Name: הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: חקור שיטת סינון מהירה לזיהוי מדכאי השתקת RNA בפתוגנים צמחיים באמצעות Nicotiana benthamiana. טכניקה זו משפרת את הדיוק והיעילות במחקר מנגנוני ההגנה של צמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים של "שואנג תוכנית" של קרן לפיתוח החינוך שנגחאי הנציבות העירונית של שנגחאי ועדת החינוך העירוני, מחקר המפתח הלאומי תוכנית פיתוח של סין המפתח הלאומי R & D תוכנית של סין ( 2018YFD0201500), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (no. 31571696 ו 31660510), התוכנית אלף כשרונות עבור אנשי מקצוע צעירים של סין, ואת הנציבות המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי (18DZ2260500).

הערה: יש לנהל את כל השלבים של ההליך בטמפרטורת החדר (RT).
התראה: הפקדת כל המדיה המכילה חיידקים פתוגניים, כמו גם את הצמחים ורקמת הצמח המשמשים בתוך המנה, אל מיכלי הפסולת המתאימים והחיטוי לפני השלכת.
1. הכנת מבני פלמנא המכילים מפעריקים
<ol><li>בחר מפרשים מופרשים שמבטאים במידה רבה במהלך ההדבקה, כפי שנקבע על-ידי רצפי RNA (RNA-Seq), ועוד בטכניקת ה-PCR (רביעיית-PCR) בזמן אמת כמותי.</li>
	<li>לקבוע את אתר המחשוף פפטיד האות של כל אפקטור באמצעות כלי תוכנה כגון סיאלפ18.</li>
	<li>עיצוב התחל ולבצע PCR כדי להגביר את הקידוד של הסקרנות הריבית באמצעות דנ א בנאמנות גבוהה פולימראז. בצע ביצוע אלקטרופורזה ג'ל כדי לבדוק את מוצר ה-PCR, לאחר מכן לשכפל את אמפליקון לתוך הכניסה וקטור השער pQBV3 באמצעות ערכת השכפול ללא הארכה (טבלה של חומרים), ולאחר מכן לתוך ביטוי היעד וקטור pEG100 באמצעות התגובה של LR שילוב חוזר19.</li>
	<li>המרה 3-5 μL של תערובת התגובה LR לתוך 100 μL של תאים המוסמכת של E. coli (למשל, TOP10, DH5α), להפיץ את התאים החיידקיים שהפכו על לוריא-ברטני (LB) אגר בינוני עם 50 Μg/mL kanamycin, ו-דגירה ב 37 ° צ' עבור 16 על 20 h. הערה: ניתן לזהות transformants חיובית על-ידי המושבה ה-PCR20 ולאחר מכן נותחו על-ידי מיני-ביניים ורצף.</li>
	<li>הציגו 50 למעלה מ-100 מרקומביננטי פלמידים שנושאים חלבון לתוך 100 μL של תאים כימיים המוסמכים בתאי tumefaciens (למשל , GV3101 או C58C1), לערבב בעדינות, ולאחר מכן להקפיא בחנקן נוזלי עבור 1 דקות. הפשרת התאים באמבט מים בגודל 37 ° c עבור 5 דקות.</li>
	<li>הוסף 500 μL של ציר ליברות ו-דגירה ב 30 ° צ' עבור 4 לל6 h עם טלטול עדין, ולאחר מכן להעביר ולהפיץ את כל התאים agrobacteria על LB אגר בינוני עם 50 μg/mL kanamycin ו 50 μg/mL גריסופלובין ב 30 ° צ' עבור 2 ימים. הערה: ניתן לאמת שכפולים חיוביים על-ידי המושבה PCR.</li>
	<li>השתמש מושבה אחת השתנה לניסויים אגרו-הסתננות אלא אם כן ביים אחרת. הערה: במחקר הנוכחי, אף אחד מהגנים שנבדקו לא הכיל introns חזוי; כל אחד הגנים הוגדל ישירות מ-DNA גנומית של Phytophthora sojae בודד. וקטור ביטוי של צמח שער ללא תג מומלץ, אך לא נחוץ.</li>
</ol>2. הכנת המפעלים של N. benthamiana 16c
<ol><li>הכנת תערובות קרקע השתילה המורכב (על ידי נפח) 50% כבול איזוב, 30% perlite, ו 20% ורמיקוליט, ו החיטוי ב 120 ° c עבור 20 דקות.</li>
	<li>לטבול תערובות קרקע אוטומטית עם פתרון דשן הצמח (1 g/L) ו-sub-חבילה אותם לסירים קטנים יותר (80 מ"מ x 80 mm x 75 מ"מ) מאוחסן מגש גדול יותר (540 mm x 285 mm x 60 מ"מ).</li>
	<li>זרוע זרעי אחד או שניים של N. benthamiana 16c על פני הקרקע של כל סיר. לכסות את המגש עם כיפת פלסטיק ולאפשר זרעים כדי לנבוט.</li>
	<li>מניחים את המגש מתחת לתאי הצמיחה בשליטה קלה ובטמפרטורה בטמפרטורה של 23 עד 25 ° c, 50 לחות יחסית של 60%, ו-photoperiod ליום ארוך (14 שעות אור/10 שחור כהה, עם תאורה ב 130-150 μE · m-2s-1).</li>
	<li>הניחו את הכיפה הפלסטית לאחר הזרעים לנבוט (3-4 ימים) ולאפשר לשתילים לצמוח תחת אותם התנאים ששימשו לשלב הנביטה.</li>
	<li>להוסיף כמות מתאימה של מים, שמירה על הקרקע לחות אך לא לטבילה, כל 2-3 ימים; להוסיף דשן כל 10 ימים כדי לקדם צמיחה נוספת. שמור על N. benthamiana 16c צמחים בתנאים נורמליים עד שהם מוכנים לשימוש; בשלב זה המפעל צריך להיות לפחות חמישה עלים אמיתיים מפותחים לחלוטין לא נראה בבית השחי או ניצנים הפרח, ואת העלים צריך מראה ירוק בריא).</li>
	<li>השימוש 3 לשבוע 4 עלים של N. benthamiana 16c עבור רנ א המקומי השתקה מספר, וצעירים N. benthamiana 16c צמחים (10 למשך 14 ימים) עבור RNA מערכתית השתקה האומר. הערה: תנאי הצמיחה והמתקנים של הצמח משתנים באמצעות מעבדות; לבחור בריא, מפותח ומורחב לחלוטין עלים לחדירה.</li>
</ol>3. הכנת תרבות אגרובאכטריום לחדירה
<ol><li>בחר מושבה חיובית מן הצלחת ליברות ולאחר התאים לתוך שפופרת זכוכית המכילה 5 מ ל של LB בינונית בתוספת עם 50 μg/mL kanamycin ו 50 μg/mL גריסופלובין. הגדל את התאים במהירות 30 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עבור 24 עד 48 שעות.</li>
	<li>העברת 100 μL של התרבות לתוך 5 מ ל של ליברות בינונית בתוספת אנטיביוטיקה זהה, 10 מ"מ 2-(N-גווראולנו) חומצה ethanesulfonic (MES; pH 5.6) ו 20 μM acetosyringone (AS). גידול חיידקים ב 30 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עבור 16 לל20 h.</li>
	<li>בתאי צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 10 דקות. יוצקים את supernatant ולהשעות את הגלולה ב 2 מ מ של 10 מ"מ MgCl2 מאגר.</li>
	<li>חזור על שלב 3.3 כדי להבטיח הסרה מלאה של אנטיביוטיקה.</li>
	<li>לקבוע את הצפיפות של התרבות Agrobacterium על ידי מדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD600). התאם ל-OD600 של 1.5-2.0 עם מאגר 10 מ"מ MgCl2 .</li>
	<li>הוסף 10 מ"מ MES (pH 5.6) ו 150 μM באשר לתרבויות ההשעיה הסופית והוא דגירה את התאים ב-RT עבור לפחות 3 שעות מבלי לרעוד. הערה: אל תשאירו את התרבות ההשעיה הסופית בלילה.</li>
</ol>4. שיתוף הסתננות N. benthamiana עוזב
<ol><li>מערבבים כמויות שוות של תרבות Agrobacterium המכילה 35 s-gfp עם תרבות Agrobacterium המכילה 35 s-מלפפון פסיפס וירוס משתיק קול 2b (CMV2b), וקטור, או ריק (EV).</li>
	<li>בזהירות ובאיטיות לחדור את השרגיום מעורב השעיות על הצדדים הדו של N. benthamiana 16c העלים באמצעות מזרק אחד שזקוק ל-mL.</li>
	<li>הסר את הבולם החיידקי הנותרים מן העלים עם מנקי רקמות רך להקיף את השוליים של טלאים חדרו עם עט maker.</li>
	<li>השאירו את הצמחים החדרו בחדר הצמיחה באותו תנאי גדילה. הערה: למטרות בטיחות ובריאות, משקפי העין המגן ומסכה יש לענוד במהלך הסתננות. כדי למנוע זיהום, כפפות יש לשנות או לעקר עם אתנול בין חדירות. בדרך כלל לפחות 1 מ ל של agrobacterium שתלים לעלה נדרש הסתננות. עבור השתקה מערכתית, לפחות שני עלים יידרשו לחדירה.</li>
</ol>5. ניתוח הדמיה של GFP
<ol><li>באופן חזותי לזהות הזריחה GFP בעלים החדשים של צמחים שלמים 2 שבועות לאחר הסתננות (עבור RNA מערכתית השתקה) או כתמי החדרו של עלים 3 על 4 dpi באמצעות אולטרה סגול גל (UV) מנורה ללא העלים אוסף.</li>
	<li>צילום הצמחים שנאספו ו/או מנותקת עלים עם מצלמה דיגיטלית מצויד הן UV ומסננים צהובים. הערה: לצורך השתקה של דיכוי ההשתקה המקומי, יש לחקור כתמים שחדרו לתוך העלים של N. benthamiana 16c, ואילו עבור פעילות לדיכוי מערכתית, לחקור עלים חדשים שגדלו. הפעילות הדחקה של רנ א עשויה להשתנות בהתאם לעריקים בודדים. לכן, התבונן במדבקות או בעלים במשך מספר ימים החל מ-3 dpi. השתמש ב-CMV2b ו-EV כפקדים חיוביים ושליליים, בהתאמה.</li>
</ol>6. בדיקת כתמי הצפון של רמות הטיפול
<ol><li>בידוד של RNA כולל מרקמת עלה באמצעות מגיב בידוד RNA (טבלת חומרים)<ol>
<li>לאסוף רקמות עלים מתוך N. benthamiana 16c טלאים על 4 לפחות 7 dpi, לרסק בחנקן נוזלי לאבקה משובחת, ולהעביר את האבקה לצינור סטרילי 2 מ ל.</li>
		<li>הוסף את מגיב בידוד RNA (1 mL/100 מ ג רקמת) מיד לצינור שנדגמו במכסה המנוע, לנער במרץ כדי הומואכל, ו דגירה ב RT עבור 5 דקות.</li>
		<li>הוספת כלורופורם (200 μL/1 מ"ל בידוד RNA) לכל צינור במכסה המנוע, לנער במרץ עבור 15 s, ו-דגירה ב-RT עבור 5 דקות. צנטריפוגה את המגון ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.</li>
		<li>להעביר את supernatant לתוך צינור חדש RNase-חינם ולמחוק את הגלולה. הוסף 0.7 נפח של איזופנול ל-supernatant, להפוך בעדינות מספר פעמים, ו דגירה את התערובת ב-RT עבור 10 דקות.</li>
		<li>מזרז את הגלולה RNA על ידי צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.</li>
		<li>להיפטר supernatant, לשטוף את הגלולה עם 70% אתנול, ולייבש את הגלולה במכסה המנוע. לפזר את ה-RNA ב דיאתיל פירוקרבונט (depc)-מים שטופלו על ידי דגירה ב 65 מעלות צלזיוס באמבט מים עבור 10-20 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בדיקת כתמי הצפון של רמת הקרקע של GFP בעלי החדרו<ol>
<li>להכין 1.2% פורמלדהיד הפעלת ג'ל ב-1x מגבים פועל מאגר.</li>
		<li>מערבבים RNA 1:1 עם צבע העמסה של RNA והד, באמצעות הדגירה של 65 ° צ' במשך 10 דקות, מיד לצנן את דגימות denat, על הקרח 1 דקות.</li>
		<li>טען את הדגימות על ג'ל ואלקטרופורמית ב 100 V עבור 50 דקות עד RNA הוא מופרד היטב.</li>
		<li>לשטוף את הג ב-20x מלוחים-נתרן ציטראט מאגר להסיר פורמלדהיד ולהעביר את ג'ל קרום ניילון על ידי העברת קפילר ב 20x מאגר המטה לילה. להשרות את הקרום ב-2x מהאס. בי. או לתקן את ה-RNA לקרום ידי חשיפת קרום רטוב כדי הקישור לחצות UV.</li>
		<li>הוסף את הכמות המתאימה של מאגר הכלאה (10 מ"ל לכל 100 ס מ2 קרום; רשימת חומרים) בצינור הכלאה ומתפרעים ב-60 ° c בתנור הכלאה.</li>
		<li>הכניסו את הקרום לתוך צינור היברידיזציה ו הדגירה עבור 60 דקות ב 60 ° c. לדלל בדיקה 5 ' לחפור בתווית DNA (הריכוז הסופי, 50 ng/mL) לתוך פתרון הכלאה המכיל מאגר הכלאה מראש.</li>
		<li>מחק את המאגר הטרום-הכלאה והחלף מיד עם פתרון הכלאה מראש המכיל את הגשוש בעל תווית החפירה. מיכל האבן החשופה עם לווין ב-60 ° c בלילה, עם עצבנות עדינה.</li>
		<li>לאחר הכלאה, רוחצים את הקרום פעמיים במאגרים של הגברת החריפות ב-60 ° c עבור 20 דקות כל אחד. בעדינות לנגב את הקרום כדי להסיר מאגר כביסה נוספת ולהוסיף ריאגנטים כפי שהוצע הכלאה היבריריזציה ואת ערכת האיתור (טבלת חומרים).</li>
		<li>לזהות אותות הוכלא על ידי תגובת כימושימינטאת בשילוב עם מערכת הדמיה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Virulence+Annotation+%28RVA%29%3A+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li>
<li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+pathogen+effector+functions%3A+of+pathogens%2C+hosts+and+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li>
<li>Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+the+stage%3A+effectors+in+the+spotlight%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Taking the stage: effectors in the spotlight.</a> Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).</li>
<li>Lee, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Pseudomonas+syringae+Type+III+Secreted+Effector+Function+via+a+Yeast+Genomic+Screen%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).</li>
<li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-Pathogen+Effectors%3A+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).</li>
<li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).</li>
<li>Pumplin, N., Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+suppression+by+plant+pathogens%3A+defence%2C+counter-defence+and+counter-counter-defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).</li>
<li>Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+silencing+suppressors%3A+Tools+forged+to+fine-tune+host-pathogen+coexistence%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence.</a> Virology. 479-480, 85-103 (2015).</li>
<li>Johansen, L. K., Carrington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+on+the+spot.+Induction+and+suppression+of+RNA+silencing+in+the+Agrobacterium-mediated+transient+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system.</a> Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).</li>
<li>Powers, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+assay+for+the+identification+of+RNA+silencing+suppressors+based+on+complementation+of+viral+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).</li>
<li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103 (1), 157-167 (2000).</li>
<li>Deleris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+action+and+inhibition+of+plant+Dicer-like+proteins+in+antiviral+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense.</a> Science. 313 (5783), 68-71 (2006).</li>
<li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li>
<li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li>
<li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li>
<li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li>
<li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SignalP+4.0%3A+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li>
<li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li>
<li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoodman%2C+ME+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22">Current Protocols in Microbiology</a>. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).</li>
<li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li>
<li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+suppressors+of+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li>
<li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+and+its+suppression%3A+novel+insights+from+in+planta+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li>
<li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

רנ א השתקה הוא מנגנון הגנה מפתח המועסקים על ידי צמחים להילחם ויראלי, חיידקי, o, ופתוגנים פטרייתי. בתורו, החיידקים האלה התפתחו חלבונים מדכא השתקה כדי לנטרל נגיפים השתקה, ואת אלה RSSs להפריע לשלבים שונים של השביל השתקה RNA22,23. כמה הקרנת ההקרנה פותחו כדי לזהות RSSs10.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול משופר לסינון חלבונים אפקטור מופרש על ידי P. sojae לתוך התא המארח על היכולת שלהם לדכא RNA השתקה במארח. שיטת השינוי...

במהלך שני העשורים האחרונים, האצת רצף הגנום של מיקרואורגניזמים הגורמות מחלות צמחים הוביל פער ידע הולך וגובר בין מידע רצף ופונקציות ביולוגיות של חלבונים מקודד1. בין המולקולות שנחשפו על-ידי פרויקטים ברצף הם מולקולות אפקטור לדכא חסינות מולדת ולהקל על הקולוניזציה המארחת; גורמים אלה מופרשים על ידי פתוגנים צמחים הרסניים, כולל חיידקים, nematodes, וחיידקים filamentous. כדי להגיב על איומים אלה, צמחים מארחים התפתחו קולטני הרומן המכירים את העריקים האלה, המאפשרים שחזור של התגובה החיסונית. מכאן, העריקים כפופים ללחצים סלקטיבית שונים, המוביל לגיוון של אפקטור repertoires בקרב הפתוגן שנים2. בשנים האחרונות, מנטרל מפתוגנים צמחים הוכחו לשבש הצמח חסינות מולדים על ידי הפרעה תהליכים סלולריים מארח לטובת חיידקים במגוון דרכים, כולל דיסרגולציה של איתות מסלולים, תמלול, הובלה תאיים, יציבות השלד, שלפוחית הסחר, ו RNA השתקה3,4,5. עם זאת, הרוב המכריע של העריקים הפתוגן, במיוחד אלה של פתוגנים filamentous, נותרו מחוחימים.
רנ א השתקה היא הומולוגיה-בתיווך גן מכונות ההפעלה כי הוא שימור בין eukaryotes. התהליך מופעל על ידי ארוך כפול תקועים RNA (dsRNA) ומטרות RNA הומוולוגי יחיד תקוע (ssRNA) באופן ספציפי רצף, והיא מפעילה מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל הגנה אנטי ויראליות6. כדי להתגבר על התגובות החיסונית הטבועה של המארח, וירוסים מסוימים התפתחו לקזז RNA השתקה, כולל היכולת לשכפל בתוך התאים תאיים או לברוח מהאות מאורגן מראש. אף על פי כן, האסטרטגיה הכללית ביותר שבה וירוסים להגן על גנום שלהם נגד rna השתקה תלוי אובדן של הפונקציה gene היא לקודד חלבונים ספציפיים לדכא rna השתקה7,8. מספר גישות שונות של מכניזיות הוקמו על המסך ואיפיון דכאי ויראלי של RNA השתקה (vsrs), כולל הסתננות של agrobacterium התרבויות tumefaciens , צמחים טרנסגניים להביע דכאי, השתלה ותרבות התא9,10,11,12,13.
לכל אחד מאותם מספר יש יתרונות וחסרונות, ומזהה VSRs באופן ייחודי משלו. אחת הגישות הנפוצות ביותר מבוססת על חדירה משותפת של הפרט A. tמואfaciens תרבויות מחסה את החלבון הנגיפי הפוטנציאלי גן עיתונאי (בדרך כלל חלבון פלורסנט ירוק [gfp]) על טבק benthamiana 16c צמחים ביטוי המבטא gfp תחת השליטה של וירוס פסיפס כרובית של מקדם 35. בהעדר משתיק קול ויראלי פעיל, GFP מזוהה כאקסוגני על ידי התאים המארחים והוא מושתק בתוך 3 ימים לאחר הסתננות (dpi). לעומת זאת, אם החלבון הנגיפי מחזיק בפעילות הדיכוי, רמת הביטוי של GFP נותרת יציבה מעבר ל -3 עד 9 dpi9. שיתוף החדירה המשותף הזה הוא פשוט ומהיר; עם זאת, הוא לא יציב מאוד ולא רגיש. עם זאת, את השיטת זיהה vsrs רבים עם רצפי חלבון מגוונים ומבנים רבים RNA וירוסים7,8.
לאחרונה, כמה חלבונים אפקטור שיכולים לעכב את הפעילות התאית השתקה הסלולר כבר מאופיין חיידקי, o, ופטריות צמח פתוגנים14,15,16. ממצאים אלה משתמע כי רנ א השתקה הדיכוי היא אסטרטגיה נפוצה להקלה על זיהום המשמש פתוגנים ברוב הממלכות. בתאוריה, רבים, אם לא כולם, של העריקים עשויים לקודד RNA השתקה דכאי (RSSs); עד כה, לעומת זאת, רק מעטים זוהו, בעיקר בשל המחסור באסטרטגיית ההקרנה האמינה והכללית. יתר על כן, דכאי של RNA השתקה לא נחקרו ברוב המכריע של פתוגנים צמחים17.
בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב וכללי לזיהוי הפתוגן הגורם למחלה שיכול לדכא RNA מקומי ומערכתי השתקה באמצעות שיטת החדירה אגרו. המטרה הראשונה של מחקר זה הייתה להדגיש את ההיבטים המרכזיים של הפרוטוקול ולתאר את השלבים בפרוטרוט, ובכך לספק מבחן הקרנה המתאים לכמעט כל העריקים של פתוגנים צמחיים.

<table><tbody><tr><td>2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)</td> <td>Biofroxx</td><td>1086GR500</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>2xTaq Master Mix</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P112-AA</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) חומצה פרופנסולפונית (MOPS)</td> <td>Amresco</td><td>0264C507-1KG</td><td>MOPS Buffer</td></tr><tr><td>Acetosyringone (AS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>אינדוקציה של אגרובקטריום</td></tr><tr><td>אגר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A1296-1KG</td><td>LB בינוני</td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>ביופרוקס</td><td>1110GR100</td><td>אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>אמרשם הייבונד -N +</td> <td>GE Healthcare</td><td>RPN303 B</td><td>כתם צפוני</td></tr><tr><td>אמרשם אימג'ר</td><td>GE Healthcare</td><td>אמרשם אימג'ר 600</td><td>תמונה</td></tr><tr><td>בקטו טריפטון</td><td>BD ביוסיינסס</td><td>211705</td><td>LB בינוני</td></tr><tr><td>מיצוי</td> <td>שמרים בקטוBD Biosciences</td><td>212750</td><td>LB</td></tr><tr><td>מצלמה בינונית</td><td>Nikon</td><td>D5100</td><td>צילום</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP מערכת הדמיה</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent מודול זיהוי רכיב של ערכות דאפא</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td>זיהוי זוהר</td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>אמרסקו</td><td>0230-100G</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>ClonExpress II ערכת שיבוט שלב אחד</td><td>Vazyme Biotech</td><td>C112-01</td><td>קשירה</td></tr><tr><td>DIG Easy Hyb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11603558001</td><td>מאגר הכלאה</td></tr> ערכת <tr><td>Easypure פלסמיד Miniprep TransGen</td><td>Biotech</td><td>EM101-02</td><td>מיצוי פלסמיד</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל מהירה EasyPure TransGen</td><td>Biotech</td><td>EG101-02</td><td>מיצוי ג'ל</td></tr><tr><td>EDTA דיסודיום מלח דיהידראט</td><td>Amresco/VWR</td><td>0105-1KG</td><td>MOPS מאגר</td></tr><tr><td>אלקטרופורזה ספק כוח</td><td>LiuYi</td><td>DYY6D</td><td>אלקטרופורזה של חומצות גרעין.</td></tr><tr><td>FastDigest EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0304</td><td>מערכת תמונה ג'ל לעיכול וקטורי</td></tr><tr><td></td><td>Tanon</td><td>Tanon3500</td><td>תמונה</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Amresco</td><td>0304-5G</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>קנמיצין סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>K1914</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>LR קלונאז II אנזים</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td>תגובת</td></tr> <tr><td>LRקרום ספיגת ניטרוצלולוז 0.45um</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td>Northern</td></tr><tr><td>NORTH2south ביוטין ערכת תיוג DNA ראשונית אקראית</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075</td><td>תיוג ביוטין</td></tr><tr><td>PCR Thermal Cyclers</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>PCR</td></tr><tr><td>טחב כבול</td><td>PINDSTRUP</td><td>זהב כהה + צמחי חימר</td><td></td></tr><tr><td>פיטרס דשן מסיס במים</td><td>ICE</td><td>פיטר מקצועי 20-20-20</td><td>דשן</td></tr><tr><td>Phanta Max סופר-נאמנות DNA פולימראז</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P505-d1</td><td>אנזים</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>219549005</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>RNA ג'ל טעינת צבע (2X)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>RNA ג'ל טעינת צבע</td></tr><tr><td>נתרן אצטט הידרט</td><td>Amresco / VWR</td><td>0530-1KG</td><td>MOPS Buffer</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>אמרסקו</td><td>0241-10KG</td><td>LB בינוני</td></tr><tr><td>תלת-נתרן ציטראט</td><td>אמרסקו</td><td>0101-1KG</td><td>SSC מאגר</td></tr><tr><td>טריזול מגיב</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>ריאגנט בידוד RNA</td></tr><tr><td>מנורת UV</td><td>Analytik Jena</td><td>UVP B-100AP</td><td>תצפית</td></tr><tr><td>UVP Hybrilinker תנור</td><td>Analytik Jena</td><td>OV2000</td><td>צפון</td></tr></tbody></table>

הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

רנ א השתקה הוא שימור אבולוציונית, רצף ספציפי מנגנון רגולציה הגנים ב eukaryotes. פתוגנים צמחים מספר התפתחו חלבונים עם היכולת לעכב את המפעל מארח RNA השתקה המסלול. שלא כמו חלבונים אפקטור וירוס, רק מספר חלבונים אפקטור מופרש הראו את היכולת לדכא RNA השתקה בקטריאלי, o, ופטריות ופתוגנים, ואת הפונקציות המולקולריות של רוב העריקים להישאר ידועים ברובו. כאן, אנו מתארים בפרוטרוט גרסה שונה מעט של השינוי החדירה שיתוף שיכול לשמש כשיטה כללית להתבוננות RNA השתקה ולאפיון חלבונים אפקטור מופרש על ידי פתוגנים צמחים. השלבים העיקריים של הגישה הם בחירת העלים בריאים ומפותחים באופן מלא, התאמת התרבות חיידקים לדחיסות אופטית המתאימה (OD) ב 600 ננומטר, והתבוננות חלבון פלורסנט ירוק (GFP) זריחה בזמן האופטימלי על החדר המתאים העלים על מנת למנוע השמטת עריקים בפעילות דיכוי חלשה. פרוטוקול משופר זה יתרום מהירה, מדויקת, הקרנה נרחבת של RNA השתקה דכאי ולשמש נקודת התחלה מצוינת לחקירת פונקציות מולקולריות של חלבונים אלה.

לעיל, אנו מתארים את ההליך צעד אחר צעד עבור שיטת הקרנה משופרת להערכת פעילות ה-RSS של P. sojae rxlr מעריקים. בסך הכל, הניסוי נמשך 5-6 שבועות. לאחר מכן, הRSSs המזוהה על-ידי הבחינה יכולה להיות מאופיינת עוד יותר במונחים של פונקציה ומנגנון מולקולרי. כדוגמה לגישה שלנו, השתמשנו P. sojae rxlr השפעות משתיק PHYTOPHTHORA של RNA השתקה 1 (PSR1), אשר מופרש ונמסר לתוך תאים מארחים דרך האוגוריה במהלך הזיהום.
כדי לאשר כי PSR1 יש ...

כאן, אנו מציגים שיטת הקרנה שונה שניתן להשתמש בהרחבה כדי להקרין במהירות RNA השתקה דכאי במחלות צמחים.

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על איך לסנן את מדכאי השתקת RNA המופרשים על ידי פתוגנים צמחיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לספק בדיקות סינון מהירות, מדויקות ונרחבות לזיהוי מדכאי השתיקת RNA. מכינים תערובת אדמה בעציצים המורכבת מ-50% אזוב כבול, 30% פרליט ו-20% ורמיקולייט ואוטוקלאב ב-120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.משרים את האדמה האוטוקלאבת מתערבבת עם תות תב"א צמחי בגרם אחד לליטר ומפרקים אותם לסירים קטנים יותר המאוחסנים במגש גדול יותר. לזרוע אחד או שניים זרעים של Nicotiana bethamiana 16c על פני הקרקע של כל סיר. מכסים את המגש בכיפת פלסטיק ומאפשרים לזרעים לנבוט.מניחים את המגש מתחת לחדרי צמיחה קלים ומבוקרי טמפרטורה עם טמפרטורה של 23 עד 25 מעלות צלזיוס, 50 עד 60% לחות יחסית, ופוטופריוד יום ארוך. לאחר שלושה עד ארבעה ימים, הזרעים נובטים. תוריד את כיפת הפלסטיק ותאפשר לשתילים לגדול באותם תנאים המשמשים לשלב הנביטה.כל יומיים עד שלושה ימים, מוסיפים כמות מתאימה של מים שמירה על הקרקע לחה אבל לא השריה. כל 10 ימים, להוסיף דשן כדי לקדם צמיחה נוספת. לשמור על צמחים Nicotiana bethamiana 16c בתנאים נורמליים עד הצמחים יש לפחות חמישה עלים אמיתיים מפותחים לחלוטין ללא בית רם גלוי או ניצני פרחים ועלים יש מראה ירוק בריא.השתמשו בצמחים בני 10 עד 14 ימים של Nicotiana bethamiana 16c להסחת RNA מערכתית ועלים בני שלושה עד ארבעה שבועות של Nicotiana bethamiana 16c להסחת RNA מקומית. השתמש טיפ כדי לבחור מושבה חיובית מצלחת LB לחסן את התאים לתוך צינור זכוכית המכיל חמישה מיליליטר של LB בינוני בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר Kanamycin ו 50 מיקרוגרם למיליליטר ריפאמפיצין. לגדל את התאים ב 30 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 200 סל"ד במשך 24 עד 48 שעות.להעביר 100 microliters של התרבות לתוך חמישה מיליליטר של בינוני LB בתוספת אנטיביוטיקה אותו, 10 מילימולרים MES ב pH 5.6, ו 20 micromolar AS. לגדל את החיידקים ב 30 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 200 סל"ד במשך 16 עד 20 שעות. צנטריפוגה התאים ב 4, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות. השליכו את העל-טבעי והתינו מחדש את גלולת הכדור בשני מיליליטר של חיץ מגנזיום כלוריד 10 מילימולארי.חזור על לשטוף כדי להבטיח הסרה מלאה של אנטיביוטיקה. לקבוע את הצפיפות של תרבות האגרובקטריום על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר. התאם את תרבות התאים עם מאגר מגנזיום כלוריד 10 מילימולארי ל- OD 600 של 1.5 עד 2.0.הוסף 10 MES מילימולר ב pH 5.6 ו 150 micromolar AS לתרבות ההשעיה הסופית דגירה התאים בטמפרטורת החדר לפחות שלוש שעות בלי לרעוד. מערבבים כמויות שוות של תרבות אגרובקטריום המכילה חלבון פלואורסצנטי ירוק 35S עם תרבות אגרובקטריום המכילה מדכא וירוס פסיפס מלפפון 35S 2b, משפיע putative או וקטור ריק. באמצעות מזרק אחד מיליליטר ללא מחט, בזהירות ולאט לאט לחדור את השעיות אגרובקטריום מעורב על הצדדים abaxial של ניקוטיאנה bethamiana 16c עלים.הסר את ההשעיה החיידקית הנותרת מן העלים עם מגבונים רקמות רכות להקיף את השוליים של טלאים הסתננו עם עט סמן. שלושה עד ארבעה ימים לאחר החדירה, השתמש במנורה אולטרה סגולה גל ארוך כדי לזהות חזותית פלואורסצנטיות GFP בחלקות הסתננו של עלים. שבועיים לאחר החדירה, השתמש במנורה כדי לזהות עלים שגודלו לאחרונה של הצמח כולו לה השתלת RNA מערכתית.כדי לבודד את ה-RNA הכולל מרמת העלה בארבעה עד שבעה ימים לאחר החדירה, לאסוף את רקמות העלה מן מדבקות Nicotiana bethamiana 16c הסתננו לתוך מרגמה. מניחים חנקן נוזלי לתוך המרגמה וטוחנים את הרקמה לאבקה דקה עם מוט טחינה ומעבירים את האבקה לצינור סטרילי של שני מיליליטר. מיד להוסיף את רגנט בידוד RNA בנפח של מיליליטר אחד לכל 100 מיליגרם של רקמה לצינור מדגם ברדס, מערבולת במרץ הומוגנית, דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.מוסיפים כלורופורם בנפח של 200 מיקרוליטר למיליליטר אחד של ריאגנט בידוד RNA לכל צינור במכסה המנוע, רועדים במרץ במשך 15 שניות, ודוגרים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. צנטריפוגה הומוגנית ב 12, 000 פעמים גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש ללא RNase ומשליכים את גלולת הכדור.מוסיפים 0.7 נפח של isopropanol על טבעי, בעדינות להפוך מספר פעמים, ו דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לזרז את גלולת RNA על ידי צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השלך את העל-טבעי.לשטוף את גלולה עם 70% אתנול ואוויר לייבש את גלולה במכסה המנוע. ממיסים את ה- RNA במים מטופלים דיתיל פירוקרבונט על ידי דגירה באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 20 דקות. כדי לבצע ניתוח כתם צפוני של רמות RNA שליח GFP, להכין 1.2% פורמלדהיד denaturing ג'ל אגרוז במאגר 1X MOPS פועל.מערבבים את ה-RNA אחד לאחד עם צבע טעינת RNA ו denature RNA על ידי דגירה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מיד מצננים את הדגימות המרוקנים על הקרח למשך דקה אחת. עם פיפטה, לטעון את הדגימות לתוך בארות של ג'ל ואלקטרופורזה ב 100 וולט במשך 50 דקות עד RNA מופרד היטב.יש לשטוף את הג'ל למאגר נתרן ציטראט מלוחים פי 20 כדי להסיר את הפורמדהיד. בצע העברה נימית לילה על ידי הגדרת חיץ נתרן ציטראט מלוחים 20X, שכבה אחת של מגבת נייר, שתי שכבות של נייר Whatman רטוב, שכבה אחת של ג'ל, שכבה אחת של קרום ניילון, שתי שכבות של נייר Whatman רטוב, שתי שכבות של נייר Whatman יבש, צלחת זכוכית אחת, ומשקל. בבוקר, ה-RNA בג'ל מועבר לממברנה של הניילון.משרים את הממברנה ב 2X מלוחים נתרן ציטראט ולתקן את RNA לקרום על ידי חשיפת קרום רטוב UV crosslinking. המשך בהתאם לכתב היד. עלים מפותחים לחלוטין של שלושה עד ארבעה שבועות Nicotiana bethamiana 16c צמחים היו במשותף הסתננו טלאים עם תערובות אגרובקטריום נושאת 35S GFP.בארבעה ימים לאחר החדירה, פלואורסצנטיות GFP של האזור הסתנן היה בתמונה תחת אור טבעי ואור UV גל ארוך. כתם צפוני גילה כי GFP שליח RNA צבר גבוה יותר בעלים המבטאת 35S GFP בתוספת 35S CMV2b או 35S GFP בתוספת 35S PSR1 מאשר בעלים המבטאת 35S GFP בתוספת EV. מישן Agroinfiltration בוצע כדי להעריך את התפשטות אות ההשתקה בעלים של שתילים 16c Nicotiana bethamiana בן שבועיים. ב-14 ימים שלאחר החדירה, יותר מ-98% מה-EV לא הציגו שום איתות GFP ברור בעלים מערכתיים.בעוד שגם CMV2b וגם PSR1 עיכבו ביעילות את ההתפשטות המערכתית של אות ההשתלה. פלואורסצנטיות GFP נצפתה בכ-80% מהצמחים שחדרו במשותף וב-20% הנותרים של צמחים שחדרו עם מעט ורידים אדומים הופיעו בעלים חדשים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לזהות מדכאי השתקת RNA חדשניים המופרשים על ידי פתוגנים צמחיים רבים.השילוב של צמחים OD הנכון הוא הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון הליך זה. בעקבות הליך זה, ניתן לעשות את האפיון הפונקציונלי של מדכא השתיקת RNA כדי לחקור את המנגנון של האופן שבו מדכאים אלה לוחצים על השתיקת ה- RNA המארחת ומהו הפלט. אנא לבשו את משקפי הבטיחות כשאתם חודרים לצמחים וגם לבשו את כפפות ה לטקס במהלך כל שלבי הניסוי.

screening-identification-rna-silencing-suppressors-from-secreted

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

תיאור וירוס-Induced שיטה להשתקת (VIGS) הגן לדפוק למטה של ​​ביטוי...

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

מקור: שי, ג'. ואחרים. סינון וזיהוי מדכאי השתקת RNA מאפקטורים מופרשים של פתוגנים צמחיים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים מבחן חדירה משותפת לזיהוי חלבוני אפקטור פתוגנים המדכאים השתקת RNA בניקוטיאנה בנתמיאנה 16c. דיווח פלואורסצנטי וגן אפקטור מועמד מועברים לעלי הצמח דרך אגרובקטריום. בדרך כלל, השתקת RNA מפחיתה את תמלולי המדווחים, ומפחית את הפלואורסצנציה. אפקטורים מדכאים חוסמים תגובה זו, ושומרים על פלואורסצנציה. בדיקה זו מציעה שיטה מהירה ויזואלית לסינון אפקטורים מיקרוביאליים שמפריעים להגנת המארח.

מבחן קו-אינפלטרציה לבדיקת אפקטורים פתוגנים המדכאים השתקת RNA בצמח

וירוס-Induced השתקת הגן היא כלי שימושי לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות nonhost של צמחים. אנו מדגימים את השימוש בחיידקים פתוגנים המבטאים GFPuv בזיהוי גנים מושתקים צמחים רגישים לפתוגנים nonhost. גישה זו היא קלה, מהירה ומאפשרת הקרנה בקנה מידה גדולה ופרוטוקול דומה ניתן ליישם בחקר אינטראקציות צמח חיידק אחרים שונות.

הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לבצע siRNA ממוקד מסך "ubiquitome" לזהות היוביקוויטין רומן ורגולטורים כמו היוביקוויטין של התגובה התאית בתיווך HIF1A להיפוקסיה. זה יכול להיות מותאם לכל מסלול ביולוגי שבו חזקה לקריאה מהפעילות העיתונאית היא זמינה.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

כימות צמיחת פתוגנים הוא כלי רב עוצמה לאפיון תגובות חיסוניות שונות של Arabidopsis thaliana (להלן: Arabidopsis). השיטה המתוארת כאן מציגה בדיקת חדירת מזרק אופטימלית לכימות Pseudomonas syringae pv. מקוליקולה גידול ES4326 בעלים בוגרים של Arabidopsis.

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

קו ביואינפורמטיקה, כלומר miRDeep-P2 (miRDP2 בקיצור), עם קריטריונים מעודכנים של הצמח Mirdeep ואלגוריתם מקוצר, יכול לנתח באופן מדויק וביעילות מיקרוסקריפט בצמחים, במיוחד עבור מינים עם genomes מורכבים וגדולים.

צינור ביואינפורמטיקה לנתח באופן מדויק ויעיל את המייקרואורפה בצמחים

אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור וירוס תפוחי אדמה X (PVX)מבוסס microRNA השתקת מערכת (VbMS) כדי לאפיין פונקציונלית microRNAs אנדוגני (miRNAs) בתפוח אדמה. מולקולות חיקוי מטרה (TM) של miRNA של עניין משולבות בווקטור PVX ומתבטאות באופן חולף בתפוח אדמה כדי להשתיק את משפחת ה- miRNA או miRNA היעד.

וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.

שיטה זו ממחישה את השימוש בטכניקת הכלאה הצפוני כדי לזהות miRNAs מתוך תמצית RNA מוחלטת.

ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח

כאן, אנו מציגים שיטת השרייה מפורטת של הפרעת RNA ב Bursaphelenchus xylophilus כדי להקל על המחקר של תפקודי גנים.

יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

אנו מתארים שיטה פשוטה אך ניתנת לשחזור מאוד לבידוד RNA חוץ-תאי מפני השטח של העלים והאפופלסט של צמחי Arabidopsis.

מדריך מדורג לבידוד וניתוח של משטח העלים ו-RNA אפופלסטי באמצעות רוזטות Arabidopsis

חקור שיטת סינון מהירה לזיהוי מדכאי השתקת RNA בפתוגנים צמחיים באמצעות Nicotiana benthamiana. טכניקה זו משפרת את הדיוק והיעילות במחקר מנגנוני ההגנה של צמחים.

הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

גלה סרטונים נוספים