאן אנו מספקים שיטה לחלץ, לתחזק, לנתק ולהדביק murine האסטרוציטים ותאים מיקרוגלייה עם טפילים פרוטותים. תאים שחולצו מתוך היילוד מתוחזקות בתוך מבחנה 14 ימים עם החלפת מדיה דיפרנציאלית תקופתית. Astrocytes ו מיקרוגלייה מתקבלים באותו פרוטוקול החילוץ על ידי דיסוציאציה מכנית. לאחר פנוטיפים על ידי הזרימה cy, לנסות, תאים נגועים בטפילים פרוטותים. שיעור הזיהום נקבע על ידי מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית בנקודות זמן שונות, ובכך מאפשר הערכה של היכולת הדיפרנציאלית של תאי גליה כדי לשלוט על הפלישה פרוטוזוא ושכפול. טכניקות אלה מייצגות פשוטה, שיטות זולות ויעילות כדי ללמוד את התגובות של אסטרוציטים ו מיקרוגלייה לזיהומים, פתיחת השדה עבור ניתוח נוירואימונולוגיה נוספת.

ביוםה -14, התרבות של התאים הגליאל (איור 1א) עברה דיסוציאציהמכנית. אוכלוסיות מבודדות תאים נותחו על ידי הזרמת cy, לדברי CD11b, CD45 ו GFAP סמנים. אנו יכולים להתבונן טוהר של 89.5% עבור האוכלוסייה אסטרוציט ו 96.6% עבור האוכלוסייה מיקרוגלייה (איור 1B). לאחר בידוד, תאים היו מצופים בצלחת 96-היטב שטוח ואחרי 24 שעות הם היו מוכנים להידבק על ידי t. cruzi או t. gondii על פי פרוטוקולי זיהום בהתאמה. כאן סיפקנו זמן...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להנחות כיצד לחלץ, לתחזק, ו הנתק מורטין אסטרוציט ו מיקרוגליה תאים ממערכת העצבים המרכזית, ואחריו זיהום עם טפילים פרוטותים.

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה המתמקדת בחילוץ במקביל לשתי אוכלוסיות תאי הגלייה הנפוצות ביותר, אסטרוציטים ומיקרוגליה, מעכברים לאחר לידה. השיטה שלנו שונה מאחרים שתוארו בעבר פרוטוקולים לבידוד אסטרוציטים ומיקרוגליה מכיוון שאנו מתמקדים בהשגת ובידוד שני סוגי התאים באותו חילוץ באותו מצב, ובכך לייעל את השימוש בבעלי חיים ניסיוניים ולשפר את המחקר של תפקידים יחסיים עבור תאים אלה בהקשרים אימונולוגיים. פרוטוקול זה יכול להיות שימושי עבור טוב יותר לחקור microglia ותפקידי אסטרוציטים בהקשרים רבים ומחלות במערכת העצבים המרכזית כגון אלצהיימר, פרקינסון, וזיהומים על ידי למשל טפילי פרוטוזואה או וירוסים.קבלת ובידול שני סוגי התאים מאותו מיצוי רצוי להעריך את התפקיד היחסי של כל תת-קבוצה של תא הקשרים אימונולוגיים כגון זיהום או דלקת. אנשים צריכים להיות זהירים במיוחד במהלך הסרת המוח ורקמות עצבים שוטף, אבל אני מאמין כי עם פרוטוקול זה ואת הווידאו ירה, אנשים לא ייאבקו. פרוטוקול זה יכול להיות ארוך בהתאם למספר בעלי החיים כדי לחלץ את קליפת המוח כדי להיות מוכנים לבלות כארבע שעות או יותר.ביום הראשון, הכינו HBSS ו-HBSS טהורים ועוד 10% FBS מושבת בחום. הכן DMEM F12 בתוספת ולסנן אותו עם מסנן 0.22 מיקרון. לעקר את כל המכשירים הכירורגיים autoclave ולהשתמש 70% אתנול במהלך ההליך.שים עכברים שזה עתה נולדו בתא אטום המכיל כותנה ספוגה isoflurane במשך חמש דקות להרדמה עמוקה. לרסס את גור העכבר עם 70% אתנול לערוף את החיה עם מספריים. בצע חתך קשתי עם מספריים לאורך הגולגולת כדי לפתוח אותו ולחשוף את המוח.הסר את המוח באמצעות מרית מיקרו כדי לשמור על שלמות המוח. מניחים את המוח בצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ יבשה. באמצעות מרית מיקרו, להסיר את נורת הריח ואת המוח הקטן.מעבירים את קליפת המוח לצלחת פטרי אחרת המכילה שני מיליליטר של HBSS ועוד 10%FBS. חותכים את רקמת המוח לחתיכות קטנות עם מספריים סטריליים ושימוש micropipette P1000, להעביר כל רקמת המוח עם HBSS בתוספת 10% FBS לצינורות חרוט שונים 15 מיליליטר. במידת הצורך, השתמש ב- HBSS ועוד 10%FBS כדי למלא את אמצעי האחסון הסופי לשני מיליליטר.לשטוף את רקמת המוח לחתוך עם שלושה מיליליטר של HBSS בתוספת 10% FBS עבור כל צינור. לאחר ההשמדה, הסר בזהירות את העל-טבעי. חזור על השטיפה עם HBSS ועוד 10%FBS שלוש פעמים נוספות.ואז לשטוף עם שלושה מיליליטר של HBSS טהור שלוש פעמים. לאחר ההשמדה, הסר בזהירות את העל-טבעי. לאחר מכן, מוסיפים שלושה מיליליטר של טריפסין ומ מניחים את הצינור באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בעדינות לנער את הצינורות כל חמש דקות.זה מעכל את הרקמה שנאספה. הימנע בועות. כדי להשבית את טריפסין, לשטוף את הרקמה עם שלושה מיליליטר של HBSS בתוספת 10% FBS ולאחר decantation של הרקמה, להסיר בזהירות את supernatant.חזור על שטיפה זו שלוש פעמים. לאחר מכן לשטוף את הרקמה עם שלושה מיליליטר של HBSS טהור ולחזור פעמיים נוספות. לאחר ניתוח הרקמה, הסר בזהירות את העל-טבעי.הוסף שבעה מיליליטר של HBSS טהור הומוגניזציה של הרקמה דרך מעברים רצופים פיפטים, תחילה עם פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר, ואחריו פיפט חמישה מיליליטר, ולבסוף עם micropipette P1000. לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה הצינורות ב 450 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור עם ארבעה מיליליטר של HBSS ועוד 10%FBS לכל צינור.מעבירים את התאים לבקבוק T75 שטופל מראש באופן מסחרי להייתוך מיטבי של תאים. מניחים את הבקבוק באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך 30 דקות עבור דבקות. לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של DMEM F12 בתוספת לבקבוק והדגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני במשך שני לילות.ביום השלישי, להסיר שבעה מיליליטר של מדיום תרבות מן הבקבוק T75 ולהוסיף שבעה מיליליטר של DMEM F12 טרי בתוספת. תחזיר את הבקבוקון לאנקובטור. ביום החמישי, כדי להסיר פסולת ותאים לא עקביים, החלף את כל המדיום מבקבוק T75 עם 14 מיליליטר של DMEM F12 טרי בתוספת.ואז כל 48 שעות, להסיר שישה מיליליטר של supernatant ולהוסיף שבעה מיליליטר של טרי בתוספת DMEM F12 בינוני עד היום 14 של תרבות. ביום 14, לאחר הסרת שישה מיליליטר של על טבעי והוספת שבעה מיליליטר של טרי בתוספת DMEM F12 בינוני, לסגור את בקבוקי T75 בחוזקה עם עטיפת פלסטיק. מניחים אותם בשייקר מסלולית הרצפה ב 200 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס לילה כדי לנטרל מכנית microglia מאסטרוציטים.ביום ה -15, לקחת את flasks מן השייקר במרץ לשטוף אותם עם המדיום שלהם על מנת לייעל את דיסוציאציה התא לקצור את המספר המרבי של microglia. ואז לאסוף את supernatant ולהעביר אותו לצינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר מכן, מוסיפים ארבעה מיליליטר של טריפסין לכל בקבוק ודגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס על מנת לנתק את האסטרוציטים.לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של DMEM F12 בתוספת כדי להשבית את טריפסין. לשטוף את flasks עם המדיום שלהם ולהעביר את התוכן צינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה כל הצינורות המכילים microglia דיסוציאציה או אסטרוציטים ב 450 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.השלך את העל-טבעי. תן שימוש חוזר את גלולת microglia במיליליטר אחד של DMEM F12 בתוספת ואת האסטרוציטים ב 10 מיליליטר של DMEM F12 בתוספת. המשך לספירת תאים בתא Neubauer או מונה תאים אוטומטי.צלחת התאים עם DMEM F12 בתוספת בצפיפות הרצויה בצלחת תרבות תא שטוחה מראש. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות כדי לאפשר להם לצרף. ביום ה-14, תרבות תאי הגלישה עברה דיסוציאציה מכנית.הוא נצפה עם טוהר של 89.5% עבור אוכלוסיית האסטרוציטים ו-96.6% עבור אוכלוסיית המיקרוגליה. אסטרוציטים ו microglia מעכברי C57BL6 נדבקו T.cruzi Y.לאחר שעתיים, 48 שעות, ו 96 שעות, התאים תוקנו עם מתנול מוכתם עם סמן גרעין התא DAPI ואנטי GFAP. השימוש בטפילים מהונדסים גנטית המבטאת כתבים פלואורסצנטיים או טפילים המסומנים בנוגדנים פלואורסצנטיים ספציפיים שיפר את המיקרוסקופיה immunofluorescence מכיוון שהם נבדלים טוב יותר מגרעין התא.שתי דוגמאות מוצגות כאן. זן T.gondii RH מבטא באופן מכונן זן YFP ו- T.cruzi Y מוכתם בנוגדן חד שבטי לא מסחרי 2C2 נגד SSP4 חלבון. חשוב לשטוף בזהירות את התאים כדי לא לאבד צבירות תאים.לאחר זיהום בתאי גליה, ניתן להעריך פרמטרים אחרים כגון ELISA לייצור ציטוקין נוכח על טבעי, כתמים מערביים עבור ביטוי חלבון, ו PCR כמותי בזמן אמת להערכת שעתוק RNA. שאלות רבות הקשורות לתפקוד של תאי גלייה, למשל חילוף החומרים שלהם, התגובה החיסונית, וביולוגיה של התא עצמו ניתן לטפל ולהרוויח על ידי טכניקה זו. כל טפילי פרוטוזואה מסוגלים להדביק תאים אנושיים, כמו גם תאי עכבר תרבות ולכן חשוב להיות זהיר בעת טיפול טפיל זה.

concomitant-isolation-primary-astrocytes-microglia-for-protozoa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בידוד microglia העיקרית מן ההטרוגניות הסלולר של המוח חיוני לחקור את תפקידם של שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד מכני תאים משולבים בתרבות הטכניקה המספק תשואה גבוהה טוהר גבוהה, תאים קיימא microglial...

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

האסטרוציטים הוכרו כתאים צדדיים המשתתפים בתהליכים ביולוגיים בסיסיים שחיוניים להתפתחות המוח ותפקודו תקין, ותיקון מערכת עצבים מרכזי. כאן אנו מציגים הליך מהיר לקבלת תרבויות astrocyte עכבר טהורות ללמוד ביולוגיה בכיתה זו גדולה של תאים במערכת עצבים מרכזיים.

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

שיטה לבידוד של לויקוציטים הדלקתי חסיד מכלי דם...

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

לתאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן (AdMSCs) יש תכונות אימונומודולטוריות חזקות השימושיות לטיפול במחלות הקשורות לדלקת. אנו מדגימים כיצד לבודד ולגדל בתרבית של AdMSCs ותאי גליה מעורבים ראשוניים, לעורר AdMSCs כדי לווסת גנים אנטי דלקתיים וגורמי גדילה, להעריך הגירה של AdMSCs, ותרבית משותפת של AdMSCs עם גליה מעורבת ראשונית נגועה בפריון.

תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן מתורבתים יחד עם גליה מעורבת ראשונית כדי להפחית דלקת הנגרמת על ידי פריונים

נכון להיום, פרוטוקולים לבידוד סימולטני של כל סוגי התאים העיקריים השוכנים במערכת העצבים המרכזית מאותו עכבר הם דרישה שלא נענתה. הפרוטוקול מראה הליך ישים בעכברים אוטואימוניים נאיביים וניסיוניים של אנצפלומיאליטיס לחקור רשתות סלולריות מורכבות במהלך דלקת עצבית ובו זמנית להפחית את מספר העכברים הנדרש.

בידוד סימולטני של סוגי תאים עיקריים תושבי מערכת העצבים המרכזית מעכברים אוטואימוניים בוגרים

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.

בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק

למדו פרוטוקול לבידוד אסטרוציטים ומיקרוגליה ראשוניים מקליפות מוח של עכברים נולדים. השיטה מאפשרת השוואת תגובות תאי גליה לזיהומים טפיליים במערכת העצבים המרכזית באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל

גלה סרטונים נוספים