פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

רק חלבונים מחייבים שולטים בתהליכים ביולוגיים מרובים. שיטת FLAG-Biotin CLIP-seq זו, ומכאן פרופיל גלובלי של הסידור המיוחד והקצבי של RNAs ו- RBPs בתאי יונקים. שיטה זו מאפשרת זיהוי יעיל של RNAs מאוגדי חלבון ישירים ללא SDS-PAGE והליכי העברת הממברנה.

בהשוואה ל- CLIP-seq המסורתי הוא ללא איזוטופ והוא אינו דורש נוגדן ספציפי לחלבון. התחל על ידי ציפוי על 3 מיליון תאי STEM עובריים עכבר בצלחת 10 ס"מ ודגירה אותם בן לילה. למחרת, להסיר את המדיום עם ואקום ולטפל בתאים עם שני מיליליטר של 0.25% trypsin EDTA במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.

מרווה את הטריפסין עם ארבעה מיליליטר של מדיום MESC טרי, ומעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה אותם ב 300 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. להשעות את התאים בארבעה מיליליטר של PBS קר ולהעביר אותם בחזרה לצלחת 10 ס"מ לקישור צולב.

להקרין את התאים עם אור UV 254 ננומטר, ולאחר מכן להעביר את התאים המקושרים לצינור 15 מיליליטר. לסובב את התאים האלה ב 300 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להסיר את על טבעי lyse התאים עם 500 microliters של Buffer A מוכן על פי הוראות כתב היד. מעבירים את התאים לצינור 1.5 מיליליטר נטול RNAse, ומדרגים אותם בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין במשך 30 עד 60 דקות.

לטפל lysate עם 30 microliters של DNAse 1 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, לעצור את התגובה על ידי הוספת ארבעה microliters של 0.5 EDTA טוחן. לסובב את גלולה מסיסים על ידי צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהעביר את supernatant לצינור חדש מקורר מראש 1.5 מיליליטר.

מעבירים את התא לליזט לחרוזי FLAG מוגדרים מראש, ודגירה את המדגם בארבע מעלות צלזיוס תוך כדי סיבוב במשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את חרוזים במשך שתי דקות ב 3000 פעמים G ולהסיר את supernatant. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מאגר A לדגימה, ודגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן לסובב את חרוזים ולהסיר את על טבעי.

חזור על הכביסה עם מאגר A, ואחריו שתי שטיפות עם Buffer B.To מצונן מראש - אלוט עם שלושה X FLAG-peptide, להכין את פתרון elution כמתואר בכתב היד טקסט ולסובב את קדילי דגל. הסר את העל-טבעי עם קצה צר של פיפיאט והוסף 200 מיקרוליטרים של שלושת פתרון האלוטיון של X FLAG לכל דגימה. דגירה הדגימות במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין.

ואז לסובב את חרוזים במשך שתי דקות ב 3000 פעמים G. להעביר את supernate לצינור טרי ולחזור על האלוטיון פעמיים. חסוך 5% מהאלואנטים לניתוח כתמים מערביים או כתמי כסף כדי לבדוק את היעילות של immunoprecipitation של FLAG. מעבירים את האלונטים המושכים ל חרוזי סטרפטוודין מוכנים ומסובבים את הדגימות בעדינות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שלוש שעות או לילה.

לאחר מכן, לאסוף את חרוזים על מעמד מגנטי ולהסיר את supernatant. לשטוף את חרוזים פעמיים עם 500 microliters של חיץ C עם סיבוב עדין במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעמיים עם 500 microliters של חיץ D, ופעמיים עם 500 microliters של חיץ PNK קר כקרח, איסוף חרוזים על מעמד מגנטי והסרת supernatant בין שטיפות.

לביצוע עיכול RNA חלקי, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון MNA לכל מדגם ומערבולת ב-37 מעלות צלזיוס עם מערבל תרמי למשך 10 דקות. לאסוף את חרוזים עם מעמד מגנטי במשך 30 שניות ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, שטפו אותם עם חיץ PNK-EDTA, מאגר C ומאגר PNK בהתאם לכיווני כתב היד.

לאסוף את חרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את המאגר. לאחר מכן, מוסיפים את תערובת התגובה CIP ומערבולת את חרוזים ב 37 מעלות צלזיוס עם מערבל תרמי במשך 10 דקות. לשטוף במהירות את חרוזים פעמיים עם 500 microliters של חיץ PNK EDTA קר כקרח, ואחריו שתי שטיפות עם 500 microliters של חיץ PNK קר כקרח.

לאחר הכביסה, מוסיפים 40 מיקרוליטרים של שלוש רצועות קישור עיקריות לערבב את חרוזים, ומערבולת אותם ב 16 מעלות צלזיוס עם מערבל תרמי במשך שלוש שעות או לילה. קשירה יעילה של המקשר לבעלות הברית היא קריטית לניסוי זה. בדוק את צינור התגובה מדי פעם כדי לוודא כי אלה לא לזרז במהלך קשירה.

לאחר הדגירה, חזרו על השטיפה עם מאגרי PNK EDTA ו- PNK, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של PNK מעורבבים לתרוזות, ומערבולת אותם ב 37 מעלות צלזיוס עם מערבל תרמי במשך 10 דקות. לשטוף את חרוזים עם מאגרי PNK EDTA ו PNK, ולאחר מכן להמשיך עם בידוד RNA כמתואר בכתב היד טקסט. בהשוואה לטיהור זיקה חד-שלבי בתיווך FLAG-Biotin או סטרפטבידין, טיהור טנדם FLAG-Biotin הסיר כמעט את כל החלבונים המטוהרים המרכזיים, תוך הימנעות מזיהום של אינטראקציות RNA עקיפות של חלבונים.

LIN28 ו- WDR43, FBIO CLIP-seq בוצע באמצעות תאי STEM עובריים של העכבר. בסך הכל, כ-7.7 מיליון ו-2.2 מיליון קריאות ייחודיות אוחזרו עבור LIN28 ו-WDR43 בהתאמה. השוואה בין תצוגות הרצועה מציגה תבניות איגוד שונות בלוקוס RN45 שלפני rRNA.

האתרים המקושרים במוטיב GGA G של RNA טרום-let7-g על ידי LIN28, FBIO CLIP-seq או מזוהה. כמו כן, נקבעו מוטיבים מועשרים של RNA באתרי הכריכה, ואחוז הנוקלאוטידים שעברו מוטציה בסוגים שונים של מוטציות. מראה כי LIN28 מעדיף להיקשר לנוקלאוטיד הגן.

ובכן, בשעה 22: 00, פרוטוקול זה, חשוב לאשר את היעילות של immunoprecipitation כדי לוודא כי קומפלקסים חלבון בלבד טוהרו בהצלחה.