פרוטוקול אלקטרופורציה אוניברסלי ויעיל להנדסה גנטית של אורגנואידים במערכת העיכול

שיטה זו מאפשרת חילוף יעיל של תרבות תאים תלת-מימדיים כגון אורגנואידים. ניתן להקל על יישומים שונים של הנדסה גנטית. הפרוטוקול הוא אוניברסלי ו ניתן לבצעו תוך יום אחד.

הוא אינו זקוק להכנה מקיפה או למאגרי אלקטרופוזיה מיוחדים וחסכונים. שיטת transfection זו הוכח גידול אורגנואידים בריאים, אבל זה יכול להיות מותאם כדורידים ותרבות תאים דו מימדית, מדי. אם מבצעים פרוטוקול זה בפעם הראשונה, חשוב לטפל אורגנואידים בזהירות בגלל התפשטות הפרט שלהם ואת התגובה דיסוציאציה.

לפקח עליהם מיקרוסקופית במהלך כל ההליך. התחל על ידי טרום המלחמה 48 באר צלחות ב 37 מעלות צלזיוס עבור זריעת אלקטרופולציה פוסט, ולאחר מכן להכין מדיומים ספציפיים לתרבות בסיס אורגנואידים על פי הוראות כתב היד. לטפח חמש בארות של אורגנואידים לכל דגימת אלקטרופולציה בצלחת 48 באר, להכין 230 microliters של דיסוציאציה reagent עם 10 מיקרומולר Y-27632 לגם.

לפקח על האורגנואידים תחת מיקרוסקופ. מוציאים את מדיום התרבות מה בארות ומנתקים את האורגנואידים באופן מכני בתערובת הדיסוציאציה המוכנה. בריכה חמש בארות לכל דגימת אלקטרופולציה לתוך צינור אחד 15 מיליליטר.

מערבבים את תכולת הצינור על ידי מערבולת ודגירה אותו במשך חמש עד 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עד אשכולות של 10 עד 15 תאים להתרחש, בדיקת הדיסוציאציה עם מיקרוסקופ. לעצור את העיכול על ידי הוספת עד 10 מיליליטר של מדיום בסיס ללא אנטיביוטיקה. צנטריפוגה הצינור ב 450 פעמים g במשך חמש דקות, להשליך את supernatant, ולשטוף את התאים פעמיים עם ארבעה מיליליטר של מאגר אלקטרופולציה.

צנטריפוגה להשליך את supernatant לאחר כל לשטוף. לאחר הכביסה, תן שימוש חוזר גלולה organoid ב 100 microliters של מאגר אלקטרופורציה עם 30 מיקרוגרם של DNA פלסמיד. מחלקים את תערובת הדנ"א-אורגנואידים השלמה לקובט אלקטרופולציה.

הקפד להימנע בועות אוויר. הגדר את פרמטרי האלקטרופורציה כמתואר בכתב היד של הטקסט והקש על הקעקומטר באצבע כדי לערבב בעדינות את התאים. מניחים את cuvette לתוך תא cuvette ולחץ על כפתור בלתי תלוי על electroporator כדי לציין את ערך בלתי תלוי.

לחץ על לחצן התחל כדי ליזום את תוכנית האלקטרו-פולציה ולשלוט בערכים של הזרמים, המתחים והאנרגיות המוצגים. לאחר אלקטרופורציה, מיד להוסיף 500 microliters של מדיום תרבות ללא אנטיביוטיקה לתאים ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. מעבירים את הדגימה לצינור חדש של 15 מיליליטר ושטיפת הקובט במדיום בסיס כדי לאסוף את התאים הנותרים, ואז דגירה את התאים בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות.

צנטריפוגה התאים ב 450 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את העל טבעי. תן שימוש חוזר את גלולה ב 100 microliters של מטריצת מרתף וזרע 20 מיקרוליטר טיפות בצלחת מראש 48 היטב. הדגירה את הצלחת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עבור פולמריזציה ולהוסיף 250 microliters של תרבות בינוני בתוספת Y-27632 ו CHIR99021 לגם.

כדי לקבוע יעילות transfection, לבדוק את הפלואורסצנטיות בבקרת transfection תחת המיקרוסקופ לאחר 24 עד 48 שעות. לניתוח FACS, לקצור את התאים כפי שתואר בעבר ולעכל במשך 10 עד 20 דקות עד תאים בודדים נוכחים. מוסיפים עד 10 מיליליטר של PBS וצנטריפוגה התאים ב 450 פעמים g במשך חמש דקות, ואז שאפו והשליכו את העל-טבעי.

כדי להפלות עבור תאים חיים, להשתמש מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS ולהוסיף נוגדן מתאים או פרופידיום יודיד. מערבבים בעדינות את התאים על ידי הקשה ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של PBS, ואז צנטריפוגה להשליך את supernatant.

תן שימוש חוזר לכדור התא ב-200 מיקרוליטרים של PBS וסנן את ההשעיה באמצעות מסננת של 100 מיקרומטר לצינור FACS. נתח את התאים באמצעות מכונת FACS באמצעות אסטרטגיית gating המתאימה וקבע את יעילות ההמרה. אורגנואידים של ארבע ישויות סרטן שונות היו electroporated לפחות שלוש פעמים באמצעות 30 מיקרוגרם של פלסמיד קטן או פלסמיד גדול.

הם נותחו עם ציטומטריה זרימה 48 שעות לאחר אלקטרופורציה מגודר עבור צורת התא, תאים בודדים, תאים חיים, וביטוי eGFP. בכל ארבעת הישויות האורגנואידיות, הפלסמיד הקטן נותב ביעילות גבוהה יותר מהגדולה יותר. ההתמרה היעילה ביותר של הפלסמיד הקטן הושגה באורגנואידים PDAC עם 92.1%GFP תאים חיוביים, ואילו הפלסמיד הגדול נותב ביעילות של 46.7% הפלזמיד הגדול יותר נותב ביעילות רבה יותר לאברנואידים של CRC ביעילות ממוצעת של 53.4% בעוד שהפלסמיד הקטן נותב ביעילות ממוצעת של 84.3% הישות הקשה ביותר לניתג היו אורגנואידים של סרטן קיבה אשר הפגין יעילות transfection הנמוכה ביותר עבור שני פלסמידים.

כהוכחה לתפיסה, אורגנואידים אנושיים תקינים בקיבה היו אלקטרופולקט עם קידוד פלסמיד עבור Cas9, GFP, ו 2sgRNAs מיקוד TP53. שיבוטים נבחרו על ידי ממשל Nutlin3 ואת הנוקאאוט TP53 אושרה על ידי רצף של אללים. כפי שהדגגנו עם אורגנואידים הקיבה האנושית, אלקטרופורציה יעילה מאפשרת מניפולציות בסיס CRISPR Cas9 שונות של תרבויות אורגנואידיות, כגון נוקאאוט או נוקאאוטים, כך שניתן לדגמן מחלות שונות.