Name: ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: למדו פרוטוקול לביטוי וטיהור נוגדנים ולמעקב בזמן אמת אחרי התפלגותם בגידולים וברקמות. שיטה זו מאפשרת לבחור נוגדנים עם התפלגות ספציפית לגידול ומינימום קישור לא ספציפי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה אוניברסיטת וירג'יניה סרטן מרכז הליבה הדמיה מתקן, מתקן ניתוח ביומולקולרי, מתקן מיקרוסקופ מתקדם ומתקן הליבה Vivarium לסיוע. J. T-S הוא חוקר קריירה מוקדמת של האקדמיה לסרטן השחלות (OCA-DoD). עבודה זו נתמכה על ידי מענק NCI/NIH (R01CA233752) ל J. T-S, ארה"ב. משרד העבודה סרטן השד תוכנית לחקר סרטן השד (BCRP) פריצת דרך ברמה 1 פרס J. T-S (BC17097) ו U.S. משרד העבודה סרטן סרטן התוכנית לחקר (OCRP) פרס מימון (OC180412) כדי J.

כל ההליכים הכרוכים בטיפול בבעלי חיים ובחקרי גידולים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) כאן באוניברסיטת וירג'יניה ותואמת את הסטנדרטים הרגולטוריים הרלוונטיים
1. ביטוי וטיהור נוגדנים
<ol><li>תחזוקה של תאי CHO<ol>
<li>לגדול תאי CHO ב FreeStyle CHO מדיה בתוספת עם תוסף גלוטמין 1x זמין מסחרית ב 37 מעלות צלזיוס רועד ב 130 סל"ד עם 5% CO2 באמצעות מבחנות ארלנומייר delong או זכוכית או חד פעמי. הערה: מומלץ מאוד להשתמש בקבוקון מבולבל עם מכסה מאווררת לתסיסה מוגברת כדי לשפר את העברת גז במהלך מצב רועד. תפוקת נוגדנים מופחתת באופן משמעותי הושגה עם מבחנות רגילות (לא מבולבלות) בשל תסיסה מוגבלת של תרבות ההשעיה.</li>
		<li>שמור על מספר התא בין 1-5 x 106 תאים/מ"ל עם &gt;95% יכולת קבילות תא. אם מספר התא גדל מעל 5 x 106 תאים/מ"ל, פצל את התאים. אף פעם לא מאפשר לתאי CHO להגיע מתחת 0.2 x 106 תאים / מ"ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>טרנסאפציה של תאי CHO<ol>
<li>לגדול תאי CHO ב 200 מ"ל של מדיה (2 x10 6 תאים / מ"ל) במבחנות דלונג Erlenmeyer מבולבל. הערה: תרביות השעיה הגדלות במבחנות מבולבלות תמיד ייצרו תפוקות חלבון גבוהות יותר לעומת כאשר גדלו במבחנות שאינן מבולבלות.</li>
		<li>בצינור 15 מ"ל, לקחת 5 מ"ל של מדיה בסגנון חופשי CHO ולהוסיף 50 μg של VH שיבוט DNA ו 75 μg של DNA שיבוט VL. מערבולת לערבב היטב.</li>
		<li>דגירה את תערובת ה-DNA בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. הערה: דגירה ארוכה יותר מפחיתה את תפוקת החלבון.</li>
		<li>להוסיף 750 μL של 1 מ"ג /מ"ל פוליאתילן (PEI) מלאי לתמיסת ה-DNA באגרסיביות מערבולת התערובת עבור 30 s. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות נוספות. הערה: יש לעשות PEI טרי. מחזור הפשרה הקפאה מרובה של PEI מפחית את התשואה הכוללת באופן משמעותי.</li>
		<li>מוסיפים את כל התערובת של DNA וPEI על התאים תוך ניעור ידני של הבקבוקון. מיד לדגר את delong Erlenmeyer מנוון מבולבל עם תאים ב 37 מעלות צלזיוס רועד ב 130 סל"ד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביטוי הערה: הנוגדן יש פפטיד אות הפרשה מהונדס לקצה N-מסוף שלה, אשר מסייע נוגדנים להיות מופרשים לתקשורת.<ol>
<li>לגדל את התאים הנגועים ב 37 ° C, עם רועד ב 130 סל"ד ביום 1.</li>
		<li>ביום 2, להוסיף 2 מ"ל של סוכן 100x נגד clumping ו 2 מ"ל של 100x פתרון אנטי בקטריאלי אנטי-מיקוטי. הזז את הבקבוקון לטמפרטורה נמוכה יותר (32-34°C), עם טלטול של 130 סל"ד.</li>
		<li>בכל יום חמישי, להוסיף 10 מ"ל של הזנת 1 ים 1 אחרונות, ו 2 מ"ל של 100x תוסף גלוטמין.</li>
		<li>להמשיך לספור את התאים בכל יום שלישי באמצעות hemocytometer לאחר הכתמת aliquot של תאים עם כתם כחול trypan. ודא כי הכדאיות של התא להישאר מעל 80%.</li>
		<li>ביום 10 או 11, לקצור את המדיום לטיהור נוגדנים. סובב את התרבות ב- 3000 x g, 4 °C למשך 40-60 דקות ולאחר מכן סנן את המדיה הברורה באמצעות מסנני בקבוקים של 0.22 μM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>טיהור הערה: טיהור נוגדנים מתבצע באמצעות טור חלבון-A זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים),באמצעות משאבה פריסלטית.<ol>
<li>לערך את העמודה עם שני נפחי עמודה של מאגר איגוד (20 mM נתרן פוספט ב pH 7.4).</li>
		<li>העבר את המדיה המסוננת המכילה נוגדן (שהושג בשלב 1.3.5) דרך העמודה בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה.</li>
		<li>שטוף את העמודה עם אמצעי אחסון של שתי עמודות של מאגר איגוד.</li>
		<li>הטה את הנוגדן לתוך 500 שברים μL באמצעות מאגר 5 mL elution (30 mM נתרן אצטט ב pH 3.4).</li>
		<li>לנטרל את ה-pH של הנוגדן החורץ על ידי הוספת 10 μL של מאגר נטרול (3 M נתרן אצטט ב pH 9) לכל שבר. הערה: שבר מספר 3-6 מכיל את רוב הנוגדן. מומלץ לשמור את כל השברים במקרה הנוגדן הוא מצומק בשבר מאוחר מהצפוי.</li>
		<li>למדוד את הריכוז של נוגדנים מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר על-ידי בחירת פרוטוקול ברירת המחדל עבור IgG. הריכוז הסופי של הנוגדן מתקבל במ"ג/מ"ל על ידי לשקול את המשקל המולקולרי ואת מקדם הספיגה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. תיוג פלורסנט
הערה: נוגדנים מסומנים בצבע אינפרא אדום המכיל קבוצת תגובתיות של NHS ester, אשר זוגות חלבונים ויוצרים התקהלות יציבה. תגובה זו רגישה ל-pH ועובדת בצורה הטובה ביותר ב- pH 8.5. פלואורסצנט מבעבע עם תצוגת הצבע קליטה מקסימלית של 774 מילי-מ', ומקסימום פליטה של 789 מילי-מ"ר. pH 8.5 הוא המפתח להתייחדות יעילה.
<ol><li>דיאליזה 0.5 מ"ל של הנוגדן באמצעות קלטת דיאליזה (0.1-0.5 מ"ל) ב- 1 L של מאגר התייחדות (מאגר פוספט 50 mM ב- pH 8.5). לאחר 4 שעות להעביר את קלטת הדיאליזה למאגר טרי ודיאליזה בן לילה.</li>
	<li>הגדרת תגובת התייחדות על ידי הוספת 0.03 מ"ג של IRDye 800CW לכל 1 מ"ג של נוגדן בנפח תגובה של 500 μL. הערה: IRDye 800CW מומס DMSO בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>לבצע תגובות תיוג במשך 2 שעות ב 20 °C. הערה: הגדלת הזמן מעבר ל- 2 שעות אינה משפרת את התיוג.</li>
	<li>טהר את ההתייחדות המסויגת על-ידי דיאליזה מקיפה נגד PBS 1x.</li>
	<li>להעריך את מידת התיוג על ידי מדידת ספיגת הצבע ב 780 נה"מ וספיגה של החלבון ב 280 nm. תרומת הצבע לאות ה-280 נה"מ היא 3%.</li>
	<li>חשב את יחס הצבע/חלבון באמצעות נוסחה זו: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ01.jpg"> כאשר 0.03 הוא גורם תיקון לספיגת הצבע המשמש ב 280 נהמ' (שווה ל 3.0 % של הספיגה שלה ב 780 נה"מ), εDye ו εחלבון הם מקדם הכחדה טוחנת עבור הצבע ואת החלבון (נוגדן) בהתאמה. הערה: εDye הוא 270,000 M-1 ס"מ-1 ו εחלבון הוא 203,000 M-1 ס"מ-1 (עבור IgG טיפוסי) ב 1:1 תערובת של PBS: מתנול. חלבונים אחרים מאשר IgG עשויים להיות מקדם הכחדה טוחנת שונה מאוד. השימוש במקדם הכחדה נכון עבור חלבון של עניין הוא חיוני לקביעה מדויקת של יחס D/P.</li>
	<li>חשב את ריכוז החלבון הסופי באמצעות נוסחה זו: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ02.jpg"> הערה: תמיד לאשר את היעילות מחייב אנטיגן של נוגדן מתויג ללא תווית באמצעות ELISA (אנזים מקושר אימונוסורבנט אסיי) או ציטומטריה זרימה לפני להמשיך במחקרים vivo.</li>
</ol>3. מחקרי קסנוגרט עכבר
<ol><li>הכנת תאים סרטניים להזרקה<ol>
<li>לגדול OVCAR-3 תאים RPMI-1640 בינוני, בתוספת עם 10% של FBS ו 1x פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
		<li>יום לפני ההזרקה, תת-תרבות תאים לתוך מנות תרבות 100 מ"מ חדשות עם 10 מ"ל של בינוני / צלחת מלאה. השתמש במספר תא של 0.5-1 x 106 תאים/צלחת.</li>
		<li>דגירה תרביות בטמפרטורה של 37 °C, 95% לחות ו 5% CO2 עבור 20-24 שעות.</li>
		<li>ביום ההזרקה, להסיר את מדיום הצמיחה ממנות תרבות. לשטוף ביסודיות את שכבת התא עם Ca2+/ Mg2+ תמיסת מלח פוספט חינם של דולבקו (DPBS) כדי להסיר תאים מתים, פסולת תאית וכל העקבות של סרום, אשר עלול להפריע בפגישה טריפסין.</li>
		<li>Trypsinize התאים על ידי הוספת 1.0-1.5 מ"ל של פתרון Trypsin-EDTA לכל מנה ולנסות להפיץ את הפתרון על ידי הטיית המנה בכל רחבי ואחריו דגירה ב 37 ° C במשך 5-10 דקות. הערה: שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק את מצב trypsinization בפועל. תחת טריפסינוזציה גורמת למספר נמוך יותר של ניתוק תאים מפני השטח של צלחת תרבות, מעל טריפסינון גורם מתח תאי. אז, טריפסינוזציה נכונה היא חשובה.</li>
		<li>להוסיף 1.0-1.5 מ"ל של מדיום צמיחה מלאה לכל מנה כדי לעצור את פעולת trypsin, לאחר מכן להשעות מחדש תאים על ידי pipetting בעדינות. הערה: pipetting עדין חשוב כדי לשמור על בריאות התא.</li>
		<li>לאסוף את מתלה התא לתוך צינור חסונים 15 מ"ל ולסובב ב 250 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לאסוף את גלולת התא לאחר הסרת supernatant ולשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של הכדור ב DPBS 1x.</li>
		<li>סובב את מתלי התא במהירות נמוכה 250 x g במשך 5 דקות.</li>
		<li>להוסיף 500 μL של DPBS ולהשעות מחדש תאים על ידי pipetting עדין כדי לקבל מתלה תא יחיד.</li>
		<li>לספור תאים באמצעות מד המיוציטומטר או מונה תא אוטומטי. הערה: לקבלת דיוק טוב יותר, חזור על הספירה שלוש פעמים וקח בממוצע.</li>
		<li>כוונן את עוצמת הקול באופן כזה כך צפיפות התא הסופי יהיה 1 x 108 תאים / מ"ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הזרקת תאים תת עוריים לפיתוח xenografts עכבר הערה: כל ההליכים צריכים להיעשות בקבינט בטיחות BSL2. אתימית עירום Foxn1nu/ Foxn1+ עכברים שימשו במחקר הנוכחי.<ol>
<li>קח 50 μL של מתלה התא לתוך צינור 1.5 מ"ל ולערבב עם 50 μL של מטריצת קרום מרתף מדיום. הערה: מטריצת קרום מרתף בינוני נוטה ליצור ג'ל כמו מצב בטמפרטורת החדר, כך בזהירות לשמור על התאים ואת תערובת בינונית מטריקס על קרח. מומלץ לשמור צינורות, טיפים ומזרקים במקרר ולאחר מכן להעביר על קרח לפני הזרקת בעלי חיים.</li>
		<li>להרגיז את התערובת כדי למנוע כל תא clumping. לאחר מכן, קח את זה 100 μL של תא מתלה-מטריקס תערובת בינונית המכילה 5 x10 6 תאים, לתוך מזרק 1cc.</li>
		<li>הרם בעדינות את עור החיה כדי להפריד את העור משכבת השריר הבסיסית ולהזריק לאט את מתלי התא (100 μL) מתחת לעור (5 x 106 תאים), עם מחט 26 G. המתן כמה שניות לפני להוציא את המחט, כך כי מדיום מטריצת מרתף יכול ליצור ג'ל מוצק למחצה כמו מבנה יחד עם תאים מתחת לעור, מניעת התערובת יוצא מאתר הזריקה. הערה: תאים צריכים להיבדק לפני הזרקה לכל זיהום אשר עלול להזיק לעכברים immunodeficient. בעוד הזרקה לא לשים את המחט עמוק מדי לתוך העור כמו זה עשוי ליצור את הגידול עמוק יותר מהצפוי.</li>
		<li>יש לשמור את החיה בכלוב סטרילי ולהתבונן במשך כ-20 דקות.</li>
		<li>צפה בעכברים במשך 2-3 שבועות ולאפשר לגידול לגדול עד 500 מ"מ3 גודל.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. התאמה מקומית של נוגדנים באמצעות מערכת הדמיה vivo
הערה: בציוד הדמיה vivo (ראה טבלת חומרים)המשמש בניסוי זה משתמש סט של מסנני יעילות גבוהה ואלגוריתמים ספקטרליים un-ערבוב עבור הדמיה לא פולשנית ומעקב אחר פעילות סלולרית וגנטית בתוך אורגניזם חי בזמן אמת. המערכת מספקת הן יכולת ניטור פלואורססטי והן יכולת ניטור ביולומטרנציה.
<ol><li>להזריק 25 μg של נוגדן מתויג צבע באמצעות וין זנב.<ol>
<li>גידול מברים הנושא עכברים באמצעות 2% isoflurane. בדוק אם חוסר תגובה רפלקסים דוושה.</li>
		<li>ברגע שעכברים מפסיקים לזוז, תאט את וית הזנב הרוחית על ידי החלת מי תולעים.</li>
		<li>להזריק 25 μg (ב 100 μL) של נוגדן מתויג באמצעות מזרק אינסולין 1 cc עם מחט 26 G.</li>
		<li>באופן דומה, כשליטה שלילית, תווית ולהזריק את הנוגדן IgG1 איזוטיפ לא ספציפי אשר אינו מתמקד תאים סרטניים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע בהדמיה חיה vivo לאחר 8, 24, 48 שעות, וכו 'של זריקות נוגדנים.<ol>
<li>בתוכנה המשויכת, לחץ על אתחל את הממוקם בלוח הבקרה ואשר שטמפרטורת השלב היא 37 °C.</li>
		<li>הפעל את אספקת החמצן, כל המשאבות על מערכת ההרדמה, אספקת גז isoflurane לתא הרדמה ולהגדיר את שסתום אידוי isoflurane ל 2%.</li>
		<li>להעביר את העכברים לתא הרדמה ולחכות עד עכברים הם הרדמה לחלוטין. למרוח את משחת סיכת העיניים כדי למנוע ייבוש של עיניהם.</li>
		<li>עבור אל לוח הבקרה, הגדר את הדמיית הפלואורסצינטי באמצעות האפשרות אשף ההדמיה ובחר את העירור ב- 773 צפון-שעה ופליטה ב- 792 צפון-שעה. הערה: הגדרות ברירת המחדל של חשיפה אוטומטית מספקות תמונת פלורסנט טובה. עם זאת, ניתן לשנות את העדפות החשיפה האוטומטית לפי הצרכים.</li>
		<li>להעביר את העכברים המהדמה לתוך תא ההדמיה ולהרכיב אותו על שדה ההדמיה באמצעות קונוס האף. שלב ההדמיה מספק את האפשרות להכיל 5 עכברים בכל פעם. הערה: יש עכברי שליטה בתמונה יחד עם עכברי הבדיקה יש כמות דומה של חשיפה והגדרות אחרות בעת הניתוח.</li>
		<li>לאחר שהכל מוכן, בחר באפשרות רכישה בלוח הבקרה לרכישת התמונה.</li>
		<li>באמצעות הגדרות חשיפת אוטומטי המערכת יוצרת את התמונה בתוך דקה. התמונה שנוצרה היא כיסוי של פלואורסצינציה על תמונה מצולמת עם עוצמת פלואורסצית אופטית המוצגת ביחידות של ספירות או פוטונים, או במונחים של יעילות.</li>
		<li>לאחר רכישת התמונה, להעביר את העכברים מתא ההדמיה בחזרה לכלוב שלהם ולצפות להחלמתם במשך 1-2 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כוונן את התמונה עוד יותר עם הכלים והפונקציות המסופקים בתוך התוכנה לניתוח תמונה. כלי ניתוח תמונה נמצאים בשורת התפריטים ובפלוח הכלים.<ol>
<li>תחת כוונון תמונה, כוונן את הבהירות, הניגודיות או האטימות ובחר את קנה המידה של הצבע.</li>
		<li>השתמש בכלי ROI כדי לציין אזור עניין (ROI) בתמונה אופטית ותמדד את עוצמת האות בתוך ההחזר על ההשקעה. במידת הצורך, יצא את נתוני האות המיומתים לתוכנה של גיליון אלקטרוני והתווה את הנתונים.</li>
		<li>לצורך מחקרי מעקב, לנתח עכברים necropsies של רקמות שונות (למשל, כבד, ריאות, לב, כליות, טחול, המוח וכו ') עבור התפלגות מפורטת לא ספציפית של נוגדן פלואורסצנטי. הערה: נתונים יכולים להיות נתמכים עוד יותר עם ELISA ספציפית רקמה על ידי עשיית שימוש אנטיגן (FOLR1 במקרה זה) ב 96 גם אומר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muromonab+CD3+%28Orthoclone+OKT3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li>
<li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-siRNA+conjugates%3A+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li>
<li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1(2013).</li>
<li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T-Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncology%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595(2017).</li>
<li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li>
<li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50(2018).</li>
<li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li>
<li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954(2019).</li>
<li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor-alpha+%28FOLR1%29+expression+and+function+in+triple+negative+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209(2015).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody%2C+farletuzumab%2C+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+Therapy%22%5BJournal%5D)">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+%28Kadcyla%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li>
<li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li>
<li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer%3A+considerations+for+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li>
<li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li>
<li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology%22%5BJournal%5D)">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).</li>
<li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroPET%2FSPECT%2FCT+imaging+of+small+animal+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li>
<li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease%3A+the+SPARC+study%5BTitle%5D)+AND+%22Netherland+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li>
<li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology%3A+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Computer+Aided+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li>
<li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+%28TMDD%29+Models%5BTitle%5D)+AND+%22CPT+Pharmacometrics+and+System+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li>
</ol>

לסופרים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

משלוח סלקטיבי ותו לא רקמות גידול ספציפי של סוכן טיפולי נגד סרטן הוא המפתח למדיטת יעילות ובטיחות של טיפול ממוקד נתון13. כאן תיארנו גישה מהירה ויעילה לחקור את התפלגות רקמות וגידול מפורט של קליני, farletuzumab ונוגדן BaCa לא קליני. הגישה המתוארת ישימה לכל נוגדן חדש שנוצר וניתן להשתמש בה לצד נוגדן יעיל קלינית (עם התכונות הרצויות) עבור תכונות ההפצה של הגידול/איברים. בהתחשב רוב קולטני היעד נוגדנים (כגון HER2 בסרטן השד) הם ביטויים יתר על המידה בתאים סרטניים (רקמות), ברוב המקרים הביטוי תת אופטימלי שלהם ות...

ה-FDA אישר את הנוגדן המונוקלונלי הראשון מיקוד CD3 (OKT3, Muromonab) בשנת 19861,2. מאז, בעשרים השנים הבאות, היה פיצוץ מהיר בתחום הנדסת נוגדנים בשל ההצלחה המוחצת של נוגדנים נגד מעכבי מחסום חיסוני3. לצד הפעלה עקיפה של המערכת החיסונית, נוגדנים נועדו ישירות לסמן תאים סרטניים כדי לעסוק במדויק בתאי השפעה חיסונית, לעורר cytotoxicity באמצעות אגוניסט קולטן מוות, לחסום איתות הישרדות תאים סרטניים, לחסום אנגיוגנזה (צמיחה של כלי דם), להגביל את הרגולטורים מחסום חיסוני, לספק radioisotopes, תרופות כימותרפיות siRNAכסוכנים בהסכם 2. בנוסף, לימוד שברי משתנה שרשרת יחיד (scFv) של נוגדנים שונים על פני השטח של המטופל נגזר T-תאים ותאי NK (CAR-T ו CAR-NK) הוא אזור גדל במהירות של חקירות קליניות לטיפולים מבוססי תאים4.
הזיקה הגבוהה במיוחד של תרופות מבוססות נוגדנים המספקת תסנות אנטיגן המביעה תאים סרטניים הופכת אותו לסוכן אטרקטיבי. כמו כן, משלוח ממוקד ושמירה על גידול של נוגדן טיפולי (או תרופה כימית) הוא המפתח לאיזון יעילות על רעילות. לכן, מספר גדול של אסטרטגיות מבוססות הנדסת חלבון הכוללות אך אינן מוגבלות bispecific5 ונוגדנים tri-ספציפיים6 מנוצלים כדי לשפר באופן משמעותי את השמירה גידול אופטימיזציה של תוך ורידי (IV) מוזרקטיפולית 5,7. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה מבוססת פלואורסץ כדי לטפל בהתפלגות הגידול והרקמות של נוגדנים אנטי סרטניים יעילים פוטנציאליים.
מכיוון שלרקמות בעלי חיים יש פלואורסצנטיות אוטומטית כאשר הן מתרגשות בספקטרום הנראה לעין, הנוגדנים סומנו בתחילה עם צבע אינפרא אדום ליד (לדוגמה, IRDye 800CW). להוכחת חקירות קונספט, עשינו שימוש קולטן חומצה פולית אלפא-1 (FOLR1) מיקוד נוגדן בשם farletuzumab ונגזרתו בשם מפעיל ציטוקסיה עוגן Bispecific (BaCa)7 נוגדן כי מטרות שותפות FOLR1 קולטן מוות-5 (DR5)8 נוגדן רקומביננטי אחד. FOLR1 הוא קולטן יעד מוגדר היטב במטגן יתר בתאים סרטניים בשחלות ו-TNBC, גידול xenografts ותגידוליםהחולה 9. במיוחד, ישנם מאמצים מרובים לנצל קלינית FOLR1 באמצעות גישות מבוססות נוגדנים לעסוק בתאי השפעה חיסונית ותרופת נוגדנים להציות (ADC) לסרטן השחלותוהשד 10,11.
בשיטות אלה נייר, שיכפלנו, ביטאנו ומטוהרים קליני אנטי FOLR1 (farletuzumab) יחד עם נוגדנים שליטה אחרים באמצעות מערכת ביטוי CHO. IgG1 isotype ונוגדן קליני נגד אידיוטי mucin-16 בשם abagovomab12 שימשו כפקדים שליליים. בעקבות טיהור חלבון-A, נוגדנים מסומנים סומנו עם IRDye 800CW וננתן לתוך ויריד הזנב של עכברים עירומים או נושאות xenografts גידול בשחלות או FOLR1 אנושי transfected באופן יציב המביע סרטן המעי הגס murine קסנוגרפטים. ההתקמה הנוגדן היה במעקב על ידי הדמיה חיה באמצעות ספקטרום הדמיה vivo במספר נקודות זמן שונות7. שיטה זו אינה דורשת כל שינוי גנטי או הזרקה של הצוללת כדי לאפשר פליטת אור והוא מהיר יותר באופן משמעותי, חסכוני ויעיל. פרוטוקול השיבוט, הביטוי, הטיהור והתיוג הכללי המתואר להלן יכול להיות מיושם על כל נוגדן קליני ולא קליני אם רצפי שרשרת כבדים וקלים זמינים.

<table><tbody><tr><td>FreeStyle CHO media</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 12651-014</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנטי (100X)</td> <td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>חומר נגד גושים</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 01-0057DG</td><td></td></tr><tr><td>BD מזרק אינסולין</td><td>BD BioSciences</td><td>חתול #329420</td><td></td></tr><tr><td>קליפר IVIS ספקטרום</td><td>פרקין אלמר</td><td>חתול #124262</td><td></td></tr><tr><td>CHO CD EfficientFeed B</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat #A10240-01</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג 500 מ"ל DMEM (מדיום הנשר השונה של דולבקו)</td><td>קורנינג</td><td>חתול # 10-13-CV</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג 500 מ"ל RPMI 1640</td><td>קורנינג</td><td>חתול # 10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 מצומד אנטי אנושי IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>Cat # 709-175-149</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>ערכת HiPure Plasmid Maxiprep</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # K21007</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat # 11-0034-93</td><td></td></tr><tr><td>עירוי</td><td>Takara BioScience</td><td>STO344</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW NHS Ester</td><td>LI-COR</td><td>Cat # 929-70020</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Covetrus</td><td>Cat # 11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>חומר סיכה משחת עיניים</td><td>רענון Lacri-Lube</td><td>Cat #4089</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>Cat # 354234</td><td></td></tr><tr><td>PEI מגיב טרנספקציה</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat # BMS1003A</td><td></td></tr><tr><td>קלטות דיאליזה Slide-A-Lyzer Thermo</td><td>Scientific</td><td>Cat # 66333</td><td></td></tr><tr><td>ואקום Steritop מסננים</td><td>Millipore Express</td><td>Cat #S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15400-054</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מודלים ניסיוניים: קווי תאים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנושי: OVCAR-3</td><td>אוסף תרביות מסוג אמריקאי</td><td>ATCC HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>אנושי: תאי CHO-K</td><td>יציבים טרנספורמציה במעבדה שלנו</td><td>ATCC CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>עכבר: 4T1</td><td>מתנה אדיבה מד"ר צ'יפ לנדן, UVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכבר: MC38</td><td>מתנה אדיבה מד"ר סוזן אוסטרנד-רוזנברג, UMBC</td><td>מאומת על ידי פרופיל</td><td></td>STR</tr><tr><td>עכבר: MC38 hFOLR1</td><td>נוצר במעבדה שלנו (מאמר זה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><מודלים חזקים>ניסיוניים: עכברים בעלי חיים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: אתימיים עירום Foxn1<nu/sup>/Foxn1+</td><td>envigo</td><td>עכברים מרובים</td><td></td></tr><tr><td>: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>הזמנות</td><td></td> מרובות</tr></tbody></table>

ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

נוגדנים חד-קלונליים הם תרופות רב-תכליתיות עם זיקה גבוהה שעובדות על ידי מנגנונים עצמאיים משתנים כדי לחסל תאים סרטניים. במהלך העשורים האחרונים, התחום של נוגדנים-סמים התווסדו, נוגדנים דו-ספציפיים, קולטני אנטיגן כימריים (CAR) ואימונותרפיה סרטן התגלה כתחום המבטיח ביותר של חקירות בסיסיות וטיפוליות. עם ניסויים בבני אדם מוצלחים רבים המתמקדים קולטני מחסום חיסוני ותאי CAR-T בלוקמיה ומלנומה בקצב פורץ דרך, זה זמנים מרגשים מאוד עבור טיפולי אונקולוגיים נגזר וריאציות של הנדסת נוגדנים. למרבה הצער, מספר גדול באופן משמעותי של נוגדנים וטיפולים מבוססי רכב הוכיחו גם מאכזב בניסויים בבני אדם של סרטן מוצק בגלל הזמינות המוגבלת של תאי השפעה חיסונית במיטת הגידול. חשוב לציין, הפצה לא ספציפית של נוגדנים טיפוליים ברקמות אחרות מאשר גידולים גם לתרום לחוסר יעילות קלינית, רעילות הקשורים וכשל קליני. כמו תרגום נאמן של מחקרים פרה-קליניים לתוך שבילים קליניים אנושיים הם מאוד להסתמך על עכברים גידול xenograft יעילות ובטיחות מחקרים, כאן אנו מדגישים שיטה כדי לבדוק את הגידול ואת התפלגות רקמות כללית של נוגדנים טיפוליים. זה מושגת על ידי תיוג נוגדן מטוהר חלבון-A עם צבע פלורסנט אינפרא אדום ליד ואחריו הדמיה חיה של עכברים נושאים גידול.

המתודולוגיה המתוארת, תחילה שיכפלנו נוגדנים המתמקדים קולטן חומצה פולית אלפא-1 (FOLR1) בשם farletuzumab, ונוגדן ביסקי בשם BaCa המורכב farletuzumab ו lexatumumab יחד עם נוגדנים שליטה כגון abagovomab (רצפים שסופקו בקובץ משלים 1). פרטים של תחומים כבדים (VH) משתנים ומשתנים של אור משתנה (pVH, pVL) מוצגים באות 1A. כדי לאשר את השיבוטים החיוביים, ביצענו מושבה PCR באמצעות אות פפטיד קדימה (SP For) ו CK Rev / CH3 Rev פריימרים (רצפים שסופקו בקובץ משלים 1). התוצאות המייצגו...

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את ההתקמה vivo של נוגדנים בעכברים גידול xenograft מודלים.

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

פרוטוקול זה מדגים את הביטוי והטיהור של נוגדנים וניטור בזמן אמת של התפלגות הנוגדנים בגידול וברקמות. סינון נוגדנים עם פרוטוקול מתואר יעזור לבחור נוגדנים בעלי הפצת רקמות לא ספציפית מוגבלת, ולהעשיר לוקליזציה של גידולים. הטכניקה המתוארת מהירה וחסכונית.טכניקות אחרות, כגון טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים, יקרות מאוד ודורשות מעקב רדיואקטיבי ומתוחכם אחר. הטכניקה אינה מוגבלת לסרטן מיקוד נוגדנים. זה יכול להיות מיושם על כל מחלה אחרת, כגון מחלות ריאה או לב, לניתוח של הפצת נוגדנים בגוף.בהדגמת ההליך, יהיה ג'רמי גייטסמן, טכנאי וטרינרי מהאוניברסיטה שלי. תאי CHO גולמיים ב-200 מיליליטר של מדיה, בדלונג, ארלןמאייר בלבל בקבוקונים. שלב חמישה מיליליטר של מדיה בסגנון חופשי CHO עם 50 מיקרוגרם של DNA שיבוט כבד משתנה, ו 75 מיקרוגרם DNA שיבוט אור משתנה בצינור 15 מיליליטר.ואז, מערבולת הצינור. השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הוסף 750 מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר פוליאתילנימין תסנור ה-DNA, ו מערבולת אגרסיבית זה במשך 30 שניות.השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות נוספות. מוסיפים את התערובת כולה לתאי CHO תוך טלטול ידני של הבקבוק. מיד דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 130 סל"ד.ביום שלמחר, להוסיף שני מיליליטר של 100 X נגד גושים סוכן, ושני מיליליטר של 100 X פתרון אנטיבקטריאלי אנטימיקוטי לתאים. הדגירה את flasks ב 32 כדי 34 מעלות צלזיוס, עם רועד ב 130 סל"ד. המשך culturing התאים במשך 10 עד 11 ימים, הוספת 10 מיליליטר של הזנת טריפטון N1, ושני מיליליטר של 100 X תוספת גלוטמין בכל יום חמישי.לספור את התאים בכל יום שלישי כדי להבטיח כי הכדאיות התא נשאר מעל 80% ביום 10 או 11, לקצור את המדיום לטיהור נוגדנים על ידי צנטריפוגה של התרבות ב 3000 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס במשך 40 עד 60 דקות. לאחר מכן, סנן את המדיה הברורה באמצעות מסנן בקבוקים של 0.22 מיקרומטר. כדי לטהר את הנוגדנים, לצייד את החלבון עמודה A עם שני נפחי עמודות של חיץ מחייב.העבר את המדיה המסוננת דרך העמודה בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לאחר מכן שטפו את העמודה עם שני אמצעי אחסון של עמודות של מאגר איגוד. השתמש בחמישה מיליליטר של מאגר אלוטיון כדי לחמק מהנוגדן לשברים של 500 מיקרוליטר.ולנטרל את ה- pH של הנוגדן רמז על ידי הוספת 10 microliters של חיץ נטרול עבור שבר. למדוד את הריכוז של הנוגדן מטוהר עם ספקטרופוטומטר באמצעות פרוטוקול ברירת המחדל עבור IgG. דיאליזה 0.5 מיליליטר של הנוגדן באמצעות קלטת דיאליזה בליטר אחד של חיץ ההטיה.לאחר ארבע שעות, מעבירים את קלטת הדיאליזה למאגר טרי ומעבירים במהלך הלילה. כדי להגדיר תגובת התייחדות, להוסיף 0.03 מיקרוגרם של צבע IRR 800 CWU לכל מיליגרם אחד של נוגדן בנפח כולל של 500 microliters. הדגירה את התערובת במשך שעתיים ב 20 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לטהר את תווי conjugates על ידי דיאליזה נרחבת נגד PBS.להעריך את מידת התיוג על ידי מדידת ספיגת הצבע 780 ננומטר, וספיגת החלבון ב 280 ננומטר. כדי לפתח קסנוגרפים של העכבר, הרם בעדינות את עור החיה והפרד אותו משכבת השרירים הבסיסית. לאט להזריק 100 microliters של השעיית תא מתחת לעור עם מחט 26 מד.המתן כמה שניות לפני להוציא את המחט, כך מטריצת המרתף מדיום ליידע את המבנה מוצק למחצה דמוי ג'ל יחד עם תאים מתחת לעור, אשר ימנע את התערובת לצאת מאתר ההזרקה. כדי לבצע הדמיה vivo, להזריק את הצבע שכותרתו נוגדן דרך וריד הזנב. לאחר הרדמה של העכבר, בדוק את חוסר התגובה רפלקסים דוושה, ולהעליל את הוריד על ידי החלת מים חמים.השתמש מזרק אינסולין 1cc עם מחט מד 26 להזריק 25 מיקרוגרם של הנוגדן שכותרתו בנפח של 100 microliters. כשליטה שלילית, תווית ולהזריק את נוגדן איזוטיפ IgG לא ספציפי אשר אינו למקד תאים סרטניים. בצע הדמיה vivo שמונה, 24 ו 48 שעות לאחר זריקות נוגדנים.בתוכנת הדימות, לחץ על אתחל. אשר כי טמפרטורת הבמה היא 37 מעלות צלזיוס. בלוח הבקרה, להגדיר הדמיה פלואורסצנטי באמצעות אשף ההדמיה, ולהגדיר את העירור ל 773 ננומטר, פליטה ל 792 ננומטר.העבר את העכבר הרדמה לתא ההדמיה. מקם אותו בשדה ההדמיה באמצעות חרוט האף. כשתהיה מוכן, לחץ על רכוש בלוח הבקרה לרכישת התמונה ולחץ על חשיפה אוטומטית.התמונה שנוצרה היא שכבת-על של הפלואורסצנטיות בתמונה הצילומית עם פלואורסצנטיות אופטית וצפיפות המוצגת ביחידות של ספירות או פוטונים. שיבוטים חיוביים cDNA עם תחומי אור כבד משתנה אושרו עם PCR המושבה. תוצאות מייצגות של farletuzumab מטוהרים לרוץ על דף SDS שאינו צמצום והפחתת מוצגים כאן.שרשראות כבדות וקלות ייצרו רצועות 50 ו-25 קילו-דלטון לאחר ההפחתה. כריכת נוגדנים לחלבונים מקומיים על פני התא אושרה גם היא. נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית הוזרקו לווריד זנב, לעכברים שהושתקו ב-R1 מלא המבטאת גידולים.בעלי חיים חיו תמונה בנקודות זמן מרובות באמצעות IVIS. הנתונים נוגדנים להעשרה סלקטיבית של נוגדני R1 ו-BaCa מלאים לגידולים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי תחזוקה מוחזקת של תאי CHO היא קריטית עבור תשואת נוגדנים.וחשוב לקבל רמה דומה של תיוג צבע פלואורסצנטי עבור לוקליזציה גידול תחרותי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה של רקמות ורקמות או ELISA ספציפיות לגידול כדי לתמוך בעכברים החיים המדמימים נתונים.

analyzing-tumor-tissue-distribution-target-antigen-specific

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מתאר את הטכניקה של רדיואימונותרפיה ממוקדת מראש או PRIT, שבה חיסונים מצומדים ואחריו רדיוליגנדים ניתנים לטיפול בגידולים. רדיואימונותרפיה זו מפחיתה את מנות הקרינה לרקמות בריאות ומשתמשת ברדיונוקלידים בעלי זמן מחצית חיים נמוך מאוד שאינם תואמים לווקטורים מבוססי נוגדנים.

רדיואימונותרפיה ממוקדת מראש: שיטה להעברה ממוקדת של רדיונוקלידים טיפוליים לגידולים

סרטון זה מדגים טכניקה לחקר לוקליזציה in vivo של נוגדנים ספציפיים לגידול במודל xenograft של גידול עכבר. עם הזרקה תת-עורית של תאים סרטניים לעכברים לצורך היווצרות גידולים, מוזרקים נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית הנקשרים לקולטנים ספציפיים לגידול, ומאפשרים הערכה in vivo של לוקליזציה של נוגדנים באמצעות הדמיה.

טכניקה להערכת לוקליזציה in vivo של נוגדנים ספציפיים לגידול

הביקוש לאלקטרונים הפוכים ביואורתוגונליים Diels-Alder נרתמה ליצירת אסטרטגיית הדמיית PET יעילה ומודולרית לסרטן. בפרוטוקול זה, השלבים של מתודולוגיה זו מתוארים בהקשר של מערכת מודל המשתמשת בנוגדנים ממוקדים לסרטן המעי הגס huA33 ורדיוליגנד 64Cu.

רתימת ביקוש Bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition לPretargeted PET הדמיה

פפטידים ויראלי-derived מצמידים נוגדן-conjugates (ACs) היא גישה צובר תאוצה בשל הפוטנציאל להעברת מטענים מולקולרית עם הצטברות תאי הגידול מוגברת. ניצול שיטות נפוצות כדי להעריך את ההטיה פפטיד, AC הצטברות תאיים המטען ואת הגידול מיקוד, פרוטוקול זה מסייע החוקרים במהלך שלבי הפיתוח מפתח.

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך הסינרגטיות בין נוגדן נגד סרטן תרופות antineoplastic במודלים פרה באמצעות המשוואה אינדקס שילוב של צ'או, Talalay.

Potentiation של נוגדנים נגד סרטן יעילות על-ידי סמים Antineoplastic: זיהוי של נוגדן תרופתיים הסינרגטיות באמצעות המשוואה אינדקס שילוב

פרוטוקול זה מתאר עבודה מפורט עבור הדור של ex-vivo אפיון של וירוסים oncolytic ביטוי של immunomodulators, באמצעות וירוסי חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה. יישום והתאמה וקטור פלטפורמות אחרות, transgenes נאיץ את ההתפתחות של הרומן immunovirotherapeutics לתרגום קליניים.

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

פרוטוקול זה מתאר את סינתזה של אפיון טרנס- cyclooctene (TCO)-שונה נוגדן, radioligand tetrazine התווית על-ידי Lu (ט ז) 177עבור pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). בנוסף, זה מפרט את השימוש אלה בונה שני עבור ויוו biodistribution ומחקרים טיפול האורך במודל מאתר של סרטן המעי הגס.

Radioimmunotherapy pretargeted התגובה תגובת דילס-אלדר דרישה אלקטרון הופכי

שיטת לוקליזציה vivo immunofluorescence ניתן להשתמש כדי לבחון ב vivo biodistribution של נוגדנים ושערי מעלה נוגדן למטרות אונולוגיות באורגניזמים חיים באמצעות שילוב של vivo הגידול מיקוד ולשעבר vivo חיסוני שיטות.

ב Vivo אימונוofor, לוקליזציה להערכת הטיפול הרפואי והאבחון ביופצת התרופות בחקר הסרטן

פרוטוקול זה מתאר את הדור כירורגי של גידולים הלבלב אורתודפית ואת העיכול המהיר של גידולים מבודדים מבודד מורטין הלבלב. לאחר העיכול, אוכלוסיות קיימא תאים החיסונית יכול לשמש ניתוח נוסף במורד הזרם, כולל לשעבר גירוי vivo של תאים T לאיתור ציטוקינים תאיים ידי הזרימה cy, try.

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

כאן, אנו מתארים שיטה להמרת תאי T אנושיים עם לוציפראז כדי להקל על מעקב in vivo אחר סחר בתאי T המושרה על ידי נוגדנים דו-ספציפיים לגידולים במחקרים כדי להעריך את היעילות והמנגנון נגד גידולים של נוגדנים דו-ספציפיים העוסקים בתאי T.

מעקב אחר סחר בתאי T הנגרמים על ידי נוגדנים דו-ספציפיים באמצעות תאי T אנושיים מותמרים של לוציפראז

במאמר זה אנו מציגים שיטה לזיהוי תרכובות המווסתות את מנגנון ADCC, מנגנון חשוב להרג תאים סרטניים של נוגדנים אנטי-סרטניים. ההשפעה ציטוטוקסית של תאי NK נמדדת בספרואידים של תאי סרטן השד בנוכחות Trastuzumab. ניתוח תמונה מזהה רוצחים חיים ומתים ותאי מטרה בספרואידים.

כימות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים במודל ספרואידי גידול: יישום לגילוי תרופות

למדו פרוטוקול לביטוי וטיהור נוגדנים ולמעקב בזמן אמת אחרי התפלגותם בגידולים וברקמות. שיטה זו מאפשרת לבחור נוגדנים עם התפלגות ספציפית לגידול ומינימום קישור לא ספציפי.

ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד

גלה סרטונים נוספים