ערכת כלים חדשה להערכת פונקציות גנים באמצעות ייצוב מותנה של Cas9

שיטה זו מספקת עריכת גנים CRISPR-Cas9 מהירה ומבוקרת בטמפרטורה תחת מולקולה קטנה, Shield-1. הוא גם מציע פחות אפקטים מחוץ למטרה, רעילות תאים נמוכה יותר, וגם עריכת גנים מבוקרת פנימית גבוהה יותר כאשר משווים אותו להפעלה מכוננת של Cas9. היתרון העיקרי של חלקיק זה הוא כי זה יכול לשמש לאפיון של גנים חיוניים, כמו גם גנים הישרדות הגידול.

חוסר היציבות של DD-Cas9 אינו תלוי בביטויו, וזה מאפשר לגן העניין להתבטא במשותף תחת אותו מקדם. שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות במחקרי in vivo ו אין ויטרו. מגן-1 יכול גם לחדור דרך מחסום הדם - מוח, מה שמקל גם על חקר גנים המעורבים בהתפתחות המוח.

זרע באופן שווה תאי HEK293T בריאים בצפיפות של אחד עד שני מיליון תאים לכל צלחת תרבית רקמות 10 ס"מ באמצעות 10 מיליליטר של DMEM גלוקוז עם 10% FBS מסונן. לדגור על התאים באינקובטור תרבית הרקמות ב-5% פחמן דו-חמצני ו-37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות. למחרת, לאשר כי התאים הגיעו 70% השפעה על ידי מיקרוסקופיה Brightfield וכי הם מפוזרים באופן שווה על פני הצלחת.

שנה מדיה שעה לפני ההדבקה בנפח סופי של 10 מיליליטר. הכן שני צינורות עם 500 מיקרוליטרים של מדיה חמה. הוסף 25 מיקרוליטרים של ריאגנט transfection לצינור אחד, ודגר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.

לצינור השני, מוסיפים תערובת של פלסמידים. מערבבים צינור אחד עם צינור שני כדי ליצור תערובת transfection, ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. מוסיפים את תערובת הטרנספקטים טיפה לתרבות HEK293T ודגר את הצלחת באינקובטור תרבית הרקמות.

לאחר 18 שעות, בזהירות לשנות את המדיה ל 10 מיליליטר של DMEM טרי עם 10% FBS כדי להסיר את ריאגנט transfection. לדגור על התאים במשך 48 השעות הבאות. לאחר 48 שעות, לאסוף את supernatant עם מזרק 10 מיליליטר ולהעביר אותו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.

Aliquot הווירוס supernatant ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. לקביעת טיטר וירוס, זרע 5 מיליון HEK293T תאים לכל באר לתוך שתי לוחות שש באר. לדגור על שני הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני בן לילה כדי להגיע 50 עד 60% השפעה.

למחרת, השתמש באחת מלוחות ששת הבארות כדי לספור את התאים בשש הבארות. להפשיר את aliquot הווירוס שישמש לביצוע דילול סדרתי ולהוסיף שמונה מיקרוגרם למיליליטר של ריאגנט polybrene, להכין DMEM עם 10%FBS עבור דילול סדרתי של הנגיף, ולהוסיף ריאגנט polybrene. הכן שני מיליליטר של דילול סדרתי פי עשרה של lentivirus מ 0.1 ל 0.0001 בפוליברן המכיל מדיה.

הסר מדיה מן הצלחת שש טוב ולהוסיף מיליליטר אחד של דילול ויראלי לבארות, משאיר אחד היטב עם מדיה לבד כמו שליטה שלילית אחד היטב עם 100% וירוס. לדגור על התאים במשך 24 שעות. למחרת, להסיר את התקשורת עם הנגיף מן שש בארות צלחות ולשנות אותו לשני מיליליטר של DMEM טרי עם 10% FBS.

לדגור על התאים במשך 48 עד 72 שעות, התבוננות GFP עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי כל יום. לאחר 48 עד 72 שעות, לנתק את התאים ו resuspend אותם במאגר המרבי. השתמש בציטומטר זרימה כדי לקבוע את אחוז ביטוי GFP ולחשב את טיטר הווירוס באמצעות הנוסחה שניתנה בכתב היד של הטקסט.

צלחת קו התא של עניין צלחת 10 ס"מ ודגרה לילה כדי להגיע למפגש של 50 עד 60%ואז להדביק את התאים עם 500 עד 2, 000 microliters של חלקיקי וירוס בנפח כולל של 10 מיליליטר של מדיום תרבות. לדגור על התקשורת הוויראלית במשך 24 שעות. למחרת, שנה את המדיה הוויראלית למדיית תרבות, וקבע את אחוז התאים החיוביים של GFP באמצעות ציטומטריית זרימה.

בחר תאים חיוביים של GFP באמצעות BD FACSAria II למיון תאים. הרחב תאים שנבחרו באופן חיובי והקפיא את המלאי. צלחת התאים שנבחרו באופן חיובי ותאים untransduced ב 12-well לוחות בנפרד, 24 שעות לאחר ההדבקה.

המתן עד התאים לצרף ולשנות את המדיה למדיה תרבית התא המכיל 200 מגן ננומולר-1. החלף את המדיה בלוחות בתאים שהועברו ובלתי מועברים, והשאר שתי בארות לכל צלחת עם מדיה רגילה כשליטה שלילית. לדגור ולהפיק חלבונים מכל באר באפס, שתיים, שש, 12, 24, 48 ו-72 שעות לאחר הוספת מגן-1 לבארות.

לאחר מכן הסר את המדיה עם Shield-1 משאר הבארות ושנה אותה למדיה סלולרית רגילה. לאסוף את החלבונים מאותן בארות בשעתיים, שש ו -12 שעות לאחר שינוי התקשורת. האינדוקציה של חלבון Cas9 אושרה על ידי רמות הביטוי שלה להיות דומה בין התאים transduced והרכב, למרות נוכחות או היעדר מגן-1.

יש אינדוקציה מספקת של ביטוי Cas9 בקו התא A549 transduced שעתיים לאחר הטיפול עם Shield-1, אשר הופך זניח בתוך שש עד 12 שעות לאחר הנסיגה של Shield-1. תאי A549 שטופלו ב-Shield-1 ירדו במספרם לאחר 48 שעות מבלי להשפיע על דגימת רינלה, שאומתה על ידי אימונובלובלטינג באמצעות נוגדן נגד חלבון RPA3 המדולדל. היפוך עריכת גנים או מוטציות indel אושרו באמצעות נוקלאז מודד.

המבנה הווקטורי lentivirus שתוכנן היה מערכת bicistronic נושאת גן אחר של עניין תחת אותו מקדם EF-1a. חלבון פלואורסצנטי שונה, P2A, נוסף כדי לעקוב אחר תאים נגועים. הביטוי של חלבון mVenus נצפה ברכב ותאי A549 transduced, ללא תלות ביטוי DD-Cas9 וטיפול מגן-1.

התמרה יעילה של קו התא עם וקטור DD-Cas9 היא אחד השלבים הגבלת קצב, עבור תאי HEK293T בריאים ושימוש במספר המעבר הנמוך שלהם הוא קריטי. אופטימיזציה של היחס בין DD-Cas9 plasmid, פלסמיד אריזה, ו plasmid מעטפה חשוב מאוד עבור transfection אופטימלי. אבל לצד זה, גם את כמות Shield-1 כי הוא נחוץ כדי לייצב את תאי היעד DD-Cas9 הוא משהו שאתה צריך להיות זהיר.

DD-Cas9 עם Cre plasmid זמין גם, והוא יכול לשמש כדי ללמוד את האינטראקציות הגנטיות במחקרים vivo המבוססים על מערכת Cre-lox.