Name: קו 1 ניתוח מתילציה בתאי גזע מסנמצאל מטופלים עם אוסטאוסרקומה-מסחטות שלפוחיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: למדו שיטת ניתוח מתילציה ספציפית לבדיקת השפעת שקיפים חוץ-תאיים מסרטן עצם על תאי גזע מסנכימליים. השיטה מאפשרת חקירת שינויים אפיגנטיים ב-DNA וביולוגיית הסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו ממומנת על ידי אוניברסיטת הלסינקי מימון הפרויקט (WBS490302, WBS73714112) הלסינקי אוניברסיטת החולים המדינה מימון לחקר הבריאות ברמת האוניברסיטה (Y1014SUL05, TYH2016130), הקרן לרפואה פינית-נורווגית, ואת סלמה ו קרן מינרווה-ליסה סלאנדר (קרן מינרבה). אנו מודים לוולטר Pavicic על מתן פרוטוקול MSPA שהשתנה ולתמיכה טכנית קשורה. אנחנו אסירי תודה לטאמו Masalin (אוניברסיטת הלסינקי) על שסייע לנו עם הפקת וידאו.

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של הלסינקי ומחוז החולים אוסיסיאא (אישור מוסרי D. No. 217/13/03/02/2015).
1. הכנת הפבס מרוקנת על ידי הפוגות
<ol><li>לקחת FBS (אולטרה) הצינורות צנטריפוגה ולמקם אותם דליים ultracentrifuge. כדי להבטיח שהפוגות מסוימות יפעלו בצורה חלקה ובטוחה, תאזן את הדליים בתוך 10 מ"ג אחד מהשני.</li>
	<li>טען את הדליים ברוטור מתנדנד (סוג SW28, k-factor 246). מניחים את הרוטור ultracentrifuge ולרוץ ב 100,000 x g עבור 19 h ב 4 ° c.</li>
	<li>אספו בזהירות את השכבה העליונה בצבע האור של סופרנאטנט (בערך 9 עשיריות) והעבירו לצינור 50 mL. אין להפריע או פיפטה את הגלולה חום כהה, כפי שהוא מכיל EVs מ FBS.</li>
	<li>להעביר את supernatant באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר לתוך צינור חדש 50 mL.</li>
	<li>הוסף את ה-FBS המועקר של המסנן למדיה של תרבות התא בעת גידול תאים עבור בידוד EV.</li>
</ol>2. בידוד של אוסטאוסרקומה-נגזר EVs
<ol><li>לוח מערכת ההפעלה תאים (HOS-143B קו התא) בבקבוקון T-175 עם RPMI 1640 בינונית, שיושלם עם 10% FBS רגילה ו 1% אנטיביוטיקה (100 U/mL פניצילין, 0.1 mg/mL סטרפטומיצין). מניחים את הבקבוקון בחממה ב 37 ° c ו 5% CO2.</li>
	<li>כאשר הבקבוקון הוא 70%-80% שוטפת, לשטוף את התאים עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) ולאחר מכן לגדל אותם במדיה המכילה 10% EV-מרוקן FBS (להלן המכונה התקשורת EV-לרוקן). הערה: 1 x 106 HOS-143b תאים מצופה T175 בקבוקון מגיע 70% שליטה לאחר כ 60 h.</li>
	<li>במהלך 48 h הבא, לאסוף מדיה ממוזג מתאי אוסטאוסרקומה אחרי כל 24 h ולהוסיף טרי EV מדיה דלה.</li>
	<li>צנטריפוגה את המדיה הממוזגת ב 2500 x g עבור 20 דקות ב 4 ° צ' כדי להסיר תאים ופסולת תא. העבר את הסופרנטאנט לצינור חדש, והשאיר כ-2 מ ל של מדיה בתחתית. הערה: אם לא ישירות להמשיך עם בידוד EV בשלב זה, הסופרנטאנט ניתן לאחסן ב-80 oC.</li>
	<li>יוצקים את supernatant לתוך ultracentrifuge צינורות ולאזן אותם כמו מוקדם יותר. צנטריפוגה את הצינורות ב 100,000 x g עבור 2 h ב 4 ° c.</li>
	<li>, בזהירות, ביטול הסופרנטאנט. משאיר כ-100 מ ל בתחתית הוסף סביב 20 מ ל של PBS (0.1 יקרומטר מסוננים) לצינור ופיפטה בעדינות כדי לשטוף ולהשעות מחדש את הגלולה EV.</li>
	<li>מאזן את הצינורות ולבצע סיבוב נוסף של הקשר עם הגדרות זהות.</li>
	<li>הסר בזהירות את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה EV ב 200 μL של PBS על ידי ליטוף עדין. אחסן את EVs בצינורות קשירה נמוכה. הערה: ניתן להשתמש EVs מייד או אחר מאוחסן ב-80 ° c עד שהם נחוצים.</li>
</ol>3. אפיון מערכת ההפעלה-EVs
הערה: EVs מטוהרים יכול להיות מאופיין על ידי בלוק מערבי (WB), ניתוח מעקב ננו-חלקיק (נ. ת. ע), ומיקרוסקופ אלקטרון שידור (TEM)16.
<ol><li>לבצע WB לפי פרוטוקול סטנדרטי16 עם EV סמנים CD63, TSG101, ו Hsp70, ועם calnexin כפקד שלילי כדי לציין את הטוהר של לדוגמה EV20.</li>
	<li>עבור נ. ת. ע, הראשון לדלל את דגימת EV ב 0.1 יקרומטר מסוננים הPBS של dulbecco להשיג (באופן אידיאלי) 30-100 חלקיקים לכל מסגרת.<ol>
<li>לקחת סביב 500 μL של המדגם לתוך מזרק 1 mL ולטעון אותו לתוך הנמל מפרץ של המכשיר נ. ת. ע. בדקו שיש מספיק חלקיקים לכל מסגרת, למדידות מדויקות.</li>
		<li>פתח את התוכנה נ. ת. ע ולהקליט חמישה קטעי וידאו של 60 s משך, באמצעות מצלמה ברמה 13 בטמפרטורת הסביבה. במהלך הניתוח, השתמש בהסף לזיהוי = 5 והשג = 10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנתח דגימות EV על ידי TEM כמתואר בעבר21.</li>
</ol>4. בתרבות החברה
הערה: רקמת השומן של האדם לבידוד תא גזע mesenchymal סופק כמו שאיבת שומן (המחלקה לכירורגיה פלסטית, לייזר Tilkka בע מ, פינלנד). הסכמה מושכלת בכתב נלקחה מן התורמים ליפוף, אשר עברו בחירה שאיבת שומן.
<ol><li>בידוד AT-MSCs מתוך שאיבת שומן באמצעות שיטות הבידוד מכני ואנזימטי סטנדרטיים22. הערה: ניתן גם להשתמש בMSCs ממקורות אחרים (כולל קווי תא מסחרי).</li>
	<li>תאי תרבות במדיה של DMEM דיה/F-12 בתוספת של 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה.</li>
</ol>5. טיפול בMSCs עם מערכת ההפעלה-EVs
<ol><li>צלחת 15,000 AT-MSCs לבאר 24 היטב צלחת.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, להסיר את התקשורת הישנה, לשטוף תאים עם PBS, ולשנות את התקשורת EV-לרוקן.</li>
	<li>לטפל בתאים עם OS-EVs (בריכוז חלקיקים של 1 x 106 EVs לכל תא) ביום 1 (24 שעות לאחר הדבקה תא), יום 3 (48 h אחרי יום 1), ויום 5 (96 h אחרי יום 1).<ol>
<li>להפסיק את הטיפול OS-EV עבור נקודת זמן (TP) 0 דגימות ביום 1, TP 3 דגימות ביום 3 ו-TP 7 דגימות ביום 7 (48 h אחרי יום 5). הערה: ניתן לעקוב אחר נקודות זמן נוספות לפי התוכניות הנסיוניות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חלץ דנ א מ MSCs באמצעות שיטה המתאימה. כלול דגימות שליטה חיוביות ושליליות עבור ניתוח הנתונים.</li>
</ol>6. שורה-1 מתילציה
<ol><li>עיצוב שורה 1 מותאם אישית בדיקה התחל, כפי שנעשה בעבר על ידי Pavicic et al.23. לבדיקות מתילציה, בחר שלושה רצפים המכילים את אתר ההגבלה של HhaI בתוך אזור המקדם של LINE-1. עבור הבדיקות שליטה, בחר שבעה רצפים חסר ההגבלה HhaI מתוך שאר רצף קו 1. הערה: רצף קו -1 זמין במסד הנתונים של GenBank24 (l 1.2, הצטרפות לא. AH 005269.2). השתמש בהוראות יצרן MSPA לעיצוב הגששים25.</li>
	<li>לדלל 70 ng של דגימת DNA ב TE מאגר לנפח 5 μL.</li>
	<li>בצע את צעדי התרמותרמיים הבאים והPCR כפי שהוזכר בטבלה 1. מחממים את הדגימות ל -10 דקות ב-98 מעלות צלזיוס, ואז מצננים עד 25 ° c.</li>
	<li>הוסף 3 μL של תערובת הכלאה היברידיזציה לכל מדגם ולהפעיל את הציקלטרמר כדי לאפשר את הבדיקות כדי hybridize DNA.</li>
	<li>בטמפרטורת החדר (RT), להוסיף 13 μL של ערבוב שלאחר הכלאה לכל מדגם. העבר 10 μL לשפופרת שנייה.</li>
	<li>מניחים את שני סטים של צינורות בתוך הציקלייט ו הדגירה ב 48 ° c עבור לפחות 1 דקות.<ol>
<li>בעוד דגימות הן ב 48 ° c, להוסיף 10 μL של תערובת ליטל את הקבוצה הראשונה של צינורות (סדרה לא מתעכל) ו 10 μL של ערבוב שילוב העיכול לקבוצה השנייה של צינורות (סדרה מתעכל). תריץ את התוכנית. התרמוטרטרנר הבאה</li>
	</ol>
</li>
	<li>מסובבים את הצינורות ומשטים בו את הציקלטרטרזה עד 72 ° c.</li>
	<li>הוסף 5 μL של מערבבים פולימראז לכל צינור ומניחים את הצינורות של הציקלהטרטרנר. הפעל את תוכנית ה-PCR.</li>
	<li>בעוד תוכנית ה-PCR פועלת, הכן פתרון של מערכת מסוג 1 mL המכילה 2.5 μL של תקן גודל. פיפטה 10 μL של פתרון זה כל טוב של אופטי 96 צלחת הבאר (עם ברקוד).</li>
	<li>לאחר ה-PCR, לדלל את הדגימות מתעכל ומתעכל כדי 1:100 ו 1:200 בהתאמה במים באולטרטהורים. הוסף 2 μL של מוצר PCR מדולל ל 96 צלחת היטב. צנטריפוגה את הצלחת ב 200 x g עבור 15 – 20 s כדי להסיר בועות אוויר.</li>
	<li>לבצע ניתוח רסיס של דגימות על ידי אלקטרופורזה קפילר. הערה: יש לאחסן את הלוח ב -4 ° c בחשכה עד לניתוח.</li>
</ol>7. ניתוח נתוני קטע
<ol><li>פתח את האלקטרופורזה נימים תוצאות בתוכנת ניתוח electropherogram.<ol>
<li>תחת עמודת החלונית , עבור אחת הדגימות, בחר mlpa מהתפריט. לחץ על כותרת החלונית והקש Ctrl + D כדי להחיל mlpa על כל הדגימות.</li>
		<li>באותו אופן, הגדר את שיטת הניתוח לברירת מחדל למיקרו-לווין עבור כל הדגימות.</li>
		<li>בחר את כל הדגימות ולחץ על לחצן הפעל ירוק כדי לנתח את הדגימות לפי ההגדרות שנבחרו.</li>
		<li>בחר את כל הדגימות ולחץ על כפתור הגרף כדי להמחיש את פסגות בדיקה.</li>
		<li>התקרבות באזור השיא לרזולוציה גבוהה יותר של פסגות הגישוש הבודדות. ודא כי כל 10 הפסגות המתאימות הגששים מן הבדיקה LINE-1 לערבב מתויגים. השמט פסגות נוספות (&lt; 95 bp ו &gt; 160 bp).</li>
		<li>בכרטיסיה גנוסוגים , יצא את התוצאות בתבנית ערכים מופרדים באמצעות פסיקים (CSV).</li>
	</ol>
</li>
	<li>פתח את קובץ ה-CSV בתוכנת ניתוח נתונים ומיין את הנתונים לעמודות.<ol>
<li>סמן את שלושת הפסגות באתר מתילציה בהתבסס על הגדלים המשוער שלהם (L1-1m ב 153 bp, L1-2m ב 119 bp, L1-3m ב 133 bp). שבעת הפסגות הנותרות מתאימות לבדיקות הבקרה. הערה: כאן, הערכים של פסגות הבדיקה L1-2m משמשים, אשר בגודל של 117 bp, מאז האזור הזה נעשה שימוש ברוב שורה 1 מתירחון בחני23.</li>
		<li>לכל מדגם (לא מתעכל ומתעכל), חשב את אזור השיא של כל שבעת פסגות הבקרה. חלק את אזור השיא של כל אחד מבין שורה-1 בסכום זה.</li>
		<li>עבור כל דגימת DNA, לחלק את הערך של המדגם מתעכל על ידי זה של המדגם לא מתעכל כדי להשיג את המינון מתילציה יחס (DM) באמצעות המשוואה הבאה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60705/60705eq1.jpg"> היכן: DM הוא יחס המינון של מתילציה,x הוא האזור שמתחת לשיא x (לדוגמה, L1-2m שיא), ו-ctrl הוא אזור השיא של כל שבעת הבדיקות בקרה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenomics%3A+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li>
<li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+Cancer%3A+The+Next+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li>
<li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li>
<li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462(2006).</li>
<li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li>
<li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiQ+Analyzer%3A+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li>
<li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57(2013).</li>
<li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-Specific+MLPA+%28MS-MLPA%29%3A+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128(2005).</li>
<li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li>
<li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA%2C+proteins%2C+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li>
<li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-+derived+microvesicles%3A+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li>
<li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+%22debris%22%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li>
<li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214(2019).</li>
<li>Mannerström, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li>
<li>Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783(2014).</li>
<li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175(2016).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674(2018).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li>
<li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824(2017).</li>
<li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast%3A+A+prospective+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plastic%2C+Reconstructive+%26+Aesthetic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li>
<li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li>
<li>L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000).</li>
<li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018).</li>
<li>Takara Bio Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018).</li>
<li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

מחקר זה ממחיש כיצד MSPA ניתן להשתמש כדי לזהות ולכמת את סטטוס מתילציה של אלמנט גנטי ספציפי. קו -1 היה המוקד כאן, אבל הגששים יכולים להיות מיועדים למקד את מגוון של גנים ורצפים. יתר על כן, יש רשימה גוברת של מתערבב בדיקה זמין עבור יישומים שונים. Mspa היא טכניקה פשוטה ואיתנה עבור ניתוח מתיונין DNA שאינו דורש המרה יסולפיט10. ההליך המלא מן ההכנה לדוגמה לניתוח נתונים לוקח בסביבות 2 ימים, אך רק כרוך 4 – 5 h של עבודה בפועל על הידיים. זה ישים עבור כמויות קטנות של דנ א (נמוך כמו 70 ng), כפי שמוצג כאן.
<p c...

מתילציה DNA היא שינוי. משמעותי בתאי האדם DNA מתילציה מתייחס לחיבור של קבוצות מתיל לשקעים ציטוסין ב-CpG dinucleotides. בדרך כלל מצויים באשכולות (איי ה-CpG) באזור 5 ' של גנים1. בתאים נורמליים, רוב הדיקלאוסים האלה קיימים במצב לא מתילנטי, המאפשר תמלול של דנ א. אגב, סרטן רבים קשורים באיים ה-CpG היפרמתיל והשתקה של2, בעיקר בגנים מדכא הגידול, אשר בתורו לתרום הסימנים השונים של סרטן3.
מצד שני, הרבה מרכיבים גרעיניים שונים-1 (קו-1 או L1s) הם חוזרים ונשנים, רכיבי DNA שבדרך כלל יש רמות גבוהות של מתילציה ב איי ה-CpG. מתילציה של קו -1 מונעת טרנסלוקציה ומסייעת לשמור על שלמות הגנום. במספר סוגים של סרטן, קו -1 הוא hypomethylated, וכתוצאה מכך הפעלה ושלאחר מכן ההפעלה העוקבת-מתווך אי-יציבות כרומוזומלית4. קו 1 חשבונות עבור כמעט 17% של הגנום האנושי5, ומצב מתילציה שלה יכול לשמש כאינדיקטור לרמה העולמית של מתיונין גנולציה6. לפני המעבר שלתאים. לפנוטיפלגידול לכן, הוא מחזיק הבטחה כסמן פוטנציאלי לתחילת הסרטן המוקדמים.
כיום, ישנן מספר שיטות לניתוח מתילציה, כולל פירולציה, PCR ספציפי, מיקרו-מערכים וכרומטין immunoprecipitation1. השימוש ברצף הדור הבא הפך גם את האפשרות לשלב גישות הגנום רחב לגילוי של מתילציה DNA. רבות מהשיטות הללו מסתמכות על דנ א המטופל בביסולפיט, שבו מומרות הציטוסינוסים בלתי מגנטיים לאורצילין ומתילטוסינוסים נותרים ללא שינוי. עם זאת, העבודה עם ה-DNA bisulfite תייחס שטופלו יש מלכודות מספר, כגון המרות שלא הושלמה של ציטוסינוסים unמתיליום כדי uracil, הגברה מוטה של רצפים, ו רצף שגיאות8.
ב מתילציה-הגברה בדיקה ספציפית (MSPA), בדיקות המורכב משני ליגונואותים רצפי DNA היעד המכיל אתר הגבלה (GCGC) עבור אנזים מתילציה רגיש הגבלה HhaI9. לאחר הבדיקות hybridize ל-DNA, כל מדגם מחולק לשתי קבוצות. רגשים בסדרה הראשונה עוברים הארכה, בעוד הבדיקות בסדרה השנייה עוברים הארכה ואחריו העיכול HhaI-תיווך באתרי CGCG unמתילated. שני סטים של דגימות מוגבר אז על ידי ה-PCR, והמוצרים מופרדים על ידי אלקטרופורזה קפיצית. הזונדים באתרים לא מתיללים מתעכלים על ידי hhaI ולא מוגבר במהלך ה-PCR, וכתוצאה מכך אין אותות שיא. לעומת זאת, הגששים באתרי מתיליום מוגנים מפני העיכול, ולכן מוגברת במהלך ה-PCR, ולאחר מכן מייצרים אותות שיא10.
MSPA יש מספר יתרונות על פני שיטות חלופיות. ראשית, זה דורש כמות נמוכה של DNA (50-100 ng) והוא מתאים היטב לניתוח של ה-DNA מ פורמאלין-קבוע פרפין מוטבע דגימות10. זה לא דורש DNA התייחס bisulfite פיט; למעשה, זה לא מתאים DNA כי הוא שונה בדרך זו. דגימות רבות ניתן לנתח באותו זמן, ו MSPA בדיקות יכול להיות מעוצב כך שהם מכוונים גנים מרובים או רצפים בו. בנוסף, הבדיקות הן ספציפיות ורגישות עבור ה-DNA מתילנטי כאתר ההגבלה hhaI מתאים לרצף האופייני לאיי ה-CpG10.
מחקר זה חקר את ההשפעות של אוסטאוסרקומה (מערכת ההפעלה)-שלפוחיות נגזרות (EVs) על קו-1 מתילציה ברקמת השומן הנגזר של הרקמה המטבית (AT-MSCs; איור 1). EVs הם ננו-סקאלה, ממברנה מאוגד שלפוחיות מופרש על ידי סוגי התאים ביותר. הם נושאים חלבונים, שומנים, mrna, מיקרווריה, ומולקולות נוספותמתאיההורה 11,12. EVs תווך תקשורת בין-תאית והפעל תפקידים חשובים במספר מצבים פתופסלוגיים13,14. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי סרטן נגזר EVs עשוי להעביר הפעיל קו -1 לתאים הנמען15. זה דווח מוקדם יותר כי EVs מ-HOS-143B קו התא יכול לשנות את מצב מתילציה של קו 1 ב MSCs, בנוסף להשפעות גנטיות אחרות16.
כאשר התאים הגדלים עבור ev בידוד, חשוב להשתמש ev-מרוקן סרום שור העובר [fbs] במדיום הצמיחה, מאז fbs-נגזר EVs יכול להפריע EVs ממקורות אחרים ולפגוע בתוצאות17,18. ההפוגות היא אחת השיטות הנפוצות ביותר עבור מכלה EVs מ FBS. זהו הליך פשוט וחסכוני יחסית בהשוואה לחלופות כגון אולטראפילטרציהו-FBSמסחרי. כאן, הפרוטוקול גם מדגים כיצד להכין את FBS מרוקן-EV על-ידי הסתבכות.
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט עבור הטכניקות הנ ל, מבידוד של EVs מקו מערכת ההפעלה לניתוח מתילציה של קו 1 ב-OS-EV טיפל MSCs (איור 1).

<table><tbody><tr><td>מזרק 1 מ"ל</td><td>Terumo</td><td>SS+01T1</td><td>לצלחת NTA</td></tr><tr><td>24 בארות</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>MSC</td></tr><tr><td>Cell Culture 3730xl DNA</td><td>Analyzer Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td><td>3730XL</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>קורנינג</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>בקמן אופטימה LE-80K אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BlueStar Prestained Protein Marker</td><td>Nippon Genetics</td><td>MWP03</td><td>WB: סמן חלבון</td></tr><tr><td>Calnexin (שיבוט C5C9)</td> <td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>2679</td><td>WB, דילול 1:800</td></tr><tr><td>CD63 (שיבוט H5C6)</td> <td>BD Biosciences</td><td>556019</td><td>WB, דילול 1:1000</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5702 R</td><td>Eppendorf</td><td>5703000010</td><td>למדיה ותאים ממוזגים</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810</td><td>Eppendorf</td><td>5810000010</td> לספינינג צינור צנטריפוגה <td>צלחת 96 בארות</td></tr><tr><td>(פוליאלומר, 14x95 מ"מ)</td> <td>בקמן</td><td>331374</td><td>אולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 + GlutaMAX בינוני</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>31331-028</td><td>לתרבית AT-MSC</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 תקן גודל LIZ</td><td>מיושם Biosystems, Life Technologies</td><td>4322682</td><td>לאלקטרופורזה נימית</td></tr><tr><td>ערכת GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA)</td><td>Sigma</td><td>WGA2-10RXN</td><td>לבקרה שלילית של MSPA</td></tr><tr><td>Hi-Di formamide</td><td>Applied Biosystems, Life Technologies</td><td>4311320</td><td>לאלקטרופורזה נימית</td></tr><tr><td>קו תאים HOS-143B ATCC</td><td></td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Hsp70 (שיבוט 5G10)</td><td>BD Biosciences</td><td>554243</td><td>WB, דילול 1:1000</td></tr><tr><td>IRDye 800CW עז נגד עכבר</td><td>Li-Cor</td><td>926-32210</td><td>WB:</td></tr><tr><td>IRDye 800CW עיזים נגד ארנב</td><td>Li-Cor</td><td>926-32211</td><td>WB:</td></tr><tr><td>פריימרים משניים LINE-1 לערבב בדיקה</td><td>IDT רצפי IDT</td><td></td><td>בטבלה 1</td></tr><tr><td>מיקרו-אמפר אופטי 96 בארות תגובה עם ברקוד</td><td>Applied Biosystems, Life Technologies</td><td>4306737</td><td>דורש גם סרט איטום</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון Micro BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td>למדוד את ריכוז החלבון</td></tr><tr><td>MiniProtean TGX 10% ג'לים</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1034</td><td>WB: אלקטרופורזה של ג'ל</td></tr><tr><td>NanoSight LM14C</td><td>Malvern Instruments</td><td></td><td>for NTA</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane 0.2 & micro; m</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td>WB: העברת חלבון</td></tr><tr><td>רקמת NucleoSpin XS</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740901.50</td><td>למיצוי DNA</td></tr><tr><td>מאגר חוסם אודיסיאה</td><td>Li-Cor</td><td>927-40000</td><td>WB: חסימה, נוגדנים</td></tr><tr><td>PBS, 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>DE17-602E</td><td>אנטיביוטיקה עבור אמצעי תרבות</td></tr><tr><td>חלבון LoBind צינור, 0.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22431064</td><td>לאחסון EVS</td></tr><tr><td>REVERT ערכת תמיסת כתמים ושטיפה של חלבון כולל</td><td>Li-Cor</td><td>926-11015</td><td>WB: צביעת חלבון כוללת</td></tr><tr><td>קו תאי RKO</td><td>ATCC</td><td>CRL-2577</td><td>עבור MSPA בקרה חיובית</td></tr><tr><td>RPMI מדיום 1640 + GlutaMAX</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>61870-010</td><td>לתרבית תאים HOS-143B</td></tr><tr><td>SALSA MLPA אנזים HhaI</td><td>MRC-הולנד</td><td>SMR50</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ריאגנטים MLPA SALSA</td><td>MRC-Holland</td><td>EK1-FAM</td><td></td></tr><tr><td>SALSA MLPA P300 תערובת בדיקה</td><td>MRC-הולנד</td><td>P300-100R</td><td></td></tr><tr><td>רוטור מתנדנד SW-28</td><td>Beckman Coulter</td><td>342207</td> מסנן מזרק <td>אולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>, 0.22 ומיקרו; m</td><td>Jet Biofil</td><td>FPE-204-030</td><td>סינון סטרילי FBS</td></tr><tr><td>Tecnai 12</td><td>FEI Company</td><td></td><td>מצויד ב-Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., ארה"ב); עבור TEM</td></tr><tr><td>TBS, 1X טבליות</td><td>Medicago</td><td>09-7500-100</td><td>WB: מאגר</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>WB: העברה</td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>TCA0096</tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>לטריפסיניזציה של תאים</td></tr><tr><td>TSG101 (שיבוט 4A10)</td> <td>Sigma</td><td>SAB2702167</td><td>WB, דילול 1:500</td></tr></tbody></table>

קו 1 ניתוח מתילציה בתאי גזע מסנמצ'אל מטופלים עם אוסטאוסרקומה-מסחטות שלפוחיות

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

מתילציה-הגברה בדיקה ספציפית (MSPA) היא טכניקה פשוטה ואיתנה שניתן להשתמש בה כדי לזהות הבדלים יחסיים ברמות מתילציה של דגימות דנ א. זה רב תושייה, דורש כמויות קטנות של DNA, ולוקח סביב 4 – 5 h של הידיים על העבודה. בטכניקה המוצגת, דגימות ה-DNA הם הראשון מאוד לאחר מכן הוכלא בדיקות כי היעד DNA על מתילאו אתרים התייחסות כפקד. ה-DNA הוכלא מופרד לתגובות מקבילות, אחד עובר רק הארכה והשני עובר לאחר ואחריו העיכול HhaI-תיווך ברצפי GCGC unמתילated. שברי הדי. אנ. איי התוצאה הם מוגבר על ידי ה-PCR ומופרדים על ידי אלקטרופורזה קפילר. אתרים GCGC מתילated אינם מתעכלים על ידי HhaI ולייצר אותות שיא, בעוד האתרים GCGC מתעכל מתעכלים ולא אותות שיא נוצרות. השוואת הפסגות מנורמל השליטה של גירסאות מתעכל ובלתי מתעכלות של כל מדגם מספק את יחס המינון מתילציה של דגימת דנ א. כאן, MSPA משמש כדי לזהות את ההשפעות של אוסטאוסרקומה (EVs) על מעמד מתילציה של אלמנט גרעיני ארוך וביניהם-1 (קו -1) בתאי גזע mesenchymal. LINE-1s הם רכיבי DNA חוזרים שבדרך כלל עוברים hypomethylation בסרטן, בקיבולת זו, עשוי לשמש ביואריקר. משמש גם כשיטה חסכונית כדי להפריד ושלפוחיות מתוך נוזלים ביולוגיים (כלומר, כאשר הכנת סרום העוברי EV-מרוקנת [FBS] ובידוד EVs מתוך מדיה אוסטאוסרקומה ממוזג [צנטריפוגה]). עבור ניתוח מתילציה, בדיקות קו 1 מותאמות אישית מיועדות למקד שלושה אתרי מתילציה ברצף המקדם של קו 1 ובשבעה אתרי בקרה. פרוטוקול זה מדגים את השימוש ב-MSPA עבור ניתוח מתילציה של קו 1 ומתאר את הכנת הגושים המרוקנים ב-EV על ידי הסתבכות.

המטרה העיקרית של מחקר זה היה להעריך את ההשפעות epigenetic של OS-EVs ב MSCs. OS-EVs היו מבודדים מתאי-143B באמצעות השיטה הדיפרנציאליות סטנדרטית. הביטוי של האופייני EV סמנים CD63, Hsp70, ו TSG101 על ידי בלוק המערבי אישר את הנוכחות של OS-EVs. (איור 2א). העדר אות calnexin הצביע על טוהר של מערכת ההפעלה-EV בודד. אינדיקציה נוספת של טוהר נצפתה עם TEM, עם שלפוחיות שלמות של גדלים שונים להיות נוכח (איור 2ב). ריכוז החלקיקים הממוצע של OS-EV ה...

המתואר כאן הוא השימוש בשיטה ספציפית הגברה בדיקה כדי לנתח את רמות המטלציה של האלמנטים קו 1 בתאי גזע mesenchymal שטופלו אוסטאוסרקומה נגזר שלפוחיות. בנוסף, הליך פופולרי עבור הפרדת שלפוחיות ושלפוחית של הפרה העובר סרום, הוא הפגינו גם.

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

מתילציה של דנ"א היא אחת החתימות האפיגנטיות הנחקרות ביותר. סוגי סרטן רבים מאופיינים בשינויים ברמות מתילציה DNA, אשר קשורים עם ביטוי גנים חריגים ומומים גנומיים אחרים. יסודות גרעיניים ארוכים משולבים הם רצפים גנומיים חוזרים ונשנים שבדרך כלל יש להם רמות גבוהות של מתילציה.עם זאת, לעתים קרובות הם הופכים hypermethylated בסרטן, אשר לגרום ההפעלה שלהם ומוביל לחוסר יציבות כרומוזומלית. במחקר זה, טיפלנו בתאי גזע mesenchymal עם ארסים חוץ תאיים שמקורם osteosarcoma כדי לראות אם כלי רכב חשמליים סרטניים יכולים להשפיע על מתילציה LINE-1 ב- MECs. סרום חזיר עוברי, שהוא מרכיב אינטגרלי במדיה של תרבות תאי היונקים, מכיל מספר רב של כלי רכב חשמליים שמקורם בבובין.Evs אלה יפריעו לניתוח של Evs מתאים מעניינים שלנו, ולכן, כאשר גדל תאים לבידוד EV, חשוב להשתמש FBS מדולדל EV. קח את FBS בצינורות אולטרהצנטריים והצב אותם בדליים אולטרה-מרכזיים. לאזן את הדליים בתוך 10 מיליגרם אחד מהשני לפני טעינת אותם על רוטור מתנדנד.מניחים את הרוטור באולטרהצנטריפוגה ולרוץ ב 100, 000 G במשך 19 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הריצה, בזהירות לאסוף את השכבה העליונה בצבע בהיר של supernatant ולהעביר אותו צינור 50 מיליליטר. אין להפריע או להצינור את גלולת החום הכהה מכיוון שהיא מכילה כלי רכב חשמליים מ- FBS.מעבירים את העל-טבעי דרך מסנן 0.22 מיקרון לצינור חדש של 50 מיליליטר. FBS מעוקר מסנן זה, מדולדל EV כעת ניתן להוסיף למדיית תרבות התא בעת גידול תאים עבור בידוד EV. לאסוף מדיה מותנה מתאים osteosarcoma גדל בתקשורת מדולדל EV.כדי להסיר תאים ופסולת תאים, צנטריפוגה התקשורת המותנה ב 2500 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי לצינורות אולטרה-מרכזיים ומאזנים אותם כמו קודם לכן. צנטריפוגה הצינורות ב100, 000 G במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.בזהירות להשליך את העל טבעי עוזב סביב מיליליטר אחד בתחתית. מוסיפים כ-20 מיליליטר של PBS לצינור ומצינורים בעדינות כדי לשטוף ולהשעות מחדש את גלולת ה-EV. לאזן את הצינורות ולבצע סיבוב נוסף של אולטרהצנטריות עם אותן הגדרות.בזהירות להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת EV ב 200 microliters של PBS על ידי צינורות עדינים. אחסן את כלי רכב חשמליים בצינורות עם כריכה נמוכה. כלי רכב חשמליים מטוהרים מאופיינים על ידי כתמים מערביים, ניתוח מעקב חלקיקים, מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.צלחת 15, 000 MSCs ל הבאר בצלחת 24 באר. לאחר 24 שעות, הסר מדיה ישנה, שטף את התאים באמצעות PBS ושנה למדיה המדולדל EV. לטפל בתאים עם OS-EVs בנקודות הזמן המתוזמנות.לאחר הפסקת הטיפול EV, לחלץ DNA מהתאים בשיטה המתאימה. לניתוח מתילציה, השתמשנו בשיטת הגברה ספציפית לתילציה בהתאמה אישית. תכנן את בדיקות LINE-1 המותאמות אישית, כפי שנעשה בעבר, על ידי Pavicic ואחרים.עבור בדיקות מתילציה, בחר שלושה רצפים המכילים את אתר הגבלת HhaI בתוך אזור האמרגן. עבור בדיקות בקרה, בחר שבעה רצפים ללא אתר הגבלת HhaI משאר רצף LINE-1. לדלל 70 ננוגרם של דגימת DNA במאגר TE לחמישה מיקרוליטרים.מחממים את הדגימות במשך 10 דקות ב 98 מעלות צלזיוס ואז להתקרר ל 25 מעלות צלזיוס. הוסף שלושה microliters של תערובת הכלאה בדיקה לכל מדגם ולהפעיל את התרמוצ'ילר כדי לאפשר לבדיקות הכלאה ל- DNA. בטמפרטורת החדר, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תערובת שלאחר ההכלאה לכל מדגם.מעבירים 10 מיקרוליטרים לצינור שני. מניחים את שני סטים של צינורות בתרמוצ'ילר ודגירה ב 48 מעלות צלזיוס לפחות דקה אחת. בעוד הדגימות הן ב 48 מעלות צלזיוס, להוסיף 10 microliters של תערובת קשירה לקבוצה הראשונה של צינורות ו 10 microliters של תערובת עיכול קשירה לסט השני של צינורות.הפעל את תוכנית התרמוצ'ילסר הבאה. לאחר מכן, לסובב את הצינורות בו זמנית להגדיר את התרמוצ'ילר ל 72 מעלות צלזיוס. מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של תערובת פולימראז לכל צינור ומ מניחים את הצינורות בתרמוציקלר.הפעל את תוכנית PCR. בזמן שתוכנית ה-PCR פועלת, הכינו פתרון של תרכובת מיליליטר אחת המכילה 2.5 מיקרוליטרים בתקן גודל. Pipet 10 מיקרוליטרים של פתרון זה לכל שורה של צלחת באר אופטית 96.לאחר PCR, לדלל את דגימות מעוכל מעוכל אחד עד מאה ואחד עד מאתיים, בהתאמה במים טהורים במיוחד. הוסף שני מיקרוליטרים של מוצר PCR מדולל לצלחת 96 באר. צנטריפוגה הצלחת ב 200 G במשך 15 עד 20 שניות כדי להסיר בועות אוויר.לבצע ניתוח שבר של דגימות על ידי אלקטרופורזה נימי. פתח את תוצאות האלקטרופורזה נימי בתוכנת ניתוח אלקטרופרוגרמה. בחרו דוגמה והגדירו את החלונית ל-MLPA מהתפריט.לחץ על הלוח ולחץ על פקד D כדי להחיל הגדרה זו על כל הדגימות. באופן דומה, הגדר את שיטת הניתוח כברירת מחדל microsatellite עבור כל הדגימות. בחר את כל הדגימות ולחץ על כפתור המשחק הירוק כדי להפעיל ניתוח, ולאחר מכן בחר את כל הדגימות ולחץ על כפתור הגרף כדי לדמיין את פסגות הבדיקה.הגדל את אזור השיא לקבלת רזולוציה גבוהה יותר של הפסגות הבודדות. ודא כי כל 10 פסגות המתאימות לבדיקות מתערובת החללית LINE-1 מסומנים. בכרטיסיה גנוטיפים, יצא את התוצאות בתבנית CSV.פתח את קובץ ה- CSV בתוכנה לניתוח נתונים ומיין את הנתונים לעמודות. סמן את שלושת פסגות אתר המתילציה לפי הגדלים שלהן. שבע הפסגות הנותרות תואמות את בדיקות הבקרה.כאן אנו משתמשים בפסגות הגשושית LINE-1 2M שגודלן כ-117 זוגות בסיסים. עבור כל מדגם, חשב את אזור שיא הסכום של כל שבע פסגות הבקרה. חלק את אזור השיא של כל בדיקה LINE-1 בסכום זה.עבור כל מדגם, לחלק את הערך של המדגם מתעכל על ידי זה של המדגם מעוכל כדי לקבל את יחס המינון מתילציה. ניתוח סופג מערבי אישר את נוכחותם של כלי רכב חשמליים עם אותות שנצפו עבור TSG101, HSP70 ו- CD63. היעדר אות calnexin הצביע על כך שדגימה EV היה טהור.אינדיקציה נוספת של טוהר נצפתה עם TEM עם תנודות שלמות בגדלים שונים נוכח מדגם OS-EV. ריכוז חלקיקי OS-EV והתפלגות הגודל נמדדו על ידי NTA. 80% מהרכבים התת-חשמליים היו בטווח גודל של 50 עד 200 ננומטר.כאן אנו יכולים לראות את יחסי המינון מתילציה של LINE-1 מ MSCs בנקודות זמן שונות של הטיפול EV. הקו האפור מייצג רמת מתילציה בסיסית מנקודת זמן אפס. בנקודת זמן שלוש, יש ירידה ביחס המינון מתילציה הממוצע לאחר הממשל של כלי רכב חשמליים, ובכך מצביע על היפרמתילציה.אפקט זה hypermethylating של כלי רכב חשמליים בולט פחות בנקודת זמן שבע. כאן הראינו טכניקה פשוטה, רגישה וחזקה לניתוח מתילציה. זה דורש כמות נמוכה של DNA ללא המרה bisulfite מעורב וזה מתאים גם DNA מבודד מדגימות מוטבע פרפין.השיטה כולה, עם החלקים הניסיוניים והאנליטיים, אורכת כיומיים. בשל מספר עותק גבוה של LINE-1 בגנום, המתילציה הבסיסית של LINE-1 גבוהה בדגימות רגילות. לכן, ההבדלים ברמות מתילציה של דגימות, כפי שנצפה בשיטה זו, עשויים להיות עדינים.

line-1-methylation-analysis-mesenchymal-stem-cells-treated-with

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

הזרקה ישירה של נגזר סרטן שלפוחית חוץ-תאית (EVs) שמוביל התכנות של מח העצם תמיכה התקדמות הגידול; עם זאת, אילו תאים לתווך את האפקט הזה לא ברור. במסמך זה, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לחקור בתיווך EV הגידול-mesenchymal תאי גזע (MSC) אינטראקציות ויוו, חשיפת תפקיד מכריע עבור EV משכילים MSCs ב גרורות.

דגם פרה העכבר של אוסטאוסרקומה כדי להגדיר את התקשורת חוץ-תאית שלפוחית בתיווך בין גידול בתאי גזע Mesenchymal

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדור של pluripotent המושרה בתאי גזע (iPSCs) מ תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית (הסימולטור) החולה נגזר fibroblasts, הבידול של iPSCs באמצעות גזע mesenchymal (MSCs) תאי העצם, מידול vivo tumorigenesis באמצעות תאי העצם של החולה-derived הסימולטור.

מידול אוסטאוסרקומה באמצעות תאי גזע Pluripotent נגזר החולה המושרה תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית

פרוטוקול זה מדגים כיצד לטהר חוץ-תאי מיקרו Rna מאמצעי התרבות התא עבור שיפוצים קלים של ספריית RNA ורצף הדור הבא. מחסומים בקרת איכות שונים מתוארים כדי לאפשר לקוראים להבין למה לצפות כאשר עובדים עם דגימות קלט נמוך כמו exRNAs.

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

המודל מטריצה חוץ-תאית (טוב) עצם אוסטאוסרקומה (OS) הוא מבוסס היטב שמוצג כאן. זה יכול לשמש בדומה לפיגום מתאימים מחקה הגידול העיקרי לצמיחה במבחנה , מתן מודל אידיאלי ללמוד את הטרוגניות היסטולוגית ו cytogenic של מערכת ההפעלה.

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור האנושי (hUC-MSC-sEVs) באמצעות הגדרה פשוטה בקנה מידה של מעבדה. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, סמני sEVs והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV מבודדים מאופיינים בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה.

שיטת סינון פשוטה לבידוד בועיות חוץ-תאיות קטנות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הצנטריפוגה הדיפרנציאלית לבידוד ואפיון כלי רכב חשמליים מייצגים (אקסוזומים ומיקרובוסיקלים) מתאי MSC אנושיים מתורבתים. יישומים נוספים של כלי רכב חשמליים אלה מוסברים גם במאמר זה.

בידוד, אפיון ויישום טיפולי של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים בתרבית

פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של מיון שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) המשתחררות על ידי תאי סטרומה מזנכימליים. בפרט, הוא מתמקד בהגדרת המכשיר ובאופטימיזציה של תנאי המיון. המטרה היא למיין שלפוחיות חוץ-תאיות תוך שמירה על המאפיינים שלהן.

הגדרת מיון מוצלח לבידוד שלפוחית חוץ-תאית

פרוטוקול זה מספק גישה מפורטת להערכת רמות שינוי m6A של RNA ספציפי באמצעות MeRIP-qPCR.

מבחן MeRIP-qPCR לזיהוי שינויים ברמות m6A של RNA ספציפי בתאי אוסטאוסרקומה

דו"ח זה מתאר שיטת Bioengineering לתכנן ולבנות גורמי שחבור מלאכותיים רומן (ASFs) כי דווקא לווסת את השחבור של גני המטרה בתאי יונקים. שיטה זו ניתן להרחיב עוד להנדס גורמים מלאכותיים שונים כדי לתפעל היבטים אחרים של חילוף החומרים RNA.

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאים אנושיים לניתוח גורמי התחלת תרגום הקושרים את מכסה ה-5' של mRNA בתנאי חמצן פיזיולוגיים. שיטה זו משתמשת באנלוגי כובע m7GTP המקושר לאגרוז ומתאימה לחקירת גורמי קשירת כובע ושותפיהם האינטראקטיביים.

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

למדו שיטת ניתוח מתילציה ספציפית לבדיקת השפעת שקיפים חוץ-תאיים מסרטן עצם על תאי גזע מסנכימליים. השיטה מאפשרת חקירת שינויים אפיגנטיים ב-DNA וביולוגיית הסרטן.

קו 1 ניתוח מתילציה בתאי גזע מסנמצ'אל מטופלים עם אוסטאוסרקומה-מסחטות שלפוחיות

גלה סרטונים נוספים