שילוב התקנים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציתום זרימה לחקר תחבורה מיקרוביאלית במדיה נקבובית על פני קשקשים מרחביים

לימוד הובלת חיידקים במערכות נקבוביות חשוב בכל הנוגע לזיהום, התפשטות מחלות ושיקום ביולוגי. עבור ניסויים אלה במודלים מתמטיים הפועלים בתא יחיד, האוכלוסייה ואת רמת הקהילה המיקרוביאלית נדרשים. כאן אנו מציגים כלים לחקר הובלת חיידקים באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים ומיקרוסקופיה, כמו גם מכשירים גדולים יותר בשילוב עם ציטומטריית זרימה.

השילוב של מכשירים מיקרופלואידיים עם מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה מציע מגוון אפשרויות לחקר תופעות תחבורה חיידקית בקנה מידה מרחבי שונה. על מנת לחקור באופן מלא פרוטוקול זה, הוא הציע יש ניסיון קודם במיקרוסקופיה, עיבוד תמונה בסיסי, תכנון התקנים microfluidic, ו cytometry זרימה שליטה. סרטון זה מתאר שתי שיטות לחקר הובלת חיידקים בקנה מידה מרחבי שונה.

השיטה הראשונה, המבוססת על מכשירים מיקרופלואידיים, מסתמכת על מיקרוסקופיה לספירת תאים בודדים. מערכת זו יכולה לשמש לחקר הובלת חיידקים על פני קשקשים מרחביים מרובים מן הנקבוביות לסקאלה המערכת הנקבובית כולה. השיטה השנייה, באמצעות מכשירים נוזליים גדולים יותר יחד עם מתקן אוטומטי ציטומטריה זרימה, ניתן להשתמש כדי לחקור תופעת תחבורה חיידקית בקנה מידה של מערכות נקבוביות שלמות.

שיטות כאלה ניתן לפרוס גם במחקרי עמודות בקנה מידה מעבדה, כמו גם סקרי שדה קטנים. ראשית, תכנן את הגיאומטריה הנקבובית הרצויה המורכבת מטריצה של עיגולים. בהתבסס על הגיאומטריה שנבחרה, הכינו תבנית באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית SU-8.

הכן 50 גרם של PDMS על ידי הוספת 90% של אלסטומר ל 10% של ריפוי סוכן ל 90% של אלסטומר לפי משקל במיכל חד פעמי נקי ומערבבים את שני reagents עם כלי נקי. החל ואקום של 100 מיליבר במשך 30 דקות כדי להסיר אוויר מומס בועות. מניחים את התבנית לתוך צלחת פטרי ויוצקים את PDMS על התבנית לגובה הרצוי בין שניים לחמישה מילימטרים.

מכסים את צלחת פטרי במכסה ולשמור אותו ב 60 מעלות צלזיוס לפחות ארבע שעות. לאחר מכן, לאפשר את המכשיר microfluidic להתקרר לטמפרטורת החדר. ברגע שהוא מקורר, להסיר בזהירות את החלק הרצוי של PDMS עם אזמל.

לאטום באופן זמני את החלק התחתון של ערוץ PDMS עם קלטת. עם אגרוף בקוטר 0.5 מילימטר, פירס ערוצים כדי ליצור מפרץ ושקע. הסר את הקלטת מערוץ PDMS והצב את הערוץ כשהצד הנקבובי פונה כלפי מעלה.

יש לטפל במגלשת הזכוכית ובמשטחי PDMS בפלזמה למשך כ-45 שניות כל אחד בטמפרטורת החדר. מניחים את ערוץ PDMS מטופל מראש על מגלשת זכוכית מטופלת מראש וחום ב 100 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות על צלחת חמה, ולאחר מכן להסיר את המכשיר microfluidic מהצלחת החמה לקרר אותו לטמפרטורת החדר. יש למרוח ואקום למשך 30 דקות להסרת אוויר מ-PDMS.

כדי לייצר את הבסיס המכיל את תא הנקבוביות, השתמש בטחינת מיקרו בדיוק גבוה כדי להסיר 0.5 מילימטרים משכבת PMMA הבסיסית ולטחן חריץ בגודל של 1.1 על 1.1 מילימטרים עבור טבעת גומי O. לקדוח שני חורים מושחלים עבור inlet ושקע לתוך החלק העליון של המכשיר fluidic ו 12 חורים עבור ברגים. זה משמש כמכסה של המכשיר הנוזלי.

לאחר ניקוי ההתקן הנוזלי, בורג את הבסיס ואת המכסה יחד באמצעות 12 חורים מושחלים. מוציאים את המיקרופלואידים מהוואקום ומ מניחים אותו על שלב המיקרוסקופ. השתמש במשאבת המזרק כדי להרוות אותו עם חיץ תנועתיות.

באמצעות מיקרוסקופיה של Brightfield או ניגודיות פאזה, התאימו את ההגדלה כדי לדמיין תאים חיידקיים בודדים והתמקדו במרכז ערוץ התצפית. העבר את הגדרות נתיב האור למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. התאם את המיקוד באמצעות היסט ותזמן החשיפה למצלמה כדי לפתור תאים חיידקיים בודדים.

במקרה הזה, 100 אלפיות שנייה. לאחר מכן, הכנס את צינורות הכניסה לצינור של שני מיליליטר המכיל את ההשעיה החיידקית. הפוך את כיוון המשאבה ולהתחיל למשוך את המתלה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לדקה.

לסרוק את חתך רוחב של ערוץ התצפית כולו, הקלטת תמונה בכל דקה. יבא תמונות לפלטפורמת תוכנה רצויה. רשום את הרקע כממוצע של התמונות הראשונות כאשר לא נרשמו חלקיקים.

הפחת את הרקע מכל תמונה כדי להסיר רעש מצלמה סטייה אופטית. חתוך את התמונות לאזור מעניין. זהה ערך סף השווה לעוצמת פיקסל הפלואורסצנטיות של התא כך ערכים הגדולים מהסף כוללים תאים חיידקיים.

השתמש בעיבוד תמונה כדי להחסיר את ערך הסף מכל תמונה. הפוך את התמונה המתקבלת לערך של תא חיידקי, בעוד שהרקע מקבל ערך של אפס. הסר אשכולות של פיקסלים עם שטח קטן יותר מגודל התא החיידקי הקטן ביותר בפיקסלים.

סכם את התמונה הבינארית כדי לקבל את המספר הכולל של פיקסלים באשכולות הנותרים. חלק את מספר הפיקסלים בגודל הממוצע של תא חיידקי בפיקסלים כדי לקבל הערכה של מספר התאים. להפוך את הספירות לריכוז בחלקיקים למיליליטר.

כדי לזהות את הריכוז של ההשעיה החיידקית מוזרק, להזריק את ההשעיה החיידקית לתוך ערוץ התצפית של מכשיר microfluidic נקי עם מזרק. תקליטו את התמונה וחשבו את ריכוז החיידקים בשפעת כפי שהוצג קודם לכן. דמיינו עקומות פורצות דרך על ידי נרמול ריכוז החיידקים בשפך C עם ריכוז חיידקי מתקלף C0 ותכנון C מעל C0 לעומת הזמן.

על מנת לנתח את המהירויות והמסלולים המקומיים של חיידקים שהועברו דרך המטריצה הנקבובית, להעביר את שלב המיקרוסקופ לאזור מעניין ולהתאים את המיקוד למרכז המכשיר המיקרופלואידי. הגדר את התצורה האופטית למיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה או פלואורסצנטיות. הקלט תמונות לשגות בזמן ותזמן חשיפה קצר מספיק כדי ללכוד תזוזה חיידקית.

במקרה הזה, 50 אלפיות שנייה. הקלט תמונות במשך פרק זמן מספיק, לדוגמה שלוש דקות. להסרת רעש מכל תמונה, חיסור הרקע, שהוא ממוצע הסכום של כל התמונות המוקלטות.

קבע את המודולוס של מעבר הצבע המספרי ונרמל אותו בערך המרבי שלו. חפש והקליט קואורדינטות חיידקים ואת הזמן של רכישת תמונה לתוך קובץ בן שלוש עמודות. בצע ניתוח מעקב חלקיקים כדי לעבד את הנתונים המוקלטים ול לחשב את המסלולים.

כדי להשיג פרופילי תצהיר, להקליט תמונה מורכבת של הערוץ הנקבובי כולו לפני, זה הרקע, ולאחר הזרקה של ההשעיה חיידקי דרך המכשיר microfluidic. הסר רקע מהתמונות שנרשמו לאחר הזרקת חיידקים. לחשב את פרופיל התצהיר D כמו הסכום של אות פלואורסצנטי חיידקי לאורך קטעים רוחביים של אורך x של הערוץ הנקבובי.

דמיין את פרופיל התצהיר כאות פלואורסצנטי מקומי לעומת אורך הערוץ הנקבובי. כדי להגדיר את המתקן האוטומטי, מקם את המתקן הרובוטי קרוב למכשיר הנוזלי. חבר את המתקן הרובוטי למחשב שבו פועל BCNC וזהה את יציאת com הנכונה.

ב- BCNC, לחץ על לחצן הבית כדי להחזיר את המתקן הרובוטי למיקום הבית. חבר את המשאבה ההיסטלטית עם הפנימה באמצעות צינורות בקוטר פנימי באורך 50 ס"מ, צינורות בקוטר פנימי של מילימטר אחד, ואת הזרימה עם המתקן האוטומטי באמצעות אותו צינורות. מטפח משאבה בינוני דרך המכשיר הנוזלי.

שימו לב להגעת המדיום לשקע הצינור הקבוע למתקן הרובוטי והכניסו צלחת של 96 באר שתאסוף את הזרימה. במקביל, להפעיל את המתקן הרובוטי ולהזריק את ההשעיה חיידקי דרך המכשיר נוזלי PMMA בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר לדקה. להזריק השעיה חיידקית שווה ערך למספר כרכים נקבוביות.

לדוגמה, פי 30 מנפח ההתקן הנוזלי. לאחר ההזרקה, עבור למדיום טיפוח סטרילי עד סוף הניסוי. לאחר השלמת צלחת 96 באר, לכסות את הצלחת ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד ניתוח ציטומטריה זרימה.

לנתח דגימות עם cytometry זרימה לדמיין עקומות פריצת דרך על ידי נרמול ריכוז חיידקי קולחים C עם ריכוז חיידקי בשפעת C0 התוויית C מעל C0 לעומת הזמן. במחקר זה, באמצעות שני מוטילים ולא מוטילים Pseudomonas putida KT2440, ניסויים רציפים בוצעו במכשירים מיקרופלואידיים PDMS עם מערך אקראי של עמודים. עקומות פורצות דרך מנורמלות לריכוז של תאים מוזרקים, כמו גם מסלולים חיידקיים בסולם הנקבוביות מוצגים כאן.

כמו כן בוצעו ניסויים בהתקנים נוזליים בקנה מידה גדול הטחונים מ-PMMA. מוטיב ולא מוטיבציה Pseudomonas putida KT2440 הוזרקו לתוך מטריצה נקבובית רווחים באופן קבוע. באופן מדהים, בסביבה נקבובית נטולת ביופילם, מוטיב ופסאודומונס ללא מוטיבציה putida KT2440 הראה התנהגות תחבורה שונה במידה ניכרת המבוססת על עקומות פורצות דרך.

במטריצה נקבובית שהתיישבה במשך 48 שעות עם קהילת ביופילם זרם מורכבת, הבדלים אלה בעקומות פורצות דרך בין מוטיב לפסאודומונס שאינם מניעים פואידה KT2440 נעלמו. אנו משתמשים במערכת זו כדי לחקור הובלה חיידקית בנחלים, אך ניתן להתאים כלים אלה בקלות לחקר תופעות תחבורה חיידקית במערכות מהונדסות וסביבתיות אחרות. הובלה חיידקית באמצעות מדיה נקבובית hydrated encapsulate תהליכים על פני סולמות מרחביים מרובים.

המתודולוגיה המוצגת כאן מאפשרת לקשר את התזוזה המקומית של חיידקים בסולם הנקבוביות לתחבורה המיקרוסקופית בכל המדיום הנקבובי.