מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

טכניקת המעקב המתוארת בפרוטוקול זה מסייעת לנו לחקור מורפוגנזה עצבית ולצלם את הקישוריות במערכת הנוירונים המוטוריים של דרוסופילה. הצבע ליפופילי יכול להתפזר במהירות לכל חלק של קרום התא עם צפיפות גבוהה מאוד. זו הסיבה שהפרוטוקול שלנו פותר ביעילות למצוא מבנים של נוירון שכותרתו.

אם מסוף אקסון נגיש עם micropipette הזרקה, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על כל נוירון בשלבים הזחל ומבוגרים של זבובים או באורגניזמים אחרים. אם אין לך ניסיון לנתח או להשתמש microinjector מדויק הפעולה על הדגימה, יכול להיות מאתגר. הבנת האנטומיה של העובר, תסייע בהנחיית החלקה נכונה של כלים לביצוע ניתוח או דינג'ק.

כדי להתחיל, להכין ולתווה את כל חומרי איסוף העוברים. הכן את מנגנון הסינון על ידי ניתוק צינור 50 מיליליטר, וחיתוך לפתוח חור בכובע. לאחר מכן להגדיר מסנן רשת עם 100 נקבוביות מיקרומטר בין הצינור ואת הכובע.

הכינו את מיקרופיגט הזרקת הצבע ומחט הניתוח מאותו צינור נימי בקוטר פנימי של 1.2 מילימטרים. משוך את הצינור עם micropipette, מושך ב 7% מ 170 וולט התפוקה המרבית כדי ליצור מחט חדה עם תחדד של כ 0.4 ס"מ אורך. כדי להכין את micropipette הזרקת צבע, להשרות את המטחנה עם סוכן הרטבה מניחים את המחט על מהדק micropipette ב 25 עד 30 מעלות.

לאחר מכן הורידו את הקצה לשני שליש מהרדיוס ממרכז משטח המשפער. לטחון את המחט בעוד מזרק עם צינורות דוחף אוויר לתוכו. סמן את micropipette עם סמן קבוע קצה עדין כדי לציין את המיקום של הפתח בקצה לאחר משופע כי זה יכול להיות מאתגר לאתר את הפתח הצר שנוצר בזווית.

אפשר לזבובים להטיל ביצים לילה בטמפרטורת החדר ולאסוף את הצינור עם הביצים בבוקר. כדי לאסוף את העוברים, dechlorinate את הביצים על הצלחת עם 50% אקונומיקה במשך חמש דקות. לאחר הכלורות התבהרו, יוצקים את תכולת הצלחת דרך מנגנון הסינון או מסננת התא כדי לבודד את העוברים.

השתמש בקבוק לסחוט מים כדי לדלל את האקונומיקה שנותרה על הצלחת ולאסוף עוברים רבים ככל האפשר על ידי decanting את התערובת לתוך המסנן. לשטוף את העוברים שלוש עד ארבע פעמים עם מים עד ריח אקונומיקה מתפוגג. מוציאים את המסנן מהמוסד ושוטפים אותם לצלחת נקייה אחרת עם מים.

ואז לדק את המים מהצלחת החדשה כי העוברים הם על. השתמש מטלפים עדין כדי לבחור חמישה עד 10 עוברים ב 15 שעות לאחר הטלת ביצה ולהניח אותם על קלטת דו צדדית עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה. הוסף צלצול חרקים מלוחים לבריכת הניתוח כדי להגן על העוברים מפני ייעוד.

השתמש מחט זכוכית תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי לגרור את העובר מתוך קרום בינוני מן הסרט אל הזכוכית, דואג לא לפגוע ברקמות הפנימיות של העובר. ואז לחתוך דרך קו האמצע של עובר יחיד על פני השטח שלו מה האחורי שלה לקצה הקדמי. הופכים את רקמות האפיתל מהמרכז ומחברים את קצה האפידרמיס לפני השטח של מגלשת הזכוכית.

השתמש מחט מחובר צינור עם פתח קצה של כ 300 מיקרומטרים כדי לשאף או לפוצץ אוויר כדי להסיר את גזעי קנה הנשימה האורך הגבי, כמו גם את כל המעיים הנותרים. השתמשו ב-4%PFA וב-PBS כדי לתקן את העוברים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי. ואז לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS.

הכתם את העוברים עם מיקרוליטר אחד של נוגדן פרוקסידאז נגד חזרת גדום צבע Cyanine3 ו 200 microliters של PBS במשך שעה אחת על שייקר מסלולית. ולחזור על הכביסה ב-PBS. כדי למלא את מיקרופיגט ההזרקה, מניחים אותו לתוך מחזיק נימי.

לאחר מכן מקם את החלקת הצבע על הבמה ולהשתמש micromanipulator למקם אותו מעל השקופית. לאחר מכן להתאים את הבמה כדי למקם את micropipette על הצבע. לאסוף את הצבע micropipette על ידי הגדרת לחץ ההזרקה בין 200 ל 500 hectopascal, זמן ההזרקה בין 0.1 ו 0.5 שניות ואת לחץ הפיצוי לאפס במשך חמש דקות.

לאחר איסוף הצבע, הסר את מגלשת הצבע והצב את הדגימה על שלב המיקרוסקופ. לאחר מכן להגדיל את לחץ הפיצוי לטווח של 30 עד 60 hectopascal ולהוריד את micropipette לתוך המדגם. השתמש בעדשה אובייקטיבית 10 פעמים כדי לאתר את העובר וליישר את micropipette עם העובר.

שנה את העדשה האובייקטיבית לעדשה טבילת מים 40 פעמים. ולהטביע את העדשה לתוך PBS. השתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לבדוק את המורפולוגיה העצבית המסומנת על ידי אנטי HRP Cy3 ולקבוע את אתר ההזרקה.

כאשר העובר נמצא בפוקוס לשנות את המיקום של micropipette כדי ליצור קשר עדין עם קצה האקסון של עניין. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר במהלך ההזרקה כדי לראות את טיפת הצבע. זרוק את הצבע בהמיסגמנט הבטן הימנית בצומת neuromuscular של ACC או RP3 עם DID או DiO.

השתמש בבקרת היד כדי לשחרר את הצבע ולהסיר את micropipette. לאחר מכן עבור לאתר ההזרקה הבא. הדגירה את המדגם במשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית לפני הדמיה.

באמצעות מדפים עדין, להסיר את הקלטות ממגלשת הזכוכית. כדי לטעון את המדגם, להכין להחליק כיסוי עם כמות קטנה של שומן ואקום בארבע הפינות. הניח אותו בזהירות על המדגם, הקפדה להימנע בועות אוויר.

דחוף כלפי מטה את החלקת המכסה כדי להתאים את השטח מהדגימה כדי לאפשר מרחק עבודה בין העדשה האובייקטיבית לשקופית. הסר את כל PBS עודף עם מחיקת משימות. לאטום לחלוטין את הקצוות של החלקת המכסה עם לק.

תמונה ב 10 פעמים ו 100 פעמים הגדלה עם מיקרוסקופ confocal ולעבד את התמונות, עם תוכנת imageJ. פרוטוקול זה שימש כדי לדרדר את התווית הנוירון המוטורי ACC innervating שריר אחד ואת נוירון מוטורי RP3 innervating השרירים שש ושבע. ענפים דנדריטיים מהנוירונים המוטוריים ACC ו- RP3 מראים חפיפה נרחבת.

שני הנוירונים הם דו קוטביים, הקמת שתי אוכלוסיות שונות של דנדריטים. כדי להדגים את היכולות הכמותיות של שיטה זו, המספר הכולל של טיפים דנדריט נספר סוג פראי מוטציות Dscam1. דנדריטים ipsilateral של ACC מוצגים עבור סוג הבר, אבל כמה דנדריטים ipsilateral נצפו עבור מוטציה Dscam1.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור כי גודל טיפת הצבע הוא חיוני, שהוא כ 10 עד 20 מיקרומטר. בדוק את הגודל על קלטת דו צדדית ולאחר מכן להחיל אותו על אתר ההזרקה. באמצעות הליך זה, אנחנו יכולים לנצל את המאפיין הניתן להחלפה תמונה של בדיקה DiD כדי להשיג תמונות ברזולוציה סופר של קרום הפלזמה.

בדרך זו אנו יכולים ללמוד את האפיון המבני אולטרה של הממברנות הסינפטיות בצומת neuromuscular. עשינו את הקליק. ביצענו ניתוח פנוטיפי של ה-aCC dendrites בזן מוטנטים, ולגלות כי הזרקת Dscam1-Dock-Pak מגדיר את האתר של דנדריט גדילה ב ACC.