Name: פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: חקור פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA בשיטת Fbio CLIP-seq בתאי יונקים. שיטה זו מאפשרת זיהוי יעיל של RNA הקשור לחלבון ללא צורך ב-SDS-PAGE וללא שימוש באיזוטופים או נוגדנים ספציפיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה במענק היא מהתוכנית הלאומית למחקר בסיסי של סין (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31630095) והמרכז למדעי החיים באוניברסיטת צגחואה.

1. בניית קו תא
<ol><li>לשבט את הגן של עניין לתוך pPiggyBac וקטור וקטור pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA של עניין]-(היגרומיצין עמיד) plasmid הנושאת אפיטופ דגל ביוטין13,21 כדי לבטא תג דגל-ביוטין התמזגו RBP(FBRBP).</li>
	<li>שיתוף תרגום RBP FBהמביע וקטור עם וקטור pBase לתוך קו תא המביע את אנזים BirA22. הערה: במחקר זה, הגן FBRBP עבר לתאי גזע עובריים של עכבר (mESCs) הנושאת וקטור ביטוי BirAמשולב 21. לחלופין, RBP המביעיםוקטור יכול להיות cotransfected לתאים עם pBase ו pPiggyBac-BirA-V5 יחד.</li>
	<li>לגדל את התאים mESC על כלים ג'לטין ולשמור על תרבות mES בינוני (טבלת חומרים) ב 5% CO2 ב 37 ° C. בחר את התאים הנגועים עם hygromycin b (100 μg / mL) במשך שבוע אחד.</li>
	<li>לאחר בחירת תרופות, לקצור תאים על ידי מאגר טעינת SDS (טבלה 1) ולהשתמש כתםמערבי 23 כדי לאשר את התיוג והביטוי של הגן עם נוגדן FLAG סטרפטאבידין-HRP, בהתאמה.</li>
</ol>2. קישור צולב
<ol><li>צלחת ~ 3 x 106 mES תאים בצלחת 10 ס"מ יום אחד לפני הניסוי, כך התאים יגדלו 70-90% confluence בעת קציר (~ 5-10 מיליון תאים לכל מדגם).</li>
	<li>הסר את המדיום באמצעות ואקום. לטפל בתאים עם 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהרוות את הטריפסין על ידי 4 מ"ל של mESC טרי בינוני. העבר את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. סובבו את התאים על-ידי צנטריפוגציה ב-300 x g למשך 3 דקות ב-4°C והסרו את הסופרנטנט.</li>
	<li>להשעות את התאים עם 4 מ"ל של PBS קר וצלחת התאים בחזרה לצלחת 10 ס"מ עבור קישור צולב. חבר את התאים באמצעות קרינה עם אור UV של 254 ננ"מ (הגדר את המקשר הצולב UV עם פרמטר של 400 mJ/cm2). הערה: עבור מונושכבות תא, התאים יכולים להיות מקושרים עם אור UV ישירות על הלוח לפני טיפול trypsin.</li>
	<li>העבר את התאים המקושרים לצינור של 15 מ"ל. סובבו על ידי צנטריפוגציה ב-300 x g למשך 3 דקות ב-4°C והסרו את הסופרנטנט. הערה: ניתן לאחסן את גלולת התא המקושרת ב- -80 °C עד לשימוש.</li>
</ol>3. הכנת תאי ליוס
<ol><li>Lyse התאים עם 500 μL של מאגר כביסה A (טבלה 1) טרי בתוספת עם 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 קוקטייל מעכב פרוטאז, ו 400 מעכב U/mL RNase. העבר את התאים לצינור 1.5 מ"ל ללא RNase. דגירה התאים במשך 30-60 דקות על רוטור עם סיבוב עדין ב 4 ° C.</li>
	<li>לטפל lysate עם 30 μL של DNase I ב 37 ° C במשך 10 דקות. לעצור את התגובה על ידי הוספת 4 μL של 0.5 M EDTA. סובבו את הגלולה המסיסה ב-12,000 x g למשך 20 דקות ב-4°C והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מ"ל. הערה: לשימוש מיידי, לשמור על קרח. אם לא ייווה שימוש בסופרנט באופן מיידי, אחסן אותו ב- -80 °C עד לשימוש.</li>
</ol>4. הכנת חרוזי דגל
<ol><li>להוסיף 40 μL של חרוזי דגל slurry לכל דוגמה לצינור טרי 1.5 מ"ל.</li>
	<li>שוטפים במהירות את החרוזים עם 0.5 מ"ל של חוצץ שטיפה קר כקרח A וסובבים ב-3,000 x גרם למשך 2 דקות ב-4°C.</li>
	<li>חזור על שלב 4.2 פעם אחת. סובבו את החרוזים עם 3,000 x גרם למשך 2 דקות ב-4°C. הסר בזהירות את המאגר עם קצה פיפטה צר. הימנע מהסרת החרוזים.</li>
</ol>5. ערך חיסוני
<ol><li>מעבירים את תא התא לשלב 3.2 לחרוזי הדגל המיוחלים מראש. סובבו את כל הדגימות על שייקר גלילה ב-4°C בעדינות. לדגם את חרוזי הדגל עם ליסטו במשך 2-4 שעות או לילה.</li>
	<li>צנטריפוגה את החרוזים במשך 2 דקות ב 3,000 x g ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים עם 0.5 מ"ל של מאגר כביסה prechilled A על ידי דגירה במשך 5 דקות ב סיבוב ב 4 מעלות צלזיוס, לסובב את החרוזים עם 3,000 x g עבור 2 דקות ולהסיר את supernatant. חזור על השטיפה 1x.</li>
	<li>חזור על השטיפה 2x כמתואר בשלב 5.3 עם 0.5 מ"ל של מאגר כביסה prechilled B(טבלה 1).</li>
</ol>6. אלגנטיות עם פפטיד דגל 3x
<ol><li>הכן 3x פתרון חומוס דגל על ידי המסת 1 מ"ג של פפטיד דגל 3x עם 5 מ"ל של מאגר כביסה A לריכוז סופי של 200 ng/mL.</li>
	<li>סובב את חרוזי FLAG מ- 5.4 עם 3,000 x g למשך 2 דקות. הסר את הסופרנטנט בזהירות. ודא שרוב הסופרנטנט מוסר באמצעות קצה פיפטה צר.</li>
	<li>הוסף 200 μL של 3x פתרון תסה דגל לכל דוגמה. מדגרים את הדגימות עם סיבוב עדין במשך 30 דקות ב-4°C. סובב את חרוזי הדגל למשך 2 דקות ב- 3,000 x g. מעבירים את הסופרנטנטים לצינורות טריים.</li>
	<li>חזור על ההתחכך 2x כמתואר בשלבים 6.2 ו 6.3 והבריכה eluents יחד. חסוך 5% מהבלוטות לניתוח כתם מערבי או כתמי כסף כדי לבדוק את היעילות של FLAG-IP.</li>
</ol>7. הכנת חרוזים סטרפטאבידין
<ol><li>הכינו 50 μL של חרוז סטרפטאבידין slurry לכל מדגם. לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי עבור 30 s ולהסיר את supernatant עם קצה פיפטה.</li>
	<li>לשטוף במהירות את החרוזים עם 0.5 מ"ל של חיץ כביסה קר כקרח A ולאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי עבור 30 s.</li>
	<li>חזור על השטיפה 1x. הסר את חומר העל לאחר השטיפה.</li>
</ol>8. טיהור זיקה ביוטין
<ol><li>העבר את האדונים הנצברים מ- 6.4 לחרוזי סטרפטאבידין מ- 7.3 וסובב בעדינות את הדגימות ב- 4°C למשך 1-3 שעות או לילה.</li>
	<li>לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי עבור 30 s ולהסיר את supernatant. לשטוף את החרוזים 2x עם 500 μL של מאגר כביסה C (שולחן 1) על ידי סיבוב עדין ב RT במשך 5 דקות.</li>
	<li>לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את supernatant. לשטוף את החרוזים 2x עם 500 μL של מאגר כביסה D (טבלה 1) על ידי סיבוב ב RT במשך 5 דקות.</li>
	<li>לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את supernatant. לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח(שולחן 1).</li>
</ol>9. עיכול RNA חלקי
<ol><li>לעשות דילול10 5-קיפולשל MNase עם מאגר תגובה MNase (טבלה 1). הוסף 100 μL של פתרון MNase לכל מדגם. מערבולת החרוזים ב 37 ° C עם מיקסר תרמי להגדיר ב 1,200 סל"ד (5 s לרוץ, 30 s stop) במשך 10 דקות, לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי עבור 30 s ולהסיר את supernatant. הערה: יש לייעל את הריכוז של MNase עבור חלבונים שונים מחייבי RNA. ריכוז MNase שיכול לעכל RNAs לתוך 30-50 nt שברי (נקבע על-ידי גודל ההוספה של הספריה הסופית) הוא אופטימלי.</li>
	<li>לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח + EGTA(שולחן 1). לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את supernatant בין כל שלב לשטוף.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים 2x עם 500 μL של מאגר כביסה C על ידי סיבוב עדין במשך 5 דקות ב RT. לאחר מכן לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח.</li>
</ol>10. דפוספורילציה של RNA
<ol><li>להפוך פוספטאז מעיים עגל (CIP) תגובה לערבב עם 8 μL של 10x CIP מאגר(טבלת חומרים),3 μL של אנזים CIP, ו 69 μL של מים. הנפח הכולל הוא 80 μL לכל תגובה.</li>
	<li>לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את המאגר. הוסף את תערובת תגובת CIP לחרוזים. מערבולת החרוזים ב 37 ° C עם מיקסר תרמי להגדיר על 1,200 סל"ד (5 s לרוץ, 30 s להפסיק) במשך 10 דקות.</li>
	<li>לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח + EGTA. לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח.</li>
</ol>11. 3' קישור קשירה
<ol><li>לעשות 3 ' מקשר לערבב עם 4 μL של 20 μM 3 ' מקשר, 4 μL של 10x T4 RNA ליגאס מאגר, 4 μL של 50% PEG8000, 2 μL של T4 RNA ligase 2 (נחתך), ו 26 μL של מים. הנפח הכולל הוא 40 μL לכל תגובה.</li>
	<li>לאסוף את החרוזים מ שלב 10.3 עם מעמד מגנטי ולהסיר את המאגר. להוסיף 40 μL של 3 ' מקשר קשירה לחרוזים. מערבולת החרוזים ב 16 ° C עם מיקסר תרמי להגדיר על 1,200 סל"ד (5 s לרוץ, 30 s להפסיק) עבור 3 שעות או לילה.</li>
	<li>לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח + EGTA. לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח.</li>
</ol>12. טיפול PNK
<ol><li>לעשות תערובת PNK עם 4 μL של 10x PNK מאגר, 2 μL של אנזים PNK T4, μL 1 של 10 mM ATP, ו 33 μL של מים. הנפח הכולל הוא 40 μL לכל תגובה.</li>
	<li>לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את המאגר. להוסיף 40 μL של תערובת PNK לחרוזים. מערבולת החרוזים בעדינות ב 37 ° C עם מיקסר תרמי להגדיר על 1,200 סל"ד (5 s לרוץ, 30 s להפסיק) במשך 10 דקות.</li>
	<li>לשטוף במהירות את החרוזים עם 500 μL של חיץ PNK / EGTA קר כקרח.</li>
	<li>לשטוף במהירות את החרוזים עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח. שמור 5% מהחרוזים לניתוח כתמי כתמים מערביים או כסופים כדי לאשר את היעילות של פירוק חיסוני.</li>
</ol>13. בידוד RNA
<ol><li>לאסוף את החרוזים מ שלב 12.4 עם מעמד מגנטי ולהסיר את המאגר. להוסיף 200 μL של חלבון K עיכול מאגר(שולחן 1). מערבולת החרוזים במשך 30 דקות ב 37 ° C עם מיקסר תרמי להגדיר ב 1,200 סל"ד (5 s לרוץ, 30 s להפסיק). לבודד מגנטית את החרוזים ולקחת את supernatant לניסוי.</li>
	<li>מוסיפים 400 μL של ריגנט בידוד RNA (טבלת חומרים) לסופרנט משלב 13.1, מערבבים ביסודיות, וגרה על קרח במשך 5 דקות. מוסיפים 80 μL של כלורופורם ומערבבים היטב ולאחר מכן דגירה על קרח במשך 5 דקות. סובב עם 12,000 x גרם למשך 10 דקות ו-4°C. הערה: שלב זה צריך להתבצע במכסה מנוע כימי.</li>
	<li>קח את supernatant (~ 500 μL) ולהוסיף שני כרכים של isopropanol:אתנול לערבב (1:1), 1/10 נפח של 3 M נתרן אצטט (pH = 5.5), ו 1 μL של גלוקוגן. מקפיאים ב-20°C למשך 2 שעות. צנטריפוגה ב-4°C עם 12,000 x גרם ל-20 דקות. </li>
	<li>לשטוף את הגלולה 2x עם קר כקרח 70% אתנול. סובבו את הגלולה ב-4°C עם 12,000 x גרם למשך 5 דקות. מסירים את הסופרנט וייבשים את הגלולה. לפזר את RNAs ב 5 μL של RNase חינם H2O.</li>
</ol>14. 5' רצועה מקשר RNA
<ol><li>לעשות 5 ' תמהיל קשירה RNA עם 1 μL של 10x T4 RNA ליגאז מאגר, 0.5 μL של BSA (1 μg / μL), 1 μL של 10 mM ATP, 1 μL של מעכב RNase, ו 0.5 μL של T4 RNA ligase. הנפח הכולל הוא 4 μL לכל תגובה.</li>
	<li>הוסף 1 μL של 5 ' 20 μM RNA מקשר RNA מ שלב 13.4, denature RNA על ידי חימום ב 70 ° C במשך 2 דקות, ולהירגע על קרח באופן מיידי.</li>
	<li>הוסף את תערובת קשירה RNA 5 ' RNA משלב 14.2. דגירה ב 16 מעלות צלזיוס בלילה.</li>
</ol>15. שעתוק הפוך
<ol><li>לטהר את RNAs כמתואר בסעיף 13 ולהמיס את RNA עם 11.5 μL של מים ללא RNase.</li>
	<li>מוסיפים 1 μL של 10 μM פריימר שעתוק הפוך RNA מטוהר, חום ב 70 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות, ומצננים על קרח באופן מיידי.</li>
	<li>לעשות תמהיל שעתוק הפוך עם 4 μL של 5x מאגר שעתוק הפוך, 1 μL של 10 mM dNTPs, 1 μL של 0.1 M DTT, 1 μL של מעכב RNase, ו 0.5 μL של תעתיק הפוך(טבלת חומרים). הנפח הכולל הוא 7.5 μL לכל תגובה.</li>
	<li>להוסיף 7.5 μL של תמהיל שעתוק הפוך ל-RNA, דגירה ב 50 °C במשך 30 דקות, ולעצור את התגובה על ידי דגירה ב 70 ° C במשך 10 דקות. לעזוב ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>16. הגבירת PCR
<ol><li>הפוך לערבב ההגדלה PCR עם 15 μL של 2x PCR אב תערובת(טבלת חומרים),5 μL של cDNA משלב 15.4, 0.6 μL של פריימר 10 μM קדימה 1 (טבלה 2), 0.6 μL של פריימר הפוך 10 μM 1 (טבלה 2), ו 8.8 μL של H2O. הנפח הכולל הוא 30 μL.</li>
	<li>הגביר את ה- cDNA עם ההגדרות הבאות: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (חזור על שלבים 2-4 עבור 15-20 מחזורים), 72 °C 2 דקות והחזק ב- 4 °C. הפעל את מוצר PCR על ג'ל agarose 2-3%. חותכים את ה-DNA של ~ 100-150 bp, לחלץ DNA עם ערכת חילוץג'ל (טבלת חומרים),ולתקוע את ה-DNA עם 20 μL של מים.</li>
	<li>קח 3 μL של מוצר PCR מטוהר, להגביר עם פריימר קדימה 2 (טבלה 2) והפוך פריימר 2 (פריימר אינדקס; שולחן 2) כמתואר בשלב 16.2 עבור חמישה מחזורים כדי להציג רצפי אינדקס. טהר את מוצר ה- PCR כמתואר בשלב 16.2.</li>
	<li>רצף הספריה עם פלטפורמת רצף בתפוקה גבוהה.</li>
</ol>17. ניתוח ביואינפורמטיקה
<ol><li>בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכניות מסחריות כפי שתואר קודם לכן8.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li>
<li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3%27+Ends%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li>
<li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li>
<li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li>
<li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li>
<li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638(2011).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034(2010).</li>
<li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li>
<li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li>
<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074(2014).</li>
<li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li>
<li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090(2016).</li>
<li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li>
<li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li>
<li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li>
<li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+%28eCLIP%29+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681(2019).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

כאן אנו מציגים שיטת CLIP-seq שונה בשם FBIoCLIP-seq, ניצול של מערכת תיוג כפול FLAG-ביוטין כדי לבצע טיהור טנדם של תסביכי חלבון-RNA. מערכת התיוג הכפול FLAG-biotin הוכחה כחזקת עוצמה בזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבוןוחלבון-DNA 13,21. כאן אנו מדגימים את הייפציפיות והנוחות הגבוהות של מערכת זו בזיהוי RNAs אינטראקציה עם חלבונים. באמצעות טיהור דו-מושבי ותנאי שטיפה מחמירים, דילגנו על שלב העברת SDS-PAGE וממברנה מאתגר, כך שיותר אינטראקציות של חלבון-RNA נשמרו ולהימנע מ...

חלבונים מחייבים RNAs ו- RNA שולטים בתהליכים תאיים מגוונים, כולל שחבור, תרגום, ביוגנזה ריבוזום, ויסות אפיגנטי ומעברלגורל תאים 1,2,3,4,5,6. המנגנונים העדינים של תהליכים אלה תלויים בהסדר המרחבי והזמני הייחודי של RNAs ו-RBPs. לכן, צעד חשוב לקראת הבנת ויסות RNA ברמה המולקולרית היא לחשוף את המידע המיקום על אתרי האיגוד של RBPs.
אסטרטגיה המכונה קישור צולב וimmunoprecipitation (CLIP-seq) פותחה כדי ללכוד אינטראקציות חלבון-RNA עם קישור צולב UV ואחריו immunoprecipitation של החלבון שלעניין 7. התכונה העיקרית של המתודולוגיה היא אינדוקציה של קוולנטי cross-links בין חלבון מחייב RNA מולקולות RNA הקשורות ישירות שלה (בתוך ~ 1 Å) על ידי קרינה UV8. ניתן לקבוע את עקבות ה- RBP על-ידי קיבוץ באשכולות תגיות CLIP וקריאה לשיא, שבדרך כלל יש להם רזולוציה של 30-60 nt. לחלופין, שלב שעתוק הפוך של CLIP יכול להוביל לכופרים (הוספות או מחיקות) או החלפות לאתרים המקשרים צולב, המאפשר זיהוי של אתרי איגוד חלבונים ב- RNAs ברזולוציה של נוקלאוטיד יחיד. צינורות כמו Novoalign ו CIMS פותחו לניתוח של תוצאות רצף תפוקה גבוהה של CLIP-seq8. כמו כן הוצעו מספר שיטות שונות של CLIP-seq, כולל קישור צולב וחיבור חיסוני (iCLIP), קליפ משופר (eCLIP), irCLIP, ו-ribonucleoside-משופרת בקישור צולב ואימונו-פקטריציה (PAR-CLIP)9,10,11,12.
למרות השימוש הרחב בשיטות CLIP-seq מסורתיות בחקר RBPs, שיטות CLIP יש מספר חסרונות. ראשית, אלקטרופורזה ג'ל מייגע והליך העברת קרום עלול להוביל לאובדן מידע, ולגרום למורכבות רצף מוגבלת. שנית, שיטת CLIP מבוססת נוגדן ספציפית לחלבון עשויה למשוך את תסביך חלבון במקום חלבון יעד יחיד, אשר עלול להוביל לאינטראקציות חלבון-RNA חיוביות כוזבות מן RBPs copurified. שלישית, האסטרטגיה מבוססת נוגדנים דורשת כמות גדולה של נוגדנים באיכות גבוהה, מה שהופך את היישום של שיטות אלה לא מספיק לצורך המחקר של RBPs ללא נוגדנים באיכות גבוהה זמין. רביעית, שיטת CLIP המסורתית דורשת ATP עם תווית רדיו כדי לתייג את ה-RNAs המאוגדים בחלבון.
הזיקה הגבוהה של סטרפטאבידין לחלבונים ביוטינילציה הופכת אותו לגישה חזקה מאוד לטהר חלבונים ספציפיים או תסביכי חלבון. biotinylation יעיל של חלבונים נושאים רצף פפטיד מלאכותי על ידי חוץ חוץ ביוטין חיידקי BirA biotin ligase בתאים יונקים עושה את זה אסטרטגיה יעילה לבצע טיהור ביוטין ב vivo13. פיתחנו שיטת CLIP-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq (FLAG-ביופח בתיווך Cross-lסימון בדיו ואניmmunop recipitationואחריו רצף תפוקה גבוהה) באמצעות דגל-ביוטין תג טנדםטיהור 14 ( איור1). באמצעות טיהור דו-מושבי ותנאי שטיפה מחמירים, כמעט כל ה-RBPs אינטראקציה מוסרים(איור 2). תנאי השטיפה המחמירים מאפשרים גם לעקוף את העברת ה-SDS-PAGE והמברנה, שהיא עבודה אינטנסיבית ומאתגרת מבחינה טכנית. ובדומה ל-eCLIP ול-irCLIP, שיטת ה-FBIOCLIP-seq היא ללא איזוטופים. דילוג על הג'ל פועל ולהעביר שלבים מונע אובדן מידע, שומר על אינטראקציות אותנטיות של חלבון-RNA ללא פגע ומגביר את מורכבות הספרייה. יתר על כן, היעילות הגבוהה של מערכת התיוג עושה את זה בחירה טובה עבור RBPs ללא נוגדנים באיכות גבוהה זמין.
כאן אנו מספקים תיאור שלב אחר שלב של פרוטוקול ה-FBIOCLIP-seq עבור תאים יונקים. בקצרה, תאים מקושרים על ידי 254 נה"מ UV, ואחריו פירוק תא ו- FLAG immunoprecipitation (FLAG-IP). לאחר מכן, תסביכי החלבון-RNA מטוהרים עוד יותר על ידי לכידת זיקה ביוטין וRNAs מפוצלים על ידי עיכול חלקי עם MNase. לאחר מכן, RNA האוגד בחלבון הוא dephosphorylated ורצועה עם מקשר 3 '. מקשר RNA 5' מתווסף לאחר RNA הוא זרחן עם PNK ו- eluted על ידי עיכול K חלבונים. לאחר שעתוק הפוך, אותות RNA הקשורים לחלבון מוגברים על ידי PCR ומטוהרים על ידי טיהור ג'ל agarose. שני RBPs נבחרו כדי להדגים את התוצאהקליפ-seq FBIO. LIN28 הוא חלבון מחייב RNA מאופיין היטב מעורב התבגרות microRNA, תרגום חלבונים, ותכנות מחדש של תאים15,16,17. WDR43 הוא חלבון המכיל תחום WD40 חשב לתאם ביוגנזה ריבוזום, שעתוק אאוקריוטי, ובקרה pluripotency תאי גזעעוברי 14,18. עולה בקנה אחד עם תוצאות שדווחו בעבר עבור LIN28 עם CLIP-seq, FBIOCLIP-seq חושף אתרים מחייבים של LIN28 על "GGAG" מוטיבים microRNA מיר-let7g ו mRNAs16,19 (איור 3). WDR43 FBIOCLIP-seq זיהה גם את העדפת האיגוד של WDR43 עם 5' חיצוני מתעתק רווחים (5'-ETS) של pre-rRNAs20 (איור 4). תוצאות אלה מאמתות את האמינות של שיטת ה-FBIOCLIP-seq.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker</td><td>UVP</td><td>HL-2000 HybrilLinker</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affinity טיהור חרוזים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG חרוזים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin חרוזים</td><td>Invitrogen</td><td>112.06D</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>3 x FLAG פפטיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2)</td><td>מאגר CIP של Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>CIP</td><td>NEB</td><td>M0290S</td><td>נמצא באותה חבילה.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור ג'ל</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>אמביון</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>449172</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Porteinase K</td><td>TAKARA</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>0492S</td><td></td></tr><tr><td>טראנקריפטאז הפוך ( SupperScriptIII)</td>מגיב בידוד RNA <td>18080093</td><td></td> <td>Invitrogen</td></tr><tr><td>(Trizol)</td><td>מעכב Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>PNK buffer נמצא באותה אריזה.</td></tr><tr><td>T4 RNA ligaes</td><td>ThermoFisher</td><td>EL0021</td><td>T4 RNA ligase buffer ו-BSA נמצאים באותה חבילה.</td></tr><tr><td>T4 RNA ligase2,</td><td>מאגר</td> ליגאז NEB <td>M0242S</td><td>T4 קטום ו-50% PEG נמצאים באותה חבילה.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>208884</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>mESC תרבית בינונית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (80%)</td><td>Gibco</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>FCS (15%)</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (1%)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td></td><td></td><td>חלבון רקומביננטי מטוהר</td></tr><tr><td>NEAA (1%)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>תערובת נוקלאוזידים (1%)</td><td>Millipore</td><td>ES-008-D</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (1%)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-rna על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

חלבונים מחייבי RNA ו-RNA שולטים בתהליכים ביולוגיים מרובים. הסידור המרחבי והזמני של RNAs ו-RBPs מדגיש את הרגולציה העדינה של תהליכים אלה. אסטרטגיה הנקראת CLIP-seq (קישור צולב ו-immunoprecipitation) פותחה כדי ללכוד אינטראקציות חלבון-RNA אנדוגניים עם קישור צולב UV ואחריו immunoprecipitation. למרות השימוש הרחב בשיטת CLIP-seq קונבנציונלית במחקר RBP, שיטת CLIP מוגבלת על ידי הזמינות של נוגדנים באיכות גבוהה, מזהמים פוטנציאליים מן RBPs copurified, דרישה של מניפולציה איזוטופ, ואובדן פוטנציאלי של מידע במהלך הליך ניסיוני מייגע. כאן אנו מתארים שיטת CLIP-seq שונה הנקראת FBIoCLIP-seq באמצעות טיהור תג FLAG-ביוטין טנדם. באמצעות טיהור דו-מושבי ותנאי שטיפה מחמירים, כמעט כל החלבונים המחייבים את ה-RNA האינטראקציה מוסרים. לכן, RNAs אינטראקציה בעקיפין מתווכים על ידי RBPs אלה copurified מופחתים גם. שיטת ה-FBIoCLIP-seq שלנו מאפשרת זיהוי יעיל של RNAs מאוגדים בחלבון ישיר ללא נהלי העברת SDS-PAGE וממברנה באופן ללא איזוטופים וללא נוגדנים ספציפיים לחלבון.

הייצוג השרטוטי של הליך ה-FBIOCLIP-seq מוצג באיור 1. בהשוואה לטיהור זיקה חד-שלבי-שלבי-שלד,טיהור ה-FLAG-ביוטין הסיר כמעט את כל החלבונים הדו-תכליתיים, ומנע זיהום של אינטראקציות עקיפות של חלבון-RNA(איור 2). תוצאות מייצגות עבור FBIoCLIP-seq עבור LIN28 ו- WDR43 מתוארות באיור 3 ואיור 4. ביצענו LIN28 או WDR43 FBIoקליפ-seq עם mESCs. איור 3A מציג את ת...

כאן אנו מציגים פרוטוקול קליפ-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq עם טיהור דגל-ביוטין טנדם כדי לקבוע את מטרות RNA של חלבונים מחייבים RNA (RBPs) בתאים יונקים.

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

רק חלבונים מחייבים שולטים בתהליכים ביולוגיים מרובים. שיטת FLAG-Biotin CLIP-seq זו, ומכאן פרופיל גלובלי של הסידור המיוחד והקצבי של RNAs ו- RBPs בתאי יונקים. שיטה זו מאפשרת זיהוי יעיל של RNAs מאוגדי חלבון ישירים ללא SDS-PAGE והליכי העברת הממברנה.בהשוואה ל- CLIP-seq המסורתי הוא ללא איזוטופ והוא אינו דורש נוגדן ספציפי לחלבון. התחל על ידי ציפוי על 3 מיליון תאי STEM עובריים עכבר בצלחת 10 ס"מ ודגירה אותם בן לילה. למחרת, להסיר את המדיום עם ואקום ולטפל בתאים עם שני מיליליטר של 0.25% trypsin EDTA במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.מרווה את הטריפסין עם ארבעה מיליליטר של מדיום MESC טרי, ומעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה אותם ב 300 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. להשעות את התאים בארבעה מיליליטר של PBS קר ולהעביר אותם בחזרה לצלחת 10 ס"מ לקישור צולב.להקרין את התאים עם אור UV 254 ננומטר, ולאחר מכן להעביר את התאים המקושרים לצינור 15 מיליליטר. לסובב את התאים האלה ב 300 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להסיר את על טבעי lyse התאים עם 500 microliters של Buffer A מוכן על פי הוראות כתב היד. מעבירים את התאים לצינור 1.5 מיליליטר נטול RNAse, ומדרגים אותם בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין במשך 30 עד 60 דקות.לטפל lysate עם 30 microliters של DNAse 1 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, לעצור את התגובה על ידי הוספת ארבעה microliters של 0.5 EDTA טוחן. לסובב את גלולה מסיסים על ידי צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהעביר את supernatant לצינור חדש מקורר מראש 1.5 מיליליטר.מעבירים את התא לליזט לחרוזי FLAG מוגדרים מראש, ודגירה את המדגם בארבע מעלות צלזיוס תוך כדי סיבוב במשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את חרוזים במשך שתי דקות ב 3000 פעמים G ולהסיר את supernatant. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מאגר A לדגימה, ודגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן לסובב את חרוזים ולהסיר את על טבעי.חזור על הכביסה עם מאגר A, ואחריו שתי שטיפות עם Buffer B.To מצונן מראש - אלוט עם שלושה X FLAG-peptide, להכין את פתרון elution כמתואר בכתב היד טקסט ולסובב את קדילי דגל. הסר את העל-טבעי עם קצה צר של פיפיאט והוסף 200 מיקרוליטרים של שלושת פתרון האלוטיון של X FLAG לכל דגימה. דגירה הדגימות במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין.ואז לסובב את חרוזים במשך שתי דקות ב 3000 פעמים G. להעביר את supernate לצינור טרי ולחזור על האלוטיון פעמיים. חסוך 5% מהאלואנטים לניתוח כתמים מערביים או כתמי כסף כדי לבדוק את היעילות של immunoprecipitation של FLAG. מעבירים את האלונטים המושכים ל חרוזי סטרפטוודין מוכנים ומסובבים את הדגימות בעדינות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שלוש שעות או לילה.לאחר מכן, לאסוף את חרוזים על מעמד מגנטי ולהסיר את supernatant. לשטוף את חרוזים פעמיים עם 500 microliters של חיץ C עם סיבוב עדין במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעמיים עם 500 microliters של חיץ D, ופעמיים עם 500 microliters של חיץ PNK קר כקרח, איסוף חרוזים על מעמד מגנטי והסרת supernatant בין שטיפות.לביצוע עיכול RNA חלקי, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון MNA לכל מדגם ומערבולת ב-37 מעלות צלזיוס עם מערבל תרמי למשך 10 דקות. לאסוף את חרוזים עם מעמד מגנטי במשך 30 שניות ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, שטפו אותם עם חיץ PNK-EDTA, מאגר C ומאגר PNK בהתאם לכיווני כתב היד.לאסוף את חרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את המאגר. לאחר מכן, מוסיפים את תערובת התגובה CIP ומערבולת את חרוזים ב 37 מעלות צלזיוס עם מערבל תרמי במשך 10 דקות. לשטוף במהירות את חרוזים פעמיים עם 500 microliters של חיץ PNK EDTA קר כקרח, ואחריו שתי שטיפות עם 500 microliters של חיץ PNK קר כקרח.לאחר הכביסה, מוסיפים 40 מיקרוליטרים של שלוש רצועות קישור עיקריות לערבב את חרוזים, ומערבולת אותם ב 16 מעלות צלזיוס עם מערבל תרמי במשך שלוש שעות או לילה. קשירה יעילה של המקשר לבעלות הברית היא קריטית לניסוי זה. בדוק את צינור התגובה מדי פעם כדי לוודא כי אלה לא לזרז במהלך קשירה.לאחר הדגירה, חזרו על השטיפה עם מאגרי PNK EDTA ו- PNK, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של PNK מעורבבים לתרוזות, ומערבולת אותם ב 37 מעלות צלזיוס עם מערבל תרמי במשך 10 דקות. לשטוף את חרוזים עם מאגרי PNK EDTA ו PNK, ולאחר מכן להמשיך עם בידוד RNA כמתואר בכתב היד טקסט. בהשוואה לטיהור זיקה חד-שלבי בתיווך FLAG-Biotin או סטרפטבידין, טיהור טנדם FLAG-Biotin הסיר כמעט את כל החלבונים המטוהרים המרכזיים, תוך הימנעות מזיהום של אינטראקציות RNA עקיפות של חלבונים.LIN28 ו- WDR43, FBIO CLIP-seq בוצע באמצעות תאי STEM עובריים של העכבר. בסך הכל, כ-7.7 מיליון ו-2.2 מיליון קריאות ייחודיות אוחזרו עבור LIN28 ו-WDR43 בהתאמה. השוואה בין תצוגות הרצועה מציגה תבניות איגוד שונות בלוקוס RN45 שלפני rRNA.האתרים המקושרים במוטיב GGA G של RNA טרום-let7-g על ידי LIN28, FBIO CLIP-seq או מזוהה. כמו כן, נקבעו מוטיבים מועשרים של RNA באתרי הכריכה, ואחוז הנוקלאוטידים שעברו מוטציה בסוגים שונים של מוטציות. מראה כי LIN28 מעדיף להיקשר לנוקלאוטיד הגן.ובכן, בשעה 22: 00, פרוטוקול זה, חשוב לאשר את היעילות של immunoprecipitation כדי לוודא כי קומפלקסים חלבון בלבד טוהרו בהצלחה.

transcriptome-wide-profiling-protein-rna-interactions-cross-linking

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

תעתיקי רנ"א כפופים תקנה posttranscriptional נרחב כי הוא מתווך על ידי מספר רב של טרנס משחק RNA מחייב חלבונים (RBPs). כאן אנו מציגים שיטה להכליל לזהות במדויק בקנה מידה רחב transcriptome האתרים RNA מחייב של RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

הסידור המרחבי של חלבונים RNA מחייב על תעתיק הוא הקובע המפתח של תקנה שלאחר תעתיק. לכן, פיתחנו הפרט נוקלאוטיד UV ברזולוציה crosslinking ו immunoprecipitation (iCLIP) המאפשר מיפוי מדויק גנום רחב של אתרי הקישור של חלבון-RNA מחייב.

iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

הקמנו שיטה לטיהור של חלבונים אינטראקציה coregulatory באמצעות מערכת LC-MS / MS.

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

כאן, אנו מפרטים את השיטה של S equen של P סורלן crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH), אשר מאפשר מיפוי גנום רחב של interramolecular ו intermolecular RNA-RNA אינטראקציות in vivo . SPLASH ניתן ליישם את המחקר RNA אינטראקציות של אורגניזמים כולל שמרים, חיידקים ובני אדם.

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

פרוטוקול מפורט להחלת לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome הלכידה (CARIC) האסטרטגיה כדי לזהות חלבונים איגוד כדי שני קידוד ו noncoding RNAs מוצג.

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעשיר את אתרי ה-RNA האנדוגניים או "עקבות" של RNA: מכלולי חלבון (RNP) מתאי יונקים. גישה זו כוללת שני immunoprecipitations של RNP תת יחידות, ולכן המכונה RNA immunoprecipitation בטנדם (RIPiT).

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

הצלבה קינטית וניתוח של cDNA היא שיטה המאפשרת לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה. כאן מתואר בפירוט הפרוטוקול, כולל גידול תאי שמרים, הצלבת UV, קציר, טיהור חלבונים ושלבי הכנת ספריית הריצוף של הדור הבא.

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת במבחנה לחשיפה, כימות ואימות של אינטראקטורים חלבוניים של רצפי RNA ספציפיים, תוך שימוש בתמצית חלבון כוללת מתאים אנושיים, חרוזי סטרפטווידין המצופים ב-RNA ביוטינילציה וניתוח ספקטרומטריית מסות.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

חקור פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA בשיטת Fbio CLIP-seq בתאי יונקים. שיטה זו מאפשרת זיהוי יעיל של RNA הקשור לחלבון ללא צורך ב-SDS-PAGE וללא שימוש באיזוטופים או נוגדנים ספציפיים.

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

גלה סרטונים נוספים