ככמת את רעילות הציטוהילווקיוס האורמית נגד פולימורציטים אנושיות

סטפילוקוקוס אוראוס הוא חיידק גרם חיובי המייצר מגוון רחב של גורמי ארסיות המקדמים פתוגנזה. אלה כוללים לויקוטוקסינים דו-רכיבים המשבשים את שלמות הממברנה של לויקוציטים פולימורפונוקלאריים, הנקראים גם PMNs או נויטרופילים. סרטון זה ממחיש את הבידוד של PMNs מדם שלם אנושי ושתי בדיקות ברורות לכימות ציטוקסיות S.aureus נגד תאים חיסוניים המולדים החשובים האלה.

ניתן לבצע בדיקות אלה עם ציוד מעבדה סטנדרטי והם ניתנים להתאמה בקלות כדי לבחון היבטים אחרים של אינטראקציה פתוגן המארח. ניסויים אלה ישתמשו בדם שלם הנמשך מתורמים אנושיים וידרשו אישור של הוועדה המוסדית המתאימה או ועדת הבדיקה, כמו גם הצהרה כי הושגה הסכמה מדעת מכל המשתתפים. הצעד הראשון של הליך זה הוא בידוד של נויטרופילים באמצעות שיפוע צנטריפוגה וצפיפות.

ראשית, להביא 50 מיליליטר של 3%dextran 0.9% נתרן כלורי, 35 מיליליטר של 0.9% נתרן כלורי, 20 מיליליטר של 1.8% נתרן כלורי, 12 מיליליטר של 1.077 גרם לכל פתרון ficoll מיליליטר ו 20 מיליליטר של מים לטמפרטורת החדר. מעבירים 25 מיליליטר של דם אנושי שלם שנמשך טרי לשני צינורות צנטריפוגה חרוטיים. שלבו 25 מיליליטר של דם שלם טרי עם נפח שווה ערך של 25 מיליליטר לטמפרטורת החדר, 3%dextran, 0.9% נתרן כלורי ביחס של אחד לאחד.

מערבבים על ידי נדנדה בעדינות כל צינור חרוט 50 מיליליטר ולאחר מכן לתת לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר, יופיעו שתי שכבות נפרדות. מעבירים את השכבה העליונה של כל תערובת דם דקסטרן לצינורות חרוטיים חדשים של 50 מיליליטר.

צנטריפוגה ב 450 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם הפסקות נמוכות או לא. בזהירות שאף הן על טבעי להשליך מבלי להפריע כדורי התא. בעדינות resuspend כל גלולת תא בשני מיליליטר של 0.9% נתרן כלורי.

שלב את כדורי resuspended בחרוט יחיד, 50 מיליליטר ולאחר מכן להוסיף את הנותרים 0.9% נתרן כלורי לנפח הסופי של 35 מיליליטר. בזהירות underlay 10 מיליליטר של 1.077 גרם לכל פתרון ficoll מיליליטר מתחת מתלי התא באמצעות פיפטה יד. לאחר ספינינג של 450 גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עם הפסקות נמוכות או ללא הפסקות, שאף בעדינות את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור התא, כפי שהוצג קודם לכן.

Lyse תאי הדם האדומים על ידי שימוש חוזר את גלולת התא ב 20 מיליליטר של מים בטמפרטורת החדר. מערבבים בעדינות על ידי נדנדה במשך 30 שניות. מיד להוסיף 20 מיליליטר של 1.8% נתרן כלורי מדגם צנטריפוגה ב 450 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

בזהירות שאף על טבעי כפי שמוצג קודם לכן. בעדינות resuspend גלולת התא בשתי מיליליטר טמפרטורת החדר RPMI ולהמקם על קרח. לספור תאים באמצעות מד hemacytometer.

יש להשתמש מחדש ב-PMNs מטוהרים בריכוז של פי 10 עד 7 תאים למיליליטר עם RPMI קר כקרח ולשמור על קרח. שלב 100 מיקרוליטרים של PMNs מטוהרים עם 300 מיקרוליטרים של DPBS, המכיל מיקרוליטר אחד של כתם יודיד פרופיד בשני צינורות ציטומטריה זרימה משוכפלים. לשליטה חיובית, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של 0.5% פתרון טריטון X-100 לאחד מצינורות ציטומיית הזרימה וערבבו היטב.

השתמש בציטומטריית זרימה כדי למדוד את פיזור קדימה, פיזור צד וכתמים יודיד פרופידיום כדי לקבוע את הטוהר והשמות של PMNs מבודדים. יש להשתמש רק בהכנות PMN מעל 98%pure ומעל 95%propidium iodide שלילי. לפרוטוקול המתאר את הבידוד של סרום אנושי רגיל, עיין בכתב היד המלא.

הכינו צלחת של 96 בארות לתיקטוסיות PMN על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של סרום אנושי מבודד של 20% מדולל ב- DPBS ל בארות בודדות שישמשו בהסקה זו. הקפד לכלול לפחות אחד שלילי שליטה היטב כי יקבל רק מדיה לפחות אחד שליטה חיובית היטב כי יקבל 0.05% טריטון X.Incubate את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את הבארות מקודד פעמיים עם 100 microliters של קרח קר DPBS ולה מניחים צלחת על קרח.

הסר את כל DPBS שיורית מ בארות צלחת בעדינות להוסיף 100 microliters של PMNs אנושיים מטוהרים באחת פעמים 10 לתאים 7 למיליליטר לכל היטב מקודד. אפשר נויטרופילים מצופים להתיישב על ידי השארת אותם על קרח לפחות חמש דקות לפני השימוש במסיונות cytotoxicity הבאים. סעיף זה מתאר התרעה כי מכמת את הציטוקסיקיות של חלבונים חוץ תאיים המיוצרים על ידי staph aureus נגד PMNs אנושיים.

תרבות S.aureus לילה בתקשורת המתאימה באמצעות אינקובטור רועד להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס יום לפני הניסוי. תת תרבות S.aureus על ידי ביצוע דילול אחד עד 100 של תרבויות חיידקים לילה עם מדיה טרייה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עד חיידקים להגיע לשלב צמיחה נייח מוקדם.

לאחר חמש שעות של צמיחה, להעביר מיליליטר אחד של תת תרבות S.aureus לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה ב 5, 000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, שאף על-טבעיים. להעביר על-טבעיים שאפו דרך מסנן מזרק מיקרון 0.22 לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר ולמקום על קרח.

בצע דילול סדרתי של על-טבעיים עם מדיה קרה כקרח המשמשת לתרבות אאוראוס סטף. הוסף בעדינות דגימות על-טבעיות או מדיה שהושאלו לפקדים שליליים וחיוביים ל בארות בודדות של צלחת של 96 בארות המכילה PMNs על קרח, כמתואר קודם לכן. בעדינות צלחת רוק להפיץ על טבעי בארות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס.

בזמנים הרצויים, להסיר צלחת מן החממה מניחים על קרח. הוסף 300 מיקרוליטרים של DPBS קר כקרח המכיל מיקרוליטר אחד של יודיד פרופידיום לכל צינור ציטומטריה זרימה. להעביר את הדגימות לזרום צינורות ציטומטריה על קרח.

עבור באר הבקרה החיובית, הוסף 20 מיקרוליטרים של 10% טריטון X לדגימה לפני המעבר לצינור ציטומטריה של זרימה. נתח כתמי פרופידיום יודיד של PMNs שיכורים באמצעות ציטומטריית זרימה. סעיף זה מתאר תדהמה כי מכמת את הציטוקסיקיות של S.aureus בעקבות phagocytosis על ידי PMNs אנושיים.

עקומות גדילה המוגדרות על ידי הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר ואת הריכוז של חיידקים חייב להיקבע עבור זני Aureus Staph הרלוונטי לפני השימוש ב- assay זה. התחל תרבויות לילה של זנים S.aureus וחיידקים תת תרבות, כמתואר קודם לכן. לאחר aureus Staph subcultured הגיע באמצע צמיחה אקספוננציאלית, להעביר מיליליטר אחד של חיידקי תרבות ל 1.5 צינור microcentrifuge מיליליטר צנטריפוגה ב 5, 000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לשטוף S.aureus על ידי שאפת supernatant שלה מבלי להפריע את גלולה מחדש את החיידקים גלולה ב DPBS מיליליטר אחד. מערבולת הדגימות במשך 30 שניות. צנטריפוגה הדגימות ב 5, 000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

כדי לחמצן את אוראוס Staph, תחילה תן שימוש חוזר את גלולת החיידקים במיליליטר אחד של 20% סרום אנושי. ואז דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה במשך 15 דקות. לשטוף שוורות Staph aureus בעקבות צנטריפוגה כפי שמוצג קודם לכן.

מדולל זני Staph aureus oxenized לאחת פעמים 10 ליחידות יוצרות המושבה השמינית, CFUs למיליליטר, עם RPMI קר כקרח. Vortex המדגם במשך 30 שניות ומקום על קרח. אשר את הריכוזים של Aureus Staph המשמשים לתשקיף אלה על ידי ציפוי אחד עד 10 דילולים סדרתיים של חיידקים על אגר.

הוסיפו בעדינות 100 מיקרוליטרים ל הבאר של כל זן Staph aureus, או RPMI לפקדים חיוביים ושליליים, ל-PMNs בצלחת של 96 באר על קרח החל מהשבב 1.14. צלחת סלע בעדינות להפיץ aureus סטף בארות. לסנכרן phagocytosis על ידי צלחת צנטריפוגה ב 500 גרם במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס וצלחת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מיד לאחר צנטריפוגה כמו זמן אפס.

בנקודות הזמן הרצויות, לשים את הצלחת על הקרח ולהוסיף 200 microliters של קרח קר DPBS המכיל אחד microliter propidium יודיד לכל צינור cytometry זרימה ואז להעביר דגימות הצינור המתאים שלהם. נתח דגימות עבור כתמי פרופידיום יודיד באמצעות ציטומטריית זרימה כמתואר ב 2.8 ו 2.9. התמלול של לויקוטוקסינים דו-רכיביים שמכוונים ל-PMNs אנושיים על ידי Staph aureus דורש את מערכת הרכיבים SA או S2 כדי להדגים את התועלת של הראיה המתוארת לכימות ציטוקוקסיות של Staph aureus נגד PMNs אנושיים.

ניסויים אלה בוצעו עם מבודד Staph aureus רלוונטי קלינית שזוהה כ- USA300 במוטנט מחיקה איסולוגניים של SA או S בזן זה. החלונית השמאלית מתארת PMNs מטוהרים והחלונית הימנית מתארת דגימות מזוהמות במכוון כדוגמה. PMNs מבודדים באמצעות ההליכים המתוארים בסעיף אחד של פרוטוקול זה היו מוכתמים יודיד פרופיד ונבדקו באמצעות ציטומטריה זרימה.

חלקות פיזור קדימה וצד שימשו כדי לזהות זיהום של PMNs מטוהרים על ידי מונוציטים או לימפוציטים במשך שנים 1A ו 1B. שלמות PMN נקבע באמצעות כתמי יודיד פרופיד. באמצעות השיטה המתוארת של טיהור PMN אנושי, אנו יכולים לבודד באופן עקבי חמש פעמים 10 עד 7 עד 11 פעמים 10 כדי PMNs 8 כי הם מעל 98% טהור והם מעל 95%propidium יודיד שלילי.

הציטוקסיות של חלבונים חוץ-תאיים המיוצרים על ידי USA300 והמוטנטים AsaeR/S נבדקו מול PMNs מטוהרים. ניסויים אלה מדגימים עלייה תלוית ריכוז בהכתמת פרופידיום יודיד של PMNs מטוהרים לאחר 30 דקות של שיכרון עם חלבונים חוץ תאיים המיוצרים על ידי USA300, אך לא עם מוטציית AsaeR /S. ניסויים נוספים הראו עלייה מתמדת בשיעור PMNs חיוביים פרופידיום יודיד בעקבות שיכרון על ידי ארה"ב300 חלבונים חוץ תאיים כי מישור לאחר כ 30 דקות.

כתמי פרופידיום יודיד מינימליים של PMNs אנושיים צוינו בכל נקודות הזמן בעקבות חשיפה לחלבונים חוץ-תאיים המיוצרים על ידי מוטנט AsaeR/S. אחרון, ציטוקסיות של ארה"ב300 ו מוטציה AsaeR / S נגד PMNs בעקבות phagocytosis מסונכרן נבדק, עלייה תלויה בריכוז בשיעור של pmNs חיוביים פרופידיום יודיד נצפתה 90 דקות לאחר phagocytosis של ארה"ב300. באופן משמעותי פחות PMNs היו פרופידיום יודיד חיובי בעקבות phagocytosis של מוטציה AsaeR / S.

ספירת ארה"ב300 ו AsaeR / S מוטציה inoculum שימש בכל אחד מהניסויים האלה הוכיחו כי הניגוד cytotoxicity בין זנים אלה לא נבע הבדלים בריכוז של חיידקים בשימוש. פרוטוקול זה מתאר את הטיהורים של PMNs מדם אנושי בשתי טכניקות נפרדות לכימות הציטוקסיות של S.aureus נגד תאים חיסוניים המולדים האלה. ההצלחה של הליכים אלה תהיה תלויה באיכות של PMNs מטוהרים ואת ההכנה המתאימה של חיידקים Staph aureus או supernatants.

אנא התייעץ עם כתב היד המלא לקבלת נקודות חשובות שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע הליכים אלה. USA300 הוא בידוד MRSA ארסי ואובדן AsaeR/S מפחית באופן דרמטי את שעתוק גורמי הארסיות שמכוונים ל-PMNs אנושיים, מה שהופך זנים אלה למודלים אידיאליים להשוואת ציטוקסיות באמצעות ההתמדה המתוארת. התאמת תנאי הגדילה, כמויות של על-טבעיים שנוספו, או יחס של חיידקים PMNs עשוי להידרש בעת שימוש זנים אחרים של Aureus Staph.