Name: מדידה של הרוצח הטבעי Cell-בתיווך ציטורעילות והגירה בהקשר של תאים סרטניים בכבד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: למד פרוטוקולים ללא רדיואקטיביות למדידת ציטוטוקסיות ונודדות של תאי NK בתאי סרטן כבד. השיטות כוללות מבחני LDH ו-Calcein AM לניתוח תפקודי מערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בהכרת תודה מענקי המכון הלאומי לבריאות: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW), ו-1R01 CA218008-01A1 (NW). אנו מכירים גם את מחלקת ההגנה מימון W81XWH1910480 ו W81XWH-18-1-0069 כדי NW.

1. הכנת התרבות בינונית עבור תאים NK ותאים סרטניים בכבד
<ol><li>השימוש האנושי הרוצח תאים האדם (g., NK92MI) וסרטן הכבד האדם קו התא (למשל, SK-הפטיטיס -1).</li>
	<li>הכנת NK התרבות התא בינונית עבור NK92MI האדם בתאי NK על-ידי הוספת הרכיבים הבאים כדי 500 mL של מינימלי חיוני הנשר הבינוני אלפא ללא ribonucleosides ו deאוקסיribonucleoקלייאוצדדים לריכוזים הסופי המצוין: 0.02 מ"מ חומצה פולית (100 μL של 100 מ"מ חומצה פולית), 0.2 מיואינוזיטול (500 μL של 200 מ"מ מיונוזיטול), 0.1 mM β-mercaptoethanol (3.5 μL של 14.3 M β-mercaptoethanol), 2 מ"מ L-גלוטמין (5 מ מ של 200 מ"מ L-גלוטמין), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (5 מ ל של הפניצילין 100x/סטרפטומיצין), 12.5% שור עוברי סרום (FBS) ו-12.5% סרום לסוסים. לערבב ולסנן לחטא באמצעות יחידת סינון מסנן 0.22 יקרומטר, ולאחסן ב 4 ° c.</li>
	<li>הכנת מדיום התרבות עבור קו הגידול של הכבד סק-הפטיטיס-1 על-ידי הוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין כדי גלוקוז גבוה בינונית משתנה הנשר של מדיום (DMEM) המכיל 2 מ"מ L-גלוטמין.</li>
</ol>2. מדידת מדידות LDH מבוססי תא NK-מתווכת הרעלת הרעלה
<ol><li>לגדול SK-הפטיטיס-1 תאים ל 70-80% השטף בתרבות תא 100 מ"מ צלחת פטרי בתוך 5% CO2 ב 37 ° c ב חממה2 שיתוף. יצירת תא בודד השעיה על ידי הראשון כביסה תאים עם 5 מ ל של 1x פוספט מאגור מלוחים (PBS) ואחריו הדגירה עם 1 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA ב 5% CO2 ב 37 ° צ' בחממה2 עד ההשעיה תא יחיד נוצר. הערה: הפעילות התאית של NK יכולה להיגרם על ידי תאי סרטן לחוצים עקב שינויים בביטוי של הפעלת תאים מבוססי-NK ובתאי סרטן. לכן, תאים בריאים ומשניים של סרטן שוטפת יש להשתמש עבור תוצאות מדויקות. חשוב גם לציין כי הקולטנים הסלולריים NK וליגנדס יכול להיות רגיש לטריסיזציה26,27. לכן יש להימנע מלאפשר את הליך הטריסינוניזציה ולמנוע טריסינזציה מוגזמת.</li>
	<li>לאחר טריסיוניזציה, להוסיף 10 מ ל של SK-הפטיטיס-1 בינוני התרבות ו צנטריפוגה ב 160 x g עבור 3 דקות ב 15 מ"ל צינור צנטריפוגה מעוקר. לשטוף את הגלולה תא עם 5 מ ל של PBS 1x ו להשעות מחדש 5 מ ל של התרבות הבינונית.</li>
	<li>במקביל, צנטריפוגה את התאים NK92MI ב 160 x g עבור 3 דקות בשפופרת צנטריפוגה סטרילית 15 מ"ל. לשטוף את הגלולה תא עם 5 מ ל של PBS 1x ו השעיה מחדש ב 5 מ ל של NK92MI התרבות התאית בינונית. הערה: התאים הNK92MI גדלים בתווך של תרבות התא NK ומתקבלים באופן דומה כמתואר בשלב 2.1.</li>
	<li>לספור את התאים SK-הפטיטיס-1 ו-NK92MI באמצעות הומוציטוטומטר או כל מונה תא אוטומטי זמין.</li>
	<li>הוספת SK-הפטיטיס-1 תאים (היעד תאים) (1 x 104/100 μl/ובכן) ו NK92MI תאים (התאים האחרים) (1 x 105/100 μl/טוב) ביחס של 1:10 היעד: אפקטור וזרע בבארות טרילקאט בצלחת הבאר 96.</li>
	<li>מודטה 96 צלחת הבאר ב 37 ° צ' באווירה של 95% האוויר 5% CO2 עבור 3 h. לאחר דגירה, צלחת צנטריפוגה ב 450 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מבלי להפריע את הגלולה תא, לאסוף 100 μL של supernatant מכל טוב ולהעביר באר ב-96 היטב הצלחת.</li>
	<li>הוסף 50 μL של המצע LDH, מערבבים היטב, ו מודקת את הצלחת 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>להפסיק את התגובה על ידי הוספת 50 μL של פתרון הפסקה (50% diמתילאומיד ו 20% נתרן dodecyl סולפט ב-pH 4.7). מיד למדוד את ספיגת הצלחת ב 490 ננומטר ו 680 nm באמצעות קורא צלחת.</li>
	<li>הפחת את ספיגת ה680 ננומטר מתוך הספיגה של 490 ננומטר. חישוב האחוז (%) הרעילות של תא NK באמצעות הנוסחה שלהלן. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq1.jpg"> כאשר ה-LDH ניסיוני (אפקטור + תאי יעד) הוא ספיגה של תאים NK92MI ו-SK-1 תאים, LDH אפקטור תאים הוא ספיגת תאים NK92MI בלבד, LDH ספונטנית היא ספיגת התאים SK-הפטיטיס-1 לבד, ו-LDH המקסימלי הוא ספיגה של SK-הפטיטיס-1 תאים עם מאגר לליזה. הערה: כדי להפחית הפרעות בסרום, השתמש תמיד בפקדים הבאים: תאי היעד בלבד (SK-הפטיטיס-1), תאים אפקטור בלבד (NK92MI), היעד תאים עם מאגר הליזה כפקד פירוק מוחלט, תא היעד בינונית, NK92MI medium, כמו גם תא היעד בינונית ו NK92MI בינונית ביחס 1:1.</li>
</ol>3. calcein AM צביעת מבוססי שיטה מיקרוסקופית למדידת תא NK-רעילות בתיווך
<ol><li>התרבות SK-הפטיטיס-1 תאים ל 70-80% השטף. צור תא יחיד השעיה על ידי הראשון כביסה תאים עם 5 מ ל של 1x PBS ואחריו דגירה עם 1 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA.</li>
	<li>צנטריפוגה SK-הפטיטיס-1 תאים בצינור 1 מ ל צנטריפוגה סטרילית ב 160 x g עבור 3 דקות. להשעות את הגלולה ב 3 מ ל של סרום ללא הבחנה.</li>
	<li>הוסף 1.5 μL של calcein AM פתרון (10 מ"מ) כדי SK-הפטיטיס-1 תאים ו דגירה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה calcein AM-התווית SK-הפטיטיס-1 תאים ב 160 x g עבור 3 דקות בשפופרת צנטריפוגה סטרילית 15 מ"ל.</li>
	<li>לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ ל של 1x PBS להסיר calcein העודפים צבע AM.</li>
	<li>במקביל, צנטריפוגה NK92MI תאים ב 160 x g עבור 3 דקות בשפופרת צנטריפוגה סטרילית 15 מ"ל. לשטוף את הגלולה תא פעם עם 5 מ ל של ה-PBS 1x ו-השעיה מחדש ב 5 מ ל של NK92MI cell בינונית.</li>
	<li>הרוזן calcein AM-תווית SK-הפטיטיס-1 תאים ו NK92MI תאים באמצעות הומוציטוטומטר או מונה תא אוטומטי.</li>
	<li>להשעות SK-הפטיטיס-1 תאים בתווך התרבות ב 1 x 105 תאים/ML ו NK92MI תאים ב 1 x 106 תאים/ML במדיום התא NK.</li>
	<li>הלוח calcein AM-התווית SK-הפטיטיס-1 תאים (היעד תאים) (1 x 104/100 μl/ובכן) עם NK92MI תאים (בתאי אפקטור) (1 x 105/100 μl/ובכן) (1:10 היעד: היחס של אפקטור) לבאר שלישיה בבארות בצלחת 96.</li>
	<li>מודטה 96 צלחת הבאר ב 37 ° צ' באווירה של 95% האוויר 5% CO2 עבור 4 h. לאחר דגירה, לכידת תמונות של הזריחה של calcein AM-התווית תאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית בהגדלה 10x. לכידת לפחות 10 שדות שונים של כל שכפול עבור כל תנאי טיפול.</li>
	<li>באופן אקראי לבחור 10 תמונות עבור כל שכפול וספירת calcein AM-חיוביים המסומנים בתאי היעד מודבטים עם או בלי תאים NK92MI. חישוב% ציטורעילות באמצעות הנוסחה שלהלן. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq2.jpg"> הערה: כפקדים, השתמש בתאי יעד ללא NK92MI תאים ולגמרי תאי יעד מסוימים כבקרת מימוש מלאה. עבור הפירוק המלא, מארג התאים ב 0.5% טריטון X-100 עבור 1 h (20 μL של 5% טריטון X-100 ב 200 μL של מדיית תרבות).</li>
</ol>4. שיטת העברת תאים של NK
<ol><li>לגדל תאים NK92MI ותאי צנטריפוגה ב 160 x g עבור 3 דקות בשפופרת צנטריפוגה סטרילית 15 מ"ל.</li>
	<li>לשטוף את הגלולה הסלולרית פעמיים עם 5 מ ל של 1x PBS ו להשעות את התאים 3 מ ל של סרום ללא NK92MI cell בינונית. ספירה NK92MI תאים באמצעות הומוציטוטומטר או מונה תאים אוטומטי.</li>
	<li>צלחת NK92MI תאים (2.5x 10 תאים /100 μl/ובכן) בחלק העליון של תא החלל החדיר (6.5 מ"מ בקוטר להוסיף 5 יקרומטר גודל הנקבוביות).</li>
	<li>בחדר התחתון להוסיף 0.6 mL של סרום ללא מדיום המכיל חומר להיבדק עבור כימומי תא NK נכסים (g., בינוני ממוזג, נוגדנים, ציטוקינים). הערה: בעת הכנת המדיום הממוזג, השתמש באמצעי סרום מופחת ללא סרום מוסף כדי למנוע הפרעות מחלבונים בסרום בתוך שיטת ההעברה.</li>
	<li>המלון מפעיל את 24 החדרים הניתנים לחדירות ב-37 ° c עבור 4 שעות. לאחר 4 שעות, לאסוף את התאים הלא מחסיד ולהעביר NK92MI מהתא התחתון ולהעביר אותם מיון תאים המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) צינורות לניתוח נוסף. הערה: זמן התרבות עשוי להשתנות בהתאם לסוג תאי היעד, כמו גם לכמות ולקינטיקה של נוגדנים המיוצרים על-ידי תאי היעד. לכן, הפעם יש לקבוע מדעית עבור כל סוג תא, כימוקין, וניסוי.</li>
	<li>הוסף מספר קבוע מראש של חרוזי ספירה עבור cy, לזרום בנפח של 50 μL לכל צינור המכיל תאים NK הועברו. להעריך את עוצמת הקול של 300 μL/ובכן תא השעיה באמצעות cytometer כל זרימה מסוגל אוטומטי מבוסס FACS תא ספירת תאים. הערה: מערבבים או מערבולת-מערבבים את חרוזי הספירה לצילנסים הזורמים ביסודיות בכל פעם לפני השימוש כדי להבטיח שמספר קבוע של חרוזים משמש כדי למזער את השונות הניסיונית. ליטוף הפוך מומלץ עם חרוזי ספירה כדי לשמור על דיוק. השתמש רק בתאי NK ולספור חרוזים על הזרימה cy, לנסות כמו שולטת ניתוח FACS. המחברים ממליצים לקרוא לפחות 10,000 חרוזים + תאי NK בשילוב, סכום שעבד היטב. עם זאת, מספר זה עשוי להשתנות בהתאם לתנאים הניסיוניים. לכן, המספר המשולב של חרוזים + תאי NK צריך להיות מתוך התנסות מדעית עבור כל סוג של ניסוי. בנוסף, חשוב לבצע ניסויים באמצעות טרילקטים ביולוגיים כדי להשיג תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית ולחשבון לשונות בין ספירות תאים שונות.</li>
	<li>חשב מספר מוחלט של תאים NK92MI שהועברו באמצעות נוסחה זו: <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq3.jpg"> כאשר = מספר התאים, B = מספר חרוזים, C = לספור חרוז מוקצה של הרבה (מספר חרוזים ספירת עבור הזרמת cy, 50 μL; בדוגמה זו 49,500), ו-D = נפח של מדגם (μL). הערה: אם 300 μL של אמצעי אחסון לדוגמה (תאים שהועברו) משמש לניתוח של FACS עם 50 μL של חרוזים לספירה עבור cy, המספר המוחלט של תאים שהועברו = 1,700 תאים/3,300 האירועים x 49,500 חרוזים/300 μL = 84.975 תאים/μL. יש לתקן את החישוב אם המדגם מדולל או אם משתמשים בכמות שונה של חרוזי ספירת FACS.</li>
</ol>

<ol><li>Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+and+other+innate+lymphoid+cells+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).</li>
<li>Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy of cancer.</a> European Journal of Pharmacology. 625 (1-3), 41-54 (2009).</li>
<li>Kalbasi, A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-intrinsic+resistance+to+immune+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tumour-intrinsic resistance to immune checkpoint blockade.</a> Nature Reviews Immunology. , (2019).</li>
<li>Zhang, Q., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+the+innate+immune+response+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of the innate immune response to infection.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (7), 417-432 (2019).</li>
<li>Janeway, C. A. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+evolved+to+discriminate+infectious+nonself+from+noninfectious+self%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self.</a> Immunol Today. 13 (1), 11-16 (1992).</li>
<li>Natoli, G., Ostuni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+memory+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adaptation and memory in immune responses.</a> Nature Immunology. 20 (7), 783-792 (2019).</li>
<li>Cooper, M. D., Alder, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+adaptive+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The evolution of adaptive immune systems.</a> Cell. 124 (4), 815-822 (2006).</li>
<li>Riera Romo, M., Perez-Martinez, D., Castillo Ferrer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+vertebrates%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in vertebrates: an overview.</a> Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).</li>
<li>Sonnenberg, G. F., Hepworth, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+innate+lymphoid+cells+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between innate lymphoid cells and adaptive immunity.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (10), 599-613 (2019).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li>
<li>Shi, F. D., Ljunggren, H. G., La Cava, A., Van Kaer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+features+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organ-specific features of natural killer cells.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (10), 658-671 (2011).</li>
<li>Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proapoptotic+functions+of+cytotoxic+lymphocyte+granule+constituents+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Proapoptotic functions of cytotoxic lymphocyte granule constituents in vitro and in vivo.</a> Current Opinion in Immunology. 12 (3), 323-329 (2000).</li>
<li>Krzewski, K., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+killer%27s+kiss%3A+the+many+functions+of+NK+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The killer's kiss: the many functions of NK cell immunological synapses.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 597-605 (2008).</li>
<li>Berke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+and+lysis+of+target+cells+by+cytotoxic+lymphocytes%3A+molecular+and+cellular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular and cellular aspects.</a> Annual Review of Immunology. 12, 735-773 (1994).</li>
<li>Abel, A. M., Yang, C., Thakar, M. S., Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cells%3A+Development%2C+Maturation%2C+and+Clinical+Utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1869(2018).</li>
<li>Zamai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+%28NK%29+cell-mediated+cytotoxicity%3A+differential+use+of+TRAIL+and+Fas+ligand+by+immature+and+mature+primary+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differential use of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (12), 2375-2380 (1998).</li>
<li>Marcus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+tumors+by+the+innate+immune+system+and+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells.</a> Advances in Immunology. 122, 91-128 (2014).</li>
<li>Vesely, M. D., Kershaw, M. H., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+innate+and+adaptive+immunity+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural innate and adaptive immunity to cancer.</a> Annual Review of Immunology. 29, 235-271 (2011).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> Journal of Immunological Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).</li>
<li>Bryceson, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+evaluation+of+degranulation+assays+in+the+rapid+diagnosis+of+familial+hemophagocytic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A prospective evaluation of degranulation assays in the rapid diagnosis of familial hemophagocytic syndromes.</a> Blood. 119 (12), 2754-2763 (2012).</li>
<li>Shabrish, S., Gupta, M., Madkaikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modified+NK+Cell+Degranulation+Assay+Applicable+for+Routine+Evaluation+of+NK+Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">A Modified NK Cell Degranulation Assay Applicable for Routine Evaluation of NK Cell Function.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 3769590(2016).</li>
<li>Pietra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+cells+inhibit+natural+killer+cell+function+by+modulating+the+expression+of+activating+receptors+and+cytolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Melanoma cells inhibit natural killer cell function by modulating the expression of activating receptors and cytolytic activity.</a> Cancer Research. 72 (6), 1407-1415 (2012).</li>
<li>Fehniger, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+mechanisms+of+human+natural+killer+cell+expansion+in+vivo+during+low-dose+IL-2+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (1), 117-124 (2000).</li>
<li>Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+of+the+lytic+action+of+immune+lymphoid+cells+on+51-Cr-labelled+allogeneic+target+cells+in+vitro%3B+inhibition+by+isoantibody+and+by+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs.</a> Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284 (5756), 553-555 (1980).</li>
<li>Byrd, A., Hoffmann, S. C., Jarahian, M., Momburg, F., Watzl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+ligands+for+the+Natural+Killer+cell+receptors+NKp30+and+NKp44%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the ligands for the Natural Killer cell receptors NKp30 and NKp44.</a> PLoS One. 2 (12), e1339(2007).</li>
<li>Nitahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+ligation+without+T+cell+receptor+engagement+triggers+both+cytotoxicity+and+cytokine+production+in+dendritic+epidermal+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">NKG2D ligation without T cell receptor engagement triggers both cytotoxicity and cytokine production in dendritic epidermal T cells.</a> Journal of Investigative Dermatology. 126 (5), 1052-1058 (2006).</li>
<li>Gowen, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forward+genetic+screen+reveals+novel+independent+regulators+of+ULBP1%2C+an+activating+ligand+for+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A forward genetic screen reveals novel independent regulators of ULBP1, an activating ligand for natural killer cells.</a> Elife. 4, e08474(2015).</li>
<li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+cell+line%2C+NKL%2C+derived+from+an+aggressive+human+natural+killer+cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia.</a> Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLoS One. 10 (10), e0141074(2015).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הרעילות ציטורעלים ושיטות הגירה המתוארים כאן ניתן להשתמש כדי להעריך את הרעילות של התא NK לתאים סרטניים ו NK תא בתיווך מנגנוני התחמקות החיסונית בגידולים ממאירים, כמו גם כדי לזהות סוכנים טיפוליים שישפרו פעילות תא NK/פונקציה. הפרוטוקולים הם פשוטים, רגישים, שאינם מבוססים, וחלופות העדיפות הקלאסית המבוססת על רדיואקטיביות-מבוססי 51כרום שחרור שחרורו. הפרוטוקולים תוכננו במיוחד כדי להיות הסתגלות בקלות לשימוש ברוב המעבדות, עם מטרי צביעה ישירה, מיקרוסקופיים, או FACS מבוססי הקריאות, כי הם קלים לפענוח, המאפשר לחוקרים להגיע למסקנות אמין. הכל מדרגי עבור גישות המבוססות על הקרנה בתפוקה גבוהה. למרות הפרוטוקולים מוצגים בהקשר של קו אחד של הגידול בכבד, הם יכולים להיות מותאם בקלות לסוגים אחרים של תאים סרטניים ו/או תאים אחרים שאינם סרטניים היעד.
בעוד שכל השיטות המוצגות הן חזקות ומתחלות, וריאציה בין-ניסויית עלולה להתרחש עם אצוות שונות של תאים סרטניים ותאי NK. כדי להבטיח שהתוצאות יתמכו במדויק במסקנות הניסויים, מומלץ לחזור על הניסוי לפחות פעמיים באמצעות טרילקטים ביולוגיים.
מגבלה של שיטה זו היא שקצב הצמיחה של תאים NK92MI יכול להיות איטי. לכן, עבור ניסויים עם 50 או יותר דגימות, מספר מספיק של NK92MI יש לגדול מראש כדי למנוע עיכובים. כמו כן, יש ליישם את כל הפקדים המתוארים בפרוטוקולים כדי להימנע מתוצאות מזויפות ומאי. מגבלה נוספת של שיטת הרעילות NK ציטוזה היא כי NK יחס תאים סרטניים, כמו גם את זמן הדגירה, חייב להיות ממוטב עבור כל תא מטרה. לדוגמה, יש לנו בדקנו את היחסים השונים של תאים סרטניים לתאים NK (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, ו-1:80) עבור שורות התאים של סרטן הכבד, כמו גם פעמים מרובות דגירה (2, 3, 4, 5, ו 6 h). בהתבסס על התוצאות שלנו הבחנו תוצאות עקבית ביותר עם 1:10 ו 1:20 יחס של תאים סרטניים לתאי NK ו דגירה עבור 3 h.
בנוסף, תאים סרטניים נגזר גידולים מוצקים יהיה לצרף ולגדול על פני השטח של לוחית התרבות, בעוד תאים NK לגדול בהשעיה. אם זמן הדגירה הוא יותר מ 3 שעות, מומלץ להשתמש וזמן קובץ מצורף 96 לוחות היטב, אשר ישפר את העקביות ואת התוכסות בין ניסויים ומשכפל ביולוגי. חשוב גם לציין כי NK המושרה cell הנגרמת הרעלת ציטוזה יכול להתבצע גם באמצעות תאי NK העיקרי מבודדים דם היקפי מונפינקה תאים (PBMCs). עם זאת, ישנן מספר מגבלות עם ניסויים כאלה. ראשית, ניסויים אלה לא יכולים להיות בקלות קנה מידה כמו עם NK92MI תאים. שנית, אצווה-to-אצווה וריאציה של פעילות ציטוטוקסיים של תאים NK מבודדים PMBCs יכול להיות בעייתי במונחים של השגות ופרשנות של התוצאות. באופן דומה, קווים אחרים התא NK אחרים מתוארים בספרות וניתן להשתמש בסוגים אלה של ניסויים, כולל NKL תאים29; עם זאת, בניגוד לתאי NK-92MI, תאים NKL הם תלויים ב-IL-2 ולא זמין מסחרית.
כאשר בוחנים את הניסויים של calcein AM מתוארים, חשוב לציין כי calcein AM נשאר בגופים אפוטוטיים לאחר מוות התאים30. לכן, כימות הצביעת של calcein AM צריך להתבצע בקפידה, כפי שהוא עלול להוביל להערכת החסר של הרעילות NK.
בדומה מתווכת תא בתיווך, אפנון של הגירה תא NK על ידי ציטוקינים וכימורים אחרים ממלא תפקיד חשוב בוויסות של פונקציית תא NK. שיטת ההעברה של התא NK המתוארת כאן מספקת פלטפורמה פשוטה להערכת הגירה של תא NK בהקשר של גירוי כימוקין או כימוסטנט. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי להעריך סוכנים שיכולים לקדם או להפריע להעברת תאי NK-ובכך לזהות משפרי וrepressors של העברת תאים של NK. שיטה זו יכולה גם להיות שימושית כדי ללמוד את היכולת הרגולציה של הגירה של תא NK כתוצאה של שינויים גנטיים/אפיגנטיים (upregulation או downregulation) או הנובעים עקב טיפול בסמים.
כדי למדוד במדויק את העברת התאים של NK, קיימים מספר שלבים קריטיים שיש לעקוב אחריהם. עבור כל הניסויים באמצעות המדיום הממוזג, חשוב שניתן יהיה להשתמש במדיום הממוזג המקביל מתנאי השליטה והטיפול להשגת מדידות מדויקות. הזמן של הדגירה יהיה מגוון עם כימומי מטוהר ומדיום ממוזג. בסופו של דבר, הגירה transwell מבוססת היטב נחשב שיטה מצוינת להערכת הגירה תא NK; עם זאת, מונותרבויות הומוגנית המועסקים בחני חוסר הפיזיולוגיה המורכבת של רקמות או אפילו 3d תרבויות שאולי יותר במדויק לחקות את מיקרוסביבה הגידול.
לפיכך, למרות שיש כמה מגבלות על מספר מוגבל של התא NK הרעילות לספר ושיטת ההגירה של NK הציג במאמר זה, אלה מספר חלים על מגוון רחב של מחקרים אימונולוגיים ובכך לספק שיטות חשובות ואמינות כדי להעריך את התא NK הפונקציה ואת התא NK מאופקקים therapeutics החיסונית.

היכולת של גוף האדם לזהות לא-עצמית ולמגר חפצים זרים היא המפתח להישרדות האדם מפני פתוגנים וממאירות1. התגובה החיסונית האנושית ממלאת את התפקיד החשוב ביותר בתהליך זה2,3,4. מבוסס על מאפיינים ופונקציות מפתח, מערכת החיסון האנושית ניתן לסווג באופן נרחב לשתי קבוצות פונקציונלי העיקריים: המערכת החיסונית אדפטיבית המערכת החיסונית מולדת. מערכת החיסון האדפטיבית היא בדרך כלל ספציפית לפתוגן נתון ויש לו זיכרון חיסוני, ולכן, הוא לאורך זמן ומגיב לזיהום מחדש בעתיד על ידי הפתוגן אותו5,6,7,8,9. לעומת זאת, החסינות המולדת היא רחבה הרבה יותר בחיסול היעד שלו ובאופן יחסי לא ספציפי. לכן, בדרך כלל, התגובה החיסונית מולדת משמש כשורה הראשונה של ההגנה החיסונית10. הרוצח הטבעי (NK) תאים שייכים למערכת החיסונית מולדת ומייצגים 10 על 15% של לימפוציטים הכולל במחזור11. תאים NK לבער את תאי היעד באמצעות שני מנגנונים עיקריים. ראשון, על הכריכה לתאי היעד ביטוי הפעלת ליגנדס, התאים NK לשחרר את הממברנה משבש החלבון בהפרעה וסרין פרוטאז granzymes באמצעות exסוציטוזה, אשר במשותף לגרום אפופטוזיס בתאי היעד12,13,14,15. בנוסף, התאים NK להביע FasL ו נמק בגידולים גורם הקשורים אפופטוזיס-גרימת (שביל) אינטראקציה עם תאים היעד להביע קולטני מוות (CD95), המוביל caspase תלוי ואפופטוזיס16. החשוב ביותר, התאים NK לא דורשים prestimulation, כגון מצגת אנטיגן, כדי לבער הפתוגן-נגוע או תאים ממאירים; לכן, הם בדרך כלל במצב מוכן להרוג17,18. כדי לעכב את התפתחות הגידול התקדמות ולבער את התאים הסרטניים, התאים NK חייבים לעבור לאתר הגידול, פעם אחת בסביבת מיקרו הגידול, לזהות ולתקוף את תאי היעד.
בעבר, הפונקציות של NK-cell מנוטרים בעיקר על ידי הדיגרטולציות והרעלת ציטוזה19,20,21. בנוסף, ניתן למדוד את תא הרעילות של התא NK על-ידי 51שחרור כרום בשנת22,23,24,25. עם זאת, לטיפול זה יש כמה דרישות ספציפיות, כולל הצורך בקונטרה גמא, והיא מבוססת על רדיואקטיביות, הדורשת הכשרה בטיפול ובסילוק חומרים רדיואקטיביים ומהווה רמת סיכון למשתמש. לכן, מספר חדש שאינם רדיואקטיביות מבוסס בחני שפותחו והמועסקים ללמוד פעילות תא NK.
כאן, אנו מתארים שני פרוטוקולים כאלה, צביעת מטרי לקטית דהידרוגנאז (ldh) מבוססת מדידה מבוסס תא מתווכת מתווך והוא calcein acetoxymethyl מבוססי כתמים המבוסס על שיטה מיקרוסקופית למדוד את התאים NK מתווך תאים סרטניים. מספר זה אינו דורש שימוש ברדיואיזוטופים, הם ברורים, רגישים ומזהים גורמים המשתנים בתפקוד התא של NK. בנוסף, מכיוון שפונקציית תא NK אינה יכולה להיות מוערכת במלואה מבלי לנטר שינויים בהעברת תאי NK, אנו מציגים גם את השיטה הכמותית המבוססת על cy, כדי לנטר את העברת התאים של NK.

<table><tbody><tr><td>חרוזי ספירה מוחלטת</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4256</td><td></td></tr><tr><td>Amicon מסננים אולטרה צנטריפוגליים</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM צבע</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>26140079 חומצה פולית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>Gibco</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין (200 מ"מ)</td>ערכת בדיקה ציטוטוקסית <td>של Gibco</td><td>2530081</td><td></td></tr><tr><td>LDH Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>88953</td><td></td></tr><tr><td>תאי אינוזיטול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>NK92MI</td><td>ATCC</td><td>CRL-2408</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלח (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>SKHEP-1 תאים</td><td>ATCC</td><td>HTB-52</td><td></td></tr><tr><td>תאים חדירים Transwell</td><td>Costar</td><td>3241</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA תמיסת</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידה של הרוצח הטבעי cell-בתיווך ציטורעילות והגירה בהקשר של תאים סרטניים בכבד

Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

הרוצח הטבעי (NK) תאים הם תת-קבוצה של אוכלוסיית לימפוציטים ציטוטוקסיים של המערכת החיסונית מולדת ולהשתתף כשורה הראשונה של ההגנה על ידי ניקוי הפתוגן-נגוע, ממאיר, והדגיש תאים. היכולת של תאים NK לבער תאים סרטניים הופך אותם כלי חשוב במאבק נגד סרטן. מספר טיפולים חדשים המבוססים על החיסון נמצאים תחת חקירה לטיפול בסרטן אשר להסתמך על שיפור פעילות התא NK או להגדיל את הרגישות של תאים סרטניים כדי NK תא בתיווך מיגור. עם זאת, כדי לפתח ביעילות את הגישות הטיפוליות הללו, חסכוני בתחום מחוץ לתחום, שאומר לנטר את הרעילות וההגירה של התאים הדרושים. כאן, אנו מציגים שניים בפרוטוקולים מחוץ למבחנה שיכולים באופן אמין ולהציג באופן מהימן את ההשפעה של הרעלת תאים של NK-cell על תאים סרטניים (או תאי יעד אחרים). פרוטוקולים אלה הם לא מבוססי-רדיואקטיביות, פשוט להגדיר, וניתן לשנות את הגודל להקרנה בתפוקה גבוהה. כמו כן אנו מציגים פרוטוקול cy, מבוסס-הזרם המבוסס על מוניטור הגירה של התא NK, אשר ניתן גם לשנות את ההקרנה עבור הקרנת תפוקה גבוהה. באופן קולקטיבי, שלושת הפרוטוקולים האלה יכולים לשמש כדי לנטר היבטים מרכזיים של פעילות תא NK הנחוצים ליכולת התאים למגר את תאי היעד הלקוי.

תא NK הרעילות של התא והוא אומר והעברת הגירה התא NK בוצעו באמצעות קו הגידול SK-1 הכבד של הסרטן כמערכת מודל. כדי למדוד את הרעילות של התא NK באמצעות שיטת LDH, SK-הפטיטיס-1 תאים המבטא או מפרט לא ספציפי (NS) או שרין מיקוד הפעלת שעתוק גורם 4 (ATF4) היו מודבטים עם תאים NK92MI בצלחת 96 היטב עבור 3 h (איור 1א). ATF4 הוצגה בעבר כדי להסדיר את הרעילות של התא NK על ידי upregulating הפעלת ליגנד ULBP128. פעילות LDH המשויכת להריגה של תא מתווכת של תא היעד נמדדה באופן מטריקלי, ואחוז הרעילות באחוזים מחושב באמצעות הנוסחה המתוארת בפרוטוקול 1. ATF4 מופחתת באופן משמעותי מופחת תא nk בתיווך לעומת התאים nk ביטוי מרין NS (איור 1ב-D). אנו גם מדדו את הרעילות של תא NK באמצעות שימוש בשיטת calcein AM המבוססת על כתמים. לשם כך, SK-הפטיטיס-1 תאים המבטא NS מרין או ATF4nas מיקוד היו מתויג עם calcein AM ו דגירה עם NK92MI תאים ב 96 לוחות היטב עבור 4 h כפי שמודגם באיור 2א. לאחר דגירה, תמונות של calcein AM-חיוביים תאים נתפסו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית באמצעות מסנן FITC/GFP. תאים שנהרגו על ידי תאים NK אינם מזוהים על ידי גישה זו, כי הם כבר לא לשמור על הצבע של calcein AM. כפי שמוצג באיור 2B, C, מספר calcein AM-חיובי SK-הפטיטיס-1 תאים הצטמצמה לאחר שיתוף התרבות עם NK92MI תאים לעומת SK-הפטיטיס-1 תאים גדל ללא תאים NK92MI. עם זאת, כצפוי, ATF4 למטה דרך שרין מופחתת מופחת תא מתווך NK הריגת SK-הפטיטיס-1 תאים, נצפתה על ידי מספר רב יותר של CALCEIN AM-חיוביים תאים (איור 2B, C). לכן, הן ldh מבוסס ו calcein AM בחני הראו תוצאות עקביות ואישר כי ATF4 מפחית את NK-תיווך הסרטן תא הרעילות. כל אחד מאלה מספק מספיק כדי להעריך את הרעילות של התא NK בתיווך; עם זאת, אנו ממליצים להשתמש בשתי השיטות כדי להגביר את החשאיות והביטחון בתוצאות.
אנו מציגים גם את התוצאות של 24 גם הגירה תא NK. תאים NK92MI הושעו מחדש סרום-NK92MI בינוני בחדר העליון, וכימוקין, מוטיב CC, ליגנד 2 (CCL2) נוספה לתא החדיר התחתון. העברת התא NK הייתה כמתואר בסעיף 3 (איור 3א). מספר התאים המועברים NK92MI היה כולל על ידי הוספת חרוזי ספירה עבור cy, לזרום ולאחר מכן ניתוח FACS. כפי שמוצג באיור 3ב-C, חלה עלייה משמעותית במספר התאים הNK92MI שהועברו לכיוון הבינוני CCL2 המכיל בהשוואה לאמצעי הבקרה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig1.jpg"> איור 1: שיטת הרעילות המבוססת על הפעילות של LDH בתיווך תאים. (א) סכמטי המתאר את השלבים המרכזיים של הפעילות המבוססת על מסמך ldh של תאי הרעילות מבוססת-תא NK. (ב, ג) ATF4 ביטוי נותחו ב-SK-הפטיטיס-1 תאים המבטאים את המרין (NS), או מטרה מיקוד ATF4 על-ידי RT-PCR כמותי ומערבי. (ב) ברמת ATF4 mrna היחסי מוצגת לאחר נורמליזציה לרמת אקב ק-הפטיטיס-1 תאים המבטא NS מרין או ATF4 מרין. (C) ATF4 ו-אקב ' רמות חלבון ב SK-הפטיטיס 1 תאים המבטא NS מרין או ATF4 מרין. (ד) NK תא-מתווך הרעילות נותחו ב SK-הפטיטיס-1 תאים ביטוי או NS מרין או ATF4 מרין על ידי שיטת ldh. אחוז (%) בתיווך התאים של NK. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM; ns, לא משמעותי; * * p &lt; 0.01, * * * p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig2.jpg"> איור 2: Calcein AM כתמים מבוססי שיטה מיקרוסקופית למדידת הרעילות של התא NK בתיווך. (A) סכמטי המתאר את השלבים המרכזיים של calcein AM כתמים מבוססי שיטה מיקרוסקופית למדידת הרעילות NK תא בתיווך. (ב) בתאי-הפטיטיס (ב) הביעו הרעלת תאים מתווך ב-SK-כדוריות הבטא או ה-NS מרין או ATF4 רין באמצעות השיטה calcein AM. תמונות מייצגות מוצגות. סרגל קנה מידה = 200 μm. (ג) אחוזים מתאי calcein AM-חיוביים עבור הניסוי המוצג בלוח B. * * * &lt; 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig3.jpg"> איור 3: הגירה מבוססת FACS מבוסס תא כמותי שיטת ההגירה. (A) סכמטי המתאר את השלבים המרכזיים של העברת תאים מבוססי facs מבוסס תא. (ב, ג) שיטת ההעברה של התא NK בוצעה לאחר הוספת 50 ng של CCL2 לחדר התחתון של הצלחת 24. (ב) נציג מגרשים של תאי NK לצורך בקרה או בינוני תרבותי שטופלו בCCL2 מוצגים. (ג) מוצג לצורך הניסוי המוצג בלוח B. * * * p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

התחמקות של הרוצח הטבעי (NK) תא מתווכת מיגור על ידי תאים סרטניים חשוב לחניכה והתקדמות סרטן. כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים שאינם מבוססי רדיואקטיביות כדי להעריך את הרעילות של התאים NK בתיווך לקראת תאי גידול בכבד. בנוסף, פרוטוקול שלישי מוצג לניתוח העברת תאים של NK.

מדידה של הרוצח הטבעי Cell-בתיווך ציטורעילות והגירה בהקשר של תאים סרטניים בכבד

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

אנחנו הולכים להדגים שני פרוטוקולים היום המדגימים כיצד ללמוד תפקוד תאי NK. ישנם שני היבטים מרכזיים של תפקוד תאי NK כי הוא מסוגל למגר תאים סרטניים והוא מסוגל לנדוד לסביבת מיקרו הגידול. שני הפרוטוקולים האלה נדגים את היכולת של תאי NK להשמיד תאים סרטניים וגם הוא מסוגל לנדוד לסביבת מיקרו הגידול.אז שני הפרוטוקולים שאנחנו הולכים להדגים היום הם פשוטים, אינו דורש שימוש בפעילות רדיו ו ניתן ליצור ברוב המעבדות כי יש את היכולת לעשות ביולוגיה מולקולרית ותרבות התא לעבוד. אורש בוגיד ונורש חוה, שהם שני פוסט דוקטורנטים במעבדה שלי, ידגימו את שני הפרוטוקולים האלה היום. שני להעריך NK תא בתיווך cytotoxicity באמצעות LDH, הראשון לגדל קו תאים סרטן הכבד האנושי ל 70-80% confluency בצלחת 100 מילימטר תאים פטרי ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.ביום הניסוי, לשטוף את התרבות עם חמישה מיליליטר של PBS לפני הטיפול בתאים עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA עד התאים התנתקו מהתחתית צלחת. כאשר ההשעיה תא יחיד הושג להוסיף 10 מיליליטר של תאים בינוני לתאים ולהעביר את התאים צינור חרוט 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. לשטוף את גלולת התא עם חמישה מיליליטר של PBS לפני השעיית התאים מחדש באחת פעמים 10 לתאים 5 למיליליטר של ריכוז בינוני תרבות טרי.לאחר מכן, זרע 100 microliters של תאי סרטן הכבד האנושי היעד ל הבא בטריליקט לכל מצב טיפול בצלחת 96 גם ולהוסיף פעם אחת 10 לתאי NK האנושיים 5 ב 100 microliters של בינוני לכל תא היעד היטב. ואז למקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך שלוש שעות. בסוף הדגירה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ולהעביר 100 microliters של supernatant מכל באר לתוך בארות בודדות של צלחת חדשה 96 באר.הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מצע LDH לכל באר עם ערבוב יסודי ודגירה של הצלחת במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם 50 microliters של פתרון להפסיק ומיד למדוד את הספיגה על קורא צלחת ב 490 ו 680 ננומטר. לאחר מכן השתמש בנוסחה כדי לחשב את ציטוקסיות תא NK אחוז.כדי להעריך ציטוטוקסיות מתווכים תא NK באמצעות קלצין AM לאחר גידול תאי קו התא סרטן הכבד האנושי ל 70-80% confluency כפי שהוכח מחדש להשעות את התאים בשלושה מיליליטר של DMEM ללא סרום ולתייג את התאים עם 1.5 microliters של 10 פתרון calcein AM מילימולרית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף. להשעות מחדש את התאים באחת פעמים 10 לתאים 5 למיליליטר של ריכוז בינוני תרבות ולהוסיף 100 microliters של תאים לכל באר של צלחת 96 גם ב טרילקט לכל מצב טיפול.לאחר מכן, באחת הפעמים 10 עד 5 תאי NK אנושיים ב 100 microliters של תרבות בינוני לכל באר של תאי היעד ולמקום את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך ארבע שעות. לאחר סיום הדגירה, ללכוד לפחות 10 שדות שונים של תמונות של התאים החיוביים calcein AM עבור כל שכפול של כל מצב טיפול על מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה 10 פעמים. לאחר מכן חשב את אחוז הציטוקסיקות באמצעות הנוסחה.כדי למדוד את נדידת תאי NK בתגובה לגירויים chemotactic לאסוף תאי NK אנושיים מתרבות 70-80%confluent ולהשעות מחדש את התאים ב 2.5 פעמים 10 לתאים 6 למיליליטר של ריכוז בינוני תרבות תאי NK ללא סרום. לאחר מכן, להוסיף 600 microliters של מדיום ללא סרום המכיל את כימותרפיה תא NK מושך עניין ל הבאר ולמקם אחד 6.5 מילימטר קוטר תרבות להוסיף עם חמש נקבוביות מיקרומטר לתוך כל באר של בינוני. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תאי NK לתא העליון של כל הכנס והכניסו את הלוחית בחמה לתרבות התאים למשך ארבע שעות.בסוף הדגירה להעביר את כל הנפח של תאים נודדים שאינם חסידים מתחתית כל באר לתוך צינורות FACS בודדים חמישה מיליליטר ולהוסיף 50 microliters של מספר קבוע מראש של ציטומטריית זרימה ספירת חרוזים לכל צינור. לאחר מכן, באמצעות ציטומטר זרימה להעריך כל דגימת תא על פי פרוטוקולי ניתוח ציטומטרי זרימה סטנדרטיים ולחשב את המספר המוחלט של תאי NK שהועברו באמצעות הנוסחה. ההפלה ATF4 מפחיתה באופן משמעותי את הציטוקסיקטיות של תאי NK בהשוואה לתאי NK המבטאים רנ"א סיכת ראש קצר לא ספציפי.לאחר הכתם עם calcein AM מספר תאים סרטניים בכבד אנושי קיימא פוחתת לאחר שיתוף תרבות עם תאים NK אנושי לעומת תאים סרטניים בכבד אנושי מתורבת ללא תאי NK. כצפוי, ATF4 נוקאאוט באמצעות RNA סיכת ראש קצרה מפחית הרג תאי NK של תאים סרטניים בכבד אנושי כפי שמוצג על ידי מספר גדול יותר של תאים קלצין AM חיובי בתרבויות אלה. בנוסף, כמות גבוהה משמעותית של הגירת תאי NK נצפתה בתגובה למדיום המכיל כימוקין בהשוואה לתאי NK החשופים לשליטה בינונית ללא כימוקין.להערכת ציטוטוקסיות של תאי NK חשוב לתקנן את יחסי המאמץ והיעד שלנו ואת זמן הדגירה עבור כל קו תאים סרטניים. לאחר התקנים מזוהים מאומתים להערכת במבחנה מתווספים עם ניסויים בעכברים vivo כדי להעריך עוד יותר את תפקידם בהכחדת תאים סרטניים.

measurement-natural-killer-cell-mediated-cytotoxicity-migration

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים בידוד של לימפוציטים, כולל תאי הרג טבעיים או תאי NK, מרקמת כבד אנושית לצורך התרחבות סלקטיבית. עיכול אנזימטי ומכני, ואחריו הפרדת שיפוע צפיפות, מקדם בידוד לימפוציטים, כולל תאי NK. הלימפוציטים שנאספו יכולים לשמש עוד יותר להרחבה סלקטיבית של תאי NK.

בידוד תאי הרג טבעי מרקמת הכבד להרחבה סלקטיבית

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת ציטוטוקסיות של תאי הרג טבעיים כנגד תאים סרטניים באמצעות כתם Calcein AM. המספר המופחת של תאי סרטן פלואורסצנטיים בעקבות תרבית משותפת עם תאי הרג טבעיים מצביע על ציטוטוקסיות של תאי הרג טבעיים כלפי תאים סרטניים.

צביעת אצטוקסימתיל Calcein להערכת ציטוטוקסיות של תאי הרג טבעיים כלפי תאים סרטניים

סרטון זה מדגים שיטה לחקר נדידת תאי הרג טבעי (NK) דרך מערכת החדרת קרום נקבובי בתגובה לכימואטרקטנטים. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של נדידת תאי NK באמצעות ציטומטריית זרימה.

מדידת נדידת תאי הרג טבעיים בתגובה לגירויים כימוטקטיים

סרטון זה מדגים ביצוע בדיקת שחרור לקטט דהידרוגנאז כדי לקבוע את ציטוטוקסיות תאי הרג טבעי (NK) כנגד תאי סרטן המטרה. הבדיקה מכמתת את שחרורו של האנזים ציטופלזמי לקטט דהידרוגנאז מתאי סרטן על ידי מדידת הספיגה של המוצר בצבע אדום שנוצר.

בדיקת מבחנה להערכת ציטוטוקסיות של תאי הרג טבעיים כנגד תאים סרטניים

סרטון זה מדגים חקירה ניסויית של גלגול לימפוציטים על פני מודל אנדותל מחסום דם-מוח (BBB). חד-שכבה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי (HBMECs) נוצרת במבחנה, ותאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) המכילים לימפוציטים מתווספים לשכבה החד-שכבתית. לאחר מכן התאים מודגרים כדי לאפשר גלגול לימפוציטים, והתאים הנודדים מכומתים באמצעות ציטומטריית זרימה.

חקר גלגול לימפוציטים על פני חד-שכבת תא אנדותל מיקרו-וסקולרי

אנו מתארים פרוטוקול לניטור ניידות רדיאלית של תאים חיסוניים שאינם נצמדים במבחנה באמצעות מנגנון סעפת/החלקה של שקיעת תאים. נדידת תאים עוקבת אחר חד-שכבות של תאי גידול או על חלבוני מטריצה חוץ-תאיים. בדיקה במיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בניידות התא ובתפקוד הציטוטוקסי.

מחוגי ניידות ותפקוד ציטוטוקסיות של retroviral מעתיקה וקטור transduced, שאינם חסיד Alloresponsive T לימפוציטים

לויקוציטים שוליים-כבדיים מציגים מאפיינים ייחודיים ותפקודים אימונולוגיים מובהקים בהשוואה לאוכלוסיות לויקוציטים אחרות. כאן אנו מתארים שיטה לקטיף סלקטיבי של אוכלוסיית תאי הכבד הספציפית הזו, באמצעות זלוף מאולץ של הכבד של חולדות או עכברים. לויקוציטים שוליים בכבד נראים קריטיים בקביעת הרגישות למחלות וגרורות הקשורות לכבד.

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-כבדית

שיטה פשוטה ואמינה מתוארת כאן כדי לנתח קבוצה של פונקציות תא NK כגון degranulation, ציטוקינים וייצור chemokine בתוך תת תא NK שונה.

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

שיטה מבוססת cytometry זרימה כדי לקבוע באופן כמותי את הפעילות ציטוטוקסיות של תאים אנושיים של הרוצח הטבעי מוצגים כאן.

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

במאמר זה, אנו מתארים שיטה למדוד גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלי בתאים קטלניים אנושיים עיקריים (NK) מבודדים מדם היקפי, במנוחה או בעקבות הפעלה המושרה IL15. הפרוטוקול המתואר יכול להיות מורחב בקלות לתאי NK אנושיים ראשוניים המופעלים על ידי ציטוקינות אחרים או גירויים מסיסים.

ניתוח של חילוף החומרים של תאי הרוצח הטבעי האנושי

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מאוזן במבחנה למדידה עקבית של ציטוטוקסיות טבעית, מתווכת קולטני אנטיגן כימריים ותלויה בנוגדנים של תאי רוצח טבעיים אנושיים, באמצעות הדמיית תאים חיים וציטומטריית זרימה.

כימות ציטוטוקסיות של תאי NK המועצמת על ידי קולטני אנטיגן כימריים ונוגדנים טיפוליים באמצעות הדמיית תאים חיים וציטומטריית זרימה

למד פרוטוקולים ללא רדיואקטיביות למדידת ציטוטוקסיות ונודדות של תאי NK בתאי סרטן כבד. השיטות כוללות מבחני LDH ו-Calcein AM לניתוח תפקודי מערכת החיסון.

מדידה של הרוצח הטבעי Cell-בתיווך ציטורעילות והגירה בהקשר של תאים סרטניים בכבד

גלה סרטונים נוספים