Name: עיבוד מלא של רקומביננטי KRAS4b: בידוד ואפיון של חלבון הפרג והמתילנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: למדו פרוטוקול לבידוד KRAS מעובד מלא עם תפוקה גבוהה מתאי חרקים. השיטה מאפשרת ניסויים ביופיזיים ומבניים עם חלבון פרג ומתילנטי אותנטי לחקר סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים שיבוט והבעה תמיכה מקאריסה Grose, ג'ן Melhalko, ו מאט דרו במעבדת ביטוי חלבון, פרדריק המעבדה הלאומית לחקר הסרטן. פרויקט זה ממומן במלואו או בחלקו עם כספים פדרליים מן המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, תחת חוזה לא. HHSN261200800001E. התוכן של פרסום זה אינו משקף בהכרח את ההשקפות או המדיניות של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש, וגם לא מזכיר שמות מסחריים, מוצרים עסקיים או ארגונים המזכירים אישור ממשלת ארצות הברית

<ol><li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+prenylation%3A+more+than+just+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li>
<li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Prenylation%3A+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li>
<li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity%3A+implications+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li>
<li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).</li>
<li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pleiotropic+effect+of+statins%3A+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li>
<li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758(2013).</li>
<li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li>
<li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li>
<li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li>
<li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dragging+ras+back+in+the+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li>
<li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910(2012).</li>
<li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-Ras4B+lipoprotein+synthesis%3A+biochemical+characterization%2C+functional+properties%2C+and+dimer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li>
<li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+%284B%29+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li>
<li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li>
<li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li>
<li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79(2019).</li>
<li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li>
<li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect%2Fbaculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li>
<li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE%CE%B4%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanism+of+drug%2FLipid+membrane+interactions+using+Biacore%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li>
<li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li>
<li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאמור בסעיף תוצאות הנציג, הצעד הקריטי ביותר במהלך הטיהור הוא טיפול במדגם במהלך הזמן שהוא במלח נמוך. הגבלת הזמן שהמדגם נחשף לפחות מ-200 מ"מ והוא יסייע להפחית משקעים ולהגדיל את התשואה למדגם. פענוח תוצאות CEX יכול להיות קשה אם הפרופיל אינו תואם את הציפיות (ראה איור 2). עד שהפרוטוקול הופך לשגרה, מומלץ להקפיד על שברים שאינם נלקחים קדימה מאוחסנים ב-80 ° c עד להשלמת ניתוח המסה ללא שינוי, כדי להבטיח שהחומר הנכון נלקח קדימה. מחוץ לפרמטרים שצוינו לעיל עבור ה-CEX, הפרוטוקול קל יחסית לשנות את שלבי הליזה...

שינויי posttranslational ממלאים תפקיד מרכזי בהגדרת הפעילות הפונקציונלית של חלבונים. שינויים כגון זירחון וגליקוציה מבוססים היטב. השינויים השומנים מאופיינים פחות טוב, עם זאת. מעריכים כי ככל 0.5% של כל החלבונים הסלולריים עשויים להיות הסכם1. הפרלציה היא העברה של 15 פחמן farnesyl או 20-פחמן geranylgeranyl שרשרת השומנים לקבלה חלבון המכיל את המוטיב CAAX2. חלבונים מראש היו מעורבים בהתקדמות של מחלות אנושיות מספר כולל הזדקנות מוקדמת3, אלצהיימר4, בתפקוד הלב5, choroideremia6, סרטן7. GTPases קטנים, HRAS, NRAS, ו-קראס1, גרעיני למינציה, ו קינטומטלות cenp-E ו-F הם חלבונים מתחת למצב הבזליים. GTPases קטנים אחרים, כלומר RhoA, Rhoa, Rac1, cdc-42, ו RRAS הם geranylgeranylated ואילו Rhoa יכול להיות farnesylated או Geranylgeranylated9.
GTPase קטן KRAS4b מתפקד כמתג מולקולרי, ביסודו של דבר שידור גורם הגדילה מחילוץ איתות כדי התמרה אות תאיים מסלולים המעוררים צמיחת תאים והתפשטות, באמצעות אינטראקציות חלבונים חלבון מרובים. ישנם שני היבטים מרכזיים של KRAS4b ביוכימיה החיוניים לפעילותה. ראשית, החלבון מחזורי בין התמ ג לא פעיל ומצב פעיל של GTP שבאמצעותו הוא מעורב באופן פעיל עם העריקים. שנית, אזור C-מסוף פולי ליזין ו מעטפת ו carboxyמתילated ציסטאין להפנות את החלבון לקרום פלזמה, המאפשר גיוס והפעלה של מנוכי במורד הזרם. החשבונאי KRAS4b הוא הנהג אונגניים ב הלבלב, המעי הגס, וסרטן הריאות10, וככזה, התערבות טיפולית יהיה יתרון קליני ענק. ייצור של חלבון רקומביננטי שונה באופן אותנטי כי הוא farnesylated ו carboxyמתילמית יהיה לאפשר הקרנה ביוכימית באמצעות KRAS4b בשילוב עם מחליפים ממברנה כגון ליפוזומים או ננודיסקי ליפיד11,12.
Farnesyl טרנספראז (fnt) מזרז את התוספת של farnesyl פירופוספט ל-C-טרמינל ציסטאין במוטיב caax ב KRAS4b. לאחר הפרלציה, החלבון הוא נסחר לרשת האנדופלזמית (ER) שבה האנזים המרה (RCE1) מותיר את שלושת שאריות C-terminal. השלב האחרון בעיבוד הוא מתילציה של משקעים C-terminal החדש של הקרום על ידי חלבון הממברנה ER, isoprenylcysteine מתילגיאז (ICMT). הביטוי של רקומביננטי KRAS4b ב E. coli מביא לייצור של חלבון שלא שונו. ניסיונות קודמים לייצר KRAS4b מעובד הוגבלה בשל התשואות מספיק עבור ניסויים מבניים או תרופות ההקרנה או נכשל לכידה של חלבון בוגר באורך מלא הטבעי13,14. הפרוטוקול המוצג כאן מנצל מהונדסים baculovirus מבוסס תא חרקים מערכת ושיטת טיהור שמייצר מאוד מטוהרים, מעובד באופן מלא KRAS4b בתשואות של 5 מ"ג/L של תרבות התא.
האפיון חלבון זהיר חיוני כדי לאמת את האיכות של חלבונים רקומביננטי לפני היציאה על ביולוגיה מבנית או לימודי סינון סמים. שני פרמטרים מרכזיים של מעובד באופן מלא KRAS4b הם אימות של השינוי הנכון הסכם ואת הזמינות של farnesylated ו carboxyמתילated C-טרמינוס (FMe) לאינטראקציה עם תחליפי ממברנה או שומנים. Electrospray יינון ספקטרומטר מסה (ESI-MS) של KRAS4b-fme שימש כדי למדוד את המשקל המולקולרי ולאשר את הנוכחות של farnesyl ושינויים carboxyמתיל. הספקטרומטר ההמוני היליד, שבו מרססים דגימות באמצעות ממיסים שאינם משפריצו, שימשו כדי להדגים כי KRAS4b-FMe הייתה גם קשורה לקופקטור התמ ג. לבסוף, הספקטרוסקופיית תהודה של פני השטח שימש למדידת הכריכה הישירה של KRAS4b-FMe עם ליפוזומים ללא קיבוע.

<table><tbody><tr><td>1.8 מ"ל צינורות נעילה בטוחה,</td><td>22363204</td><td></td><td>אפנדורף</td> טבעי</tr><tr><td>11 מ"מ Cl SS הכנסה משולבת בקבוקוני דגימה אוטומטית Thermo</td><td>Scientific</td><td>30211SS-1232</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td> <td>שומנים קוטביים של AVANTI</td><td></td><td>850457 לרכוש כמניות נוזליות בכלורופורם</td></tr><tr><td>1-פלמיטויל-2-אולויל-גליצרו-3-פוספו-L-סרין (POPS)</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td></td><td>840034 לרכוש כמניות נוזליות בכלורופורם</td></tr><tr><td>5427R צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC Grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>A998-1 1L</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>09689-250 גרם</td><td></td></tr><tr><td>גז</td><td>ארגון Airgas</td><td>ARUP</td><td></td></tr><tr><td>צלחת בדיקה 384</td><td>קורנינג</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200 מכשיר</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כחול Snap-It אטמים, T/S</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4011-54B</td><td></td></tr><tr><td>ברנסון אולטרסאונד אמבטיה</td><td>תרמו פישר</td><td>15-336-1000</td><td></td></tr><tr><td>קטיון חילופי כרומטוגרפיה (CEX) טור</td><td>GE Healthcare מדעי החיים</td><td>29018183</td><td>HiPrep SP Sepharose ביצועים</td></tr><tr><td>גבוהים CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Dyna Pro קורא צלחות</td><td>Wyatt Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exactive Plus EMR ספקטרומטר מסה</td><td>תרמו מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>F0507-500 מ"ל</td><td>השתמש בבקבוקוני מגיב או טוב יותר</td></tr><tr><td>בקבוקוני גילסון 7x14 מ"מ צינורות</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-12</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני בורג זכוכית עם ספינות</td> <td>קצף PTFEהתמחויות מדעיות</td><td>B69302</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה במהירות גבוהה/שולחן</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-112-114D</td><td>המסוגל עד 4,000 xg</td></tr><tr><td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) פרוטאז</td><td>Addgene</td><td>92414</td><td>מטוהר לפי Raran-Kurussi et al. (2017) הסרת תגי זיקה עם TEV פרוטאז. בתוך: ברג'ס-בראון נ '(עורכים) ביטוי גנים הטרולוגי ב- E.coli. שיטות בביולוגיה מולקולרית, כרך 1586. Humana Press, ניו יורק, ניו יורק</td></tr><tr><td>עמודה כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית (IMAC) GE</td><td>Healthcare Life Sciences</td><td>28-9365-51</td><td>HisPrep FF 16/10</td></tr><tr><td>אספקת מים פנימית, התנגדות Arium Advance</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>של 18 M&Omega; </td></tr><tr><td>סט מכבש ליפידים</td> 0 ס"מ עם מחזיק <td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td></td><td></td></tr> 610023 <tr><td>גז אוויר חנקן נוזלי</td><td></td><td>NI-DEWAR</td><td></td></tr><tr><td>M110-EH</td><td>מיקרופלואידיזר מיקרופלואידיקס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MabPac RP UHPLC עמודה, 4 אום, 3.0 x 50 מ"מ</td><td>Thermo Scientific</td><td>088645</td><td></td></tr><tr><td>MabPac SEC-1 עמודה, 5 אום, 300 &Aring;, 2.1 x 150 מ"מ</td><td>Thermo Scientific</td><td>088790</td><td></td></tr><tr><td>MagTran תוכנה</td><td>תרמו מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול, HPLC כיתה</td><td>VWR כימיקלים</td><td>BDH20864.400</td><td></td></tr><tr><td>NGC מערכת כרומטוגרפיה</td><td>BioRad</td><td>78880002</td><td>NGC QuestTM 100 מערכת כרומטוגרפיה</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA או כלאטורים אחרים</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>מכסי גומי סוג 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-02</td><td></td></tr><tr><td>סדרת S חיישן שבב L1</td><td>GE Healthcare</td><td>29104993</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>13-400-519</td><td>ספיגת 280nm</td></tr><tr><td>אולטרה-15 יחידות מסנן צנטריפוגלי, 10K NMWL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>PES ממברנה</td></tr><tr><td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 מ"ל מסנני צנטריפוגה</td><td>Amicon</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>אופטימה - L80K</td><td>מסוגל ל-100,000 xg</td></tr><tr><td>Vanquish UHPLC (משאבה, לב עמודים ומערכת LC)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Fisher</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>מים, HPLC Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-1L</td><td>עשוי להשתמש במקור מים פנימי (ראה להלן)</td></tr><tr><td>מזרק Whatman GD/XP PES 0.45 מ"מ filter</td><td>GE Healthcare - Whatman</td><td>6994-2504</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur QualBrowser</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>תוכנת פרוטאומיקה</td></tr></tbody></table>

עיבוד מלא של רקומביננטי kras4b: בידוד ואפיון של חלבון הפרג והמתילנטי

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

הפרלציה חלבון הוא שינוי מפתח האחראי על המיקוד חלבונים כדי ממברנות תאיים. KRAS4b, אשר מוטציה 22% של סרטן האדם, מעובד על ידי פרנוסילציה ו carboxymethylation בשל נוכחותם של ' CAAX ' מוטיב תיבת ב C-טרמינוס. מערכת baculovirus הנדסה שימש כדי לבטא farnesylated ו carboxyמתילated KRAS4b בתאי חרקים ותיאר קודם לכן. כאן, אנו מתארים את האפיון המפורט והמעשי של החלבון. במיוחד, שימשו כרומטוגרפיה של אהדה והחלפת יונים כדי לטהר את החלבון להומוגניות. ספקטרומטר מסה שלם ומקורי שימש לאימות השינוי הנכון של KRAS4b ולאימות מחייב של נוקלאוטיד. לבסוף, האגודה הממברנה של farnesylated ו carboxyמתילated KRAS4b ליפוזומים נמדד באמצעות ספקטרוסקופית תהודה משטח המשטח.

אחד המשתנים הגדולים ביותר בפרוטוקול הוא כמות חלבון היעד המבוטאת (His6-MBP-tev-KRAS4b). פרוטוקול זה פותח באמצעות לבודד מתוך קו משולש החוליה הטריקוזוולי , tni-fnl17, המותאמים לצמיחה ההשעיה והוא שואף מנסיוב. בהינתן מגוון רחב של תוצאות שדווחו על פני הקווים השונים תא חרקים עם מערכת הביטוי baculovirus, רצוי Tni-FNL לשמש, לפחות בתחילה, כדי לייצר KRAS4b-Fnl.
חלבון כהה שנודד ~ 65 kDa צריך להיות ברור בתוך שברי ליפוסט, כמו גם את השברים להתחמק (איור 1<...

הפרלציה היא שינוי חשוב בחלבונים היקפיים כריכת ממברנה. תאי חרקים יכולים להיות מניפולציות כדי לייצר farnesylated ו carboxyמתילated KRAS4b בכמויות המאפשרות מדידות ביופיזיקלי של חלבון-חלבון ואינטראקציות חלבונים-השומנים

עיבוד מלא של רקומביננטי KRAS4b: בידוד ואפיון של חלבון הפרג והמתילנטי

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר בידוד והפרדת KRAS מעובד כראוי בתשואה גבוהה. הייצור של KRAS מנומנם אותנטי carboxymethylated מאפשר לבצע ניסויים שיש KRAS בקרום שלהם בדיוק כמו בתאי יונקים. התשואה הגבוהה של הפרוטוקול מבדילה אותו מעבודה קודמת.בדרך כלל אנו מטהרים 3-5 מיליגרם חלבון לליטר חומר ביטוי. זה מאפשר לנו לערוך מגוון ניסויים ביולוגיים ביופיזיים ומבניים. KRAS מוטציה ב 20% של סרטן ו 90% בסרטן הלבלב.אז לאחר פרוטוקול לייצר חלבון מעובד אותנטי הוא די שימושי לפיתוח מסכי סמים, כך שאתה יכול ללמוד את החלבון בפועל כפי שהוא יהיה על הממברנה של תאים סרטניים. פרוטוקול זה הוא גם מאוד שימושי לחקר חלבונים אחרים כי הם farnesylated מעובד באופן מלא בתאים. וככזה, כל מה שאתה צריך לעשות הוא להחליף את KRAS עם החלבון של עניין ולשים אותו לתוך baculovirus.הצעדים הקריטיים הם אלה סביב כרומטוגרפיה חילופי הקטיון. שימוש בעמודה הנכונה והגבלת הזמן שבו החלבון נמצא במאגר מלח נמוך חיוניים להצלחה. ההבנה כי המשקעים אינם סוג של כדור שלג של אירוע מסייע להנחות את אלה חדשים לפרוטוקול.זה מחוזק על ידי הצגת הצורך לחלק את עומס עמודת חילופי הקטינות לעומסים קטנים יותר מרובים. לאחר lysing תאים, הבהרת lysate, וטיהור חלבון היעד על ידי IMAC, לנתח את שברי החלבון באמצעות דף SDS וכתמים קומאסי. בריכת שברי השיא דיאליזה הבריכה לילה נגד שני ליטרים של חיץ D בארבע מעלות צלזיוס.ביום שלמחר, להסיר את המדגם מדיאליזה צנטריפוגה אותו ב 4, 000 פעמים g במשך 10 דקות כדי להסיר כל משקעים. הדגימה הדיאליזה והמובהרת הסופית היא לעתים קרובות עדיין מעורפלת אך ניתן להחיל אותה על עמודת CEX ללא עיבוד נוסף. הכן 20 עמודת חילופי יון מיליליטר על ידי שטיפת אותו עם שלושה כרכים עמודה של חיץ G, ולאחר מכן עם שלושה כרכים עמודה של חיץ F.Next, לדלל 20 מיליליטר של המדגם דיאליזה לריכוז נתרן כלורי סופי של 100 מילימולר על ידי הוספת 20 מיליליטר של מאגר E ולהחיל את המדגם על עמודת החליפין.זה קריטי לדלל את הכמות הקטנה של המדגם במקום בבת אחת ואת הדגימות מדולל צריך להיות מיושם על הטור מיד לאחר דילול כדי להגביל את המשקעים של החלבון. המשך לטעון את העמודה עם מדגם מדולל טרי כאשר הדילול הקודם מתקרב לסוף העומס. לאחר מכן שטפו את העמודה לספיגה בסיסית 280 עם מאגר F הדורש בדרך כלל שלושה אמצעי אחסון של עמודות.החלף את החלבון מהעמודה עם שיפוע של 400 מיליליטר ממאגר F ל- 65%buffer G, ואסף את ה- eluent בשישה שברים מיליליטר. לאחר השלמת מעבר הצבע, המשך לשטוף את העמודה לקבלת אמצעי אחסון נוספים של 1.5 עמודות של 65%buffer G.בחר את השברים החיוביים המבוססים הן על דף SDS והן על ניתוח כתמים כחול קומאסי, כמו גם בדיקה של עקבות UV של הכרומטוגרמה. ואז לאסוף את החלבון ולעכל אותו עם פרוטאז TEV His6 על פי הוראות כתב היד.לאחר העיכול והדיאליזה, העמיסו את החלבון על עמוד IMAC של 20 מיליליטר עם חיץ A ב-3 מיליליטר לדקה. לאסוף שבעה שברים מיליליטר במהלך כרומטוגרפיה זו ולשטוף את העמודה עם סך של שלושה כרכים עמודה של מאגר A או עד ספיגה בסיסית הוא הגיע. יש להניף את חלבון היעד עם שיפוע נפח של חמש עמודות של מאגר C מ-0% ל-10% ולאסוף שבעה שברים מיליליטר.לאחר מכן זהה את השברים החיוביים באמצעות דף SDS. כאשר מנתחים אותו עם דף SDS, ה-lysate המובהר צריך להכיל רצועה כהה הנודדת אל כ-65 קילו-דלטון התואמת את חלבון ההיתוך His6-MBP-tev-KRAS4b. ה- FNTAb המובע במשותף עובר ל- 48 קילודאלטונים.הצעד CEX בתוך הטיהור הוא קריטי כי זה מקטין את היקף פרוטאוליזה ומעשיר את החלבון מעובד במלואו, אבל הוא החלק המסובך ביותר של הפרוטוקול. תוצאה אופיינית של שלב זה יש שיא בולט שלוש עם KRAS4b-FMe אבל פרופילי אלוטיון יכול להיות משתנה. ניתוח מסה שלם באמצעות ESIMS לאשר את המסה המולקולרית המדויקת של החלבונים ובכך את החלק היחסי של farnesylation או carboxymethylation.בעוד מגרשים סופיים טיפוסי הכיל כמה KRAS4b-FARN לזיהוי, שיעור זה היה פחות מ 15%במונחים של גובה שיא מניתוח זה. ניתוח מסה מקורי שימש כדי לקבוע את המסה של KRAS4b מחויב לתמ"ג. הממס לדוגמה הוחלף לאמוניום אצטט כדי להבטיח יינון רך יותר המאפשר למתחם המקורי להישאר שלם.האינטראקציה של KRAS4b-FMe וליפוזומים נמדדה עם תהודה פלסמון פני השטח כדי לאמת את farnesylation ו carboxymethylation נדרשים KRAS4b-FMe להיקשר ממברנות. כצפוי, KRAS4b-FMe קשור ליפוזומים בעוד KRAS4b לא מעבד לא. צמצום הזמן שבו החלבון נחשף למלח נמוך הוא ההיבט הקריטי ביותר בפרוטוקול המשפיע על התשואה.החלבון נמצא רק לזמן קצר בריכוז מלח נמוך זה בעקבות הדילול במאגר E.The החלבון יכול לשמש למגוון ניסויים ביופיזיים המשתמשים בפנטומימה של קרום כמו ליפוזומים או ננו-דיסקים כדי לחקור עם אילו שומנים KRAS מקיים אינטראקציה. באמצעות נתונים אלה, אנו יכולים להתחיל לשער כיצד KRAS אינטראקציה עם קרום הפלזמה של התא. באמצעות KRAS-FMe מטוהרים, עמיתינו הצליחו לפתור את מבנה גבישי הרנטגן של KRAS במתחם עם מלווה ספציפי לצורה המטופה והמתילציה של חלבון זה.

fully-processed-recombinant-kras4b-isolating-characterizing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר את ייצור KLRG1 tetramer, אשר הוא כלי רב עוצמה לניתוח KLRG1 ligands.

פרוטוקול לייצור KLRG1 Tetramer

סרטון זה מדגים את טכניקת הכרומטוגרפיה של חילופי קטיונים לבידוד חלבון רקומביננטי מחלבון תא החרק ליזט.

כרומטוגרפיית חילופי קטיונים: טכניקה לבידוד חלבון רקומביננטי מטרה מליזט תאי חרקים בהתבסס על מטען פני שטח נטו

DNA מתילציה מסוגלת לשמור על רמות יציבות של ביטוי גנים וכן לאפשר שינויים דינמיים בביטוי גנים בתגובה למגוון גירויים. אנו מפרטים טכניקות המאפשרות לחקור שינויים ספציפיים לגנים במתילציה של DNA ואת ההשפעה של שינויים אלה על ביטוי גנים.

התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

MRP4 מסדיר אירועי איתות נוקלאוטיד תלוי מחזוריים שונים, כולל תפקיד הובהר לאחרונה נדידת תאים. אנו מתארים גישה ישירה, אך רבה לפענח את המטרות המולקולריות במורד הזרם של MRP4 וכתוצאה מכך ההזדהות של interactome MRP4 ייחודי שמנגן תפקידי מפתח בוויסות מכוונת-הקנס של הגירה פיברובלסטים.

שיטות לחקר Mrp4 המכילים מכלולים Macromolecular בחוק הסדרת פיברובלסטים הגירה

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

הקמנו שיטה לטיהור של חלבונים אינטראקציה coregulatory באמצעות מערכת LC-MS / MS.

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של RNA DNA, חלבונים מדגם זהה, פרוטוקול, במאמץ להפחית את הווריאציה לשפר הפארמצבטית, להקל על פרשנויות.

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

אנו מציגים גישות ניסיוניות של RNA-interactors לימוד של זוגיות גדילי RNA מחייב חלבון קינאז מופעל RNA (PKR) במהלך מחזור התא יונקים באמצעות תאים הלה. שיטה זו משתמשת פורמלדהיד קומפלקסים crosslink RNA-PKR, immunoprecipitation להעשיר PKR מכורך RNAs. אלה RNAs ניתן לנתח נוסף דרך רצף תפוקה גבוהה או לרביעיית-PCR.

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

פרוטוקולים אלה מספקים את המתודולוגיה המשמשת להערכת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMT) בתאים. הנחיות מפורטות על הערכת פעילות PRMT באמצעות סמנים ביולוגיים אנדוגני אקסוגני, מתיל ארגינין זיהוי נוגדנים, ותרכובות כלי מעכב מתוארים.

שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים

הפרוטוקול מציג שיטה להצמדה קוולנטית in vivo של ביוטין לחלבונים על סמך קרבתם לביוטין ליגאז המותך לחלבון מעניין. שינוי זה מאפשר העשרה סלקטיבית של החלבונים באמצעות חרוזי סטרפטווידין לפי הצורך במחקרי אינטראקציה עם חלבונים.

ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia

פרוטוקול זה מתאר את ייצור ריבנוקלאז SLFN14 הרקומביננטי האנושי ואת ניתוחו הסטוכיומטרי באמצעות פוטומטריית מסה.<br...

ייצור מהיר של SLFN14 ריבונוקלאז רקומביננטי וניתוח סטויכיומטרי באמצעות פוטומטריית מסה

למדו פרוטוקול לבידוד KRAS מעובד מלא עם תפוקה גבוהה מתאי חרקים. השיטה מאפשרת ניסויים ביופיזיים ומבניים עם חלבון פרג ומתילנטי אותנטי לחקר סרטן.

עיבוד מלא של רקומביננטי KRAS4b: בידוד ואפיון של חלבון הפרג והמתילנטי

גלה סרטונים נוספים