הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על איך לסנן את מדכאי השתקת RNA המופרשים על ידי פתוגנים צמחיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לספק בדיקות סינון מהירות, מדויקות ונרחבות לזיהוי מדכאי השתיקת RNA. מכינים תערובת אדמה בעציצים המורכבת מ-50% אזוב כבול, 30% פרליט ו-20% ורמיקולייט ואוטוקלאב ב-120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

משרים את האדמה האוטוקלאבת מתערבבת עם תות תב"א צמחי בגרם אחד לליטר ומפרקים אותם לסירים קטנים יותר המאוחסנים במגש גדול יותר. לזרוע אחד או שניים זרעים של Nicotiana bethamiana 16c על פני הקרקע של כל סיר. מכסים את המגש בכיפת פלסטיק ומאפשרים לזרעים לנבוט.

מניחים את המגש מתחת לחדרי צמיחה קלים ומבוקרי טמפרטורה עם טמפרטורה של 23 עד 25 מעלות צלזיוס, 50 עד 60% לחות יחסית, ופוטופריוד יום ארוך. לאחר שלושה עד ארבעה ימים, הזרעים נובטים. תוריד את כיפת הפלסטיק ותאפשר לשתילים לגדול באותם תנאים המשמשים לשלב הנביטה.

כל יומיים עד שלושה ימים, מוסיפים כמות מתאימה של מים שמירה על הקרקע לחה אבל לא השריה. כל 10 ימים, להוסיף דשן כדי לקדם צמיחה נוספת. לשמור על צמחים Nicotiana bethamiana 16c בתנאים נורמליים עד הצמחים יש לפחות חמישה עלים אמיתיים מפותחים לחלוטין ללא בית רם גלוי או ניצני פרחים ועלים יש מראה ירוק בריא.

השתמשו בצמחים בני 10 עד 14 ימים של Nicotiana bethamiana 16c להסחת RNA מערכתית ועלים בני שלושה עד ארבעה שבועות של Nicotiana bethamiana 16c להסחת RNA מקומית. השתמש טיפ כדי לבחור מושבה חיובית מצלחת LB לחסן את התאים לתוך צינור זכוכית המכיל חמישה מיליליטר של LB בינוני בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר Kanamycin ו 50 מיקרוגרם למיליליטר ריפאמפיצין. לגדל את התאים ב 30 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 200 סל"ד במשך 24 עד 48 שעות.

להעביר 100 microliters של התרבות לתוך חמישה מיליליטר של בינוני LB בתוספת אנטיביוטיקה אותו, 10 מילימולרים MES ב pH 5.6, ו 20 micromolar AS. לגדל את החיידקים ב 30 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 200 סל"ד במשך 16 עד 20 שעות. צנטריפוגה התאים ב 4, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות. השליכו את העל-טבעי והתינו מחדש את גלולת הכדור בשני מיליליטר של חיץ מגנזיום כלוריד 10 מילימולארי.

חזור על לשטוף כדי להבטיח הסרה מלאה של אנטיביוטיקה. לקבוע את הצפיפות של תרבות האגרובקטריום על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר. התאם את תרבות התאים עם מאגר מגנזיום כלוריד 10 מילימולארי ל- OD 600 של 1.5 עד 2.0.

הוסף 10 MES מילימולר ב pH 5.6 ו 150 micromolar AS לתרבות ההשעיה הסופית דגירה התאים בטמפרטורת החדר לפחות שלוש שעות בלי לרעוד. מערבבים כמויות שוות של תרבות אגרובקטריום המכילה חלבון פלואורסצנטי ירוק 35S עם תרבות אגרובקטריום המכילה מדכא וירוס פסיפס מלפפון 35S 2b, משפיע putative או וקטור ריק. באמצעות מזרק אחד מיליליטר ללא מחט, בזהירות ולאט לאט לחדור את השעיות אגרובקטריום מעורב על הצדדים abaxial של ניקוטיאנה bethamiana 16c עלים.

הסר את ההשעיה החיידקית הנותרת מן העלים עם מגבונים רקמות רכות להקיף את השוליים של טלאים הסתננו עם עט סמן. שלושה עד ארבעה ימים לאחר החדירה, השתמש במנורה אולטרה סגולה גל ארוך כדי לזהות חזותית פלואורסצנטיות GFP בחלקות הסתננו של עלים. שבועיים לאחר החדירה, השתמש במנורה כדי לזהות עלים שגודלו לאחרונה של הצמח כולו לה השתלת RNA מערכתית.

כדי לבודד את ה-RNA הכולל מרמת העלה בארבעה עד שבעה ימים לאחר החדירה, לאסוף את רקמות העלה מן מדבקות Nicotiana bethamiana 16c הסתננו לתוך מרגמה. מניחים חנקן נוזלי לתוך המרגמה וטוחנים את הרקמה לאבקה דקה עם מוט טחינה ומעבירים את האבקה לצינור סטרילי של שני מיליליטר. מיד להוסיף את רגנט בידוד RNA בנפח של מיליליטר אחד לכל 100 מיליגרם של רקמה לצינור מדגם ברדס, מערבולת במרץ הומוגנית, דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.

מוסיפים כלורופורם בנפח של 200 מיקרוליטר למיליליטר אחד של ריאגנט בידוד RNA לכל צינור במכסה המנוע, רועדים במרץ במשך 15 שניות, ודוגרים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. צנטריפוגה הומוגנית ב 12, 000 פעמים גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש ללא RNase ומשליכים את גלולת הכדור.

מוסיפים 0.7 נפח של isopropanol על טבעי, בעדינות להפוך מספר פעמים, ו דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לזרז את גלולת RNA על ידי צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השלך את העל-טבעי.

לשטוף את גלולה עם 70% אתנול ואוויר לייבש את גלולה במכסה המנוע. ממיסים את ה- RNA במים מטופלים דיתיל פירוקרבונט על ידי דגירה באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 20 דקות. כדי לבצע ניתוח כתם צפוני של רמות RNA שליח GFP, להכין 1.2% פורמלדהיד denaturing ג'ל אגרוז במאגר 1X MOPS פועל.

מערבבים את ה-RNA אחד לאחד עם צבע טעינת RNA ו denature RNA על ידי דגירה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מיד מצננים את הדגימות המרוקנים על הקרח למשך דקה אחת. עם פיפטה, לטעון את הדגימות לתוך בארות של ג'ל ואלקטרופורזה ב 100 וולט במשך 50 דקות עד RNA מופרד היטב.

יש לשטוף את הג'ל למאגר נתרן ציטראט מלוחים פי 20 כדי להסיר את הפורמדהיד. בצע העברה נימית לילה על ידי הגדרת חיץ נתרן ציטראט מלוחים 20X, שכבה אחת של מגבת נייר, שתי שכבות של נייר Whatman רטוב, שכבה אחת של ג'ל, שכבה אחת של קרום ניילון, שתי שכבות של נייר Whatman רטוב, שתי שכבות של נייר Whatman יבש, צלחת זכוכית אחת, ומשקל. בבוקר, ה-RNA בג'ל מועבר לממברנה של הניילון.

משרים את הממברנה ב 2X מלוחים נתרן ציטראט ולתקן את RNA לקרום על ידי חשיפת קרום רטוב UV crosslinking. המשך בהתאם לכתב היד. עלים מפותחים לחלוטין של שלושה עד ארבעה שבועות Nicotiana bethamiana 16c צמחים היו במשותף הסתננו טלאים עם תערובות אגרובקטריום נושאת 35S GFP.

בארבעה ימים לאחר החדירה, פלואורסצנטיות GFP של האזור הסתנן היה בתמונה תחת אור טבעי ואור UV גל ארוך. כתם צפוני גילה כי GFP שליח RNA צבר גבוה יותר בעלים המבטאת 35S GFP בתוספת 35S CMV2b או 35S GFP בתוספת 35S PSR1 מאשר בעלים המבטאת 35S GFP בתוספת EV. מישן Agroinfiltration בוצע כדי להעריך את התפשטות אות ההשתקה בעלים של שתילים 16c Nicotiana bethamiana בן שבועיים. ב-14 ימים שלאחר החדירה, יותר מ-98% מה-EV לא הציגו שום איתות GFP ברור בעלים מערכתיים.

בעוד שגם CMV2b וגם PSR1 עיכבו ביעילות את ההתפשטות המערכתית של אות ההשתלה. פלואורסצנטיות GFP נצפתה בכ-80% מהצמחים שחדרו במשותף וב-20% הנותרים של צמחים שחדרו עם מעט ורידים אדומים הופיעו בעלים חדשים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לזהות מדכאי השתקת RNA חדשניים המופרשים על ידי פתוגנים צמחיים רבים.

השילוב של צמחים OD הנכון הוא הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון הליך זה. בעקבות הליך זה, ניתן לעשות את האפיון הפונקציונלי של מדכא השתיקת RNA כדי לחקור את המנגנון של האופן שבו מדכאים אלה לוחצים על השתיקת ה- RNA המארחת ומהו הפלט. אנא לבשו את משקפי הבטיחות כשאתם חודרים לצמחים וגם לבשו את כפפות ה לטקס במהלך כל שלבי הניסוי.