Name: גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: גלו מטרות רגולטוריות של גורמי שעתוק בביופילמים חיידקיים באמצעות ChIP-seq. פרוטוקול זה מדגים טכניקות לבידוד DNA וריצוף ב-Salmonella Typhimurium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה נתמך על ידי מענק מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה (NSERC) (#2017-05737) ל-AW ודרך כיסא Jarislowsky בביוטכנולוגיה. MP היה נתמך על ידי מלגה NSERC-ליצור באמצעות תוכנית הדרכה משולבת מחלות זיהומיות, בטיחות מזון ומדיניות ציבורית (ITraP) באוניברסיטת ססקצ'ואן.
המחברים רוצים להודות לדני דייל על הצילומים והעריכה.

1. בקבוקון צמיחת תאים של התרבות
<ol><li>ממניות קפואות, רצף סלמונלה serovar Typhimurium זנים על LB אגר (20 מ"ל מדיה מוצק 100 mm לוחית פטרי) עם אנטיביוטיקה המתאים דגירה ב 37 ° צ' עבור 16 – 20 h כדי להשיג מושבות מבודדות.</li>
	<li>מחסן ליברות 5 מ ל המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה ב 25 מ"מ x 150 מ"מ בורוסיליקט התרבות שפופרת עם 1 – 3 מושבות מלוחות פס משלב 1.1. מודטה ב 37 ° c עם טלטול ב 200 סל ד עבור 7 h.</li>
	<li>מדידת OD600 של תרבות ציר באמצעות ספקטרוסקופיה. לדלל את התרבות 1 ב-PBS ב קובט 2 mL ולמדוד את ספיגת ב 600 nm. מצאנו את הגורם הקריטי ביותר בשלב זה כדי להיות זמן הצמיחה. ערכי ה-OD משמשים לנרמול התרבויות כדי לספק את מספר התאים המבוקש בשלב 1.4.</li>
	<li>הוסף 1.0 OD600 נפח המקבילה של תרבות התא (כלומר ~ 109 תאים) לבקבוקון erlenmeyer המכיל 100 mL של 1% טריטונים עם אנטיביוטיקה המתאים. דגירה ב 28 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עבור 13 h. הערה: התאים הביותוניים יופיעו כפתיתים צבורים ותאי פלנקטון בודדים נמצאים במדיה המטרים.</li>
</ol>2. איסוף ממוזג ללא מזגן 1% טריטונים
<ol><li>לאסוף תרבות בקבוקון עבור תא ממוזג 1% טריטונים. פיפטה בקבוקון תרבות מספר פעמים כדי לערבב לפני הוספת צינור צנטריפוגה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 10 ° c כדי גלולה כל התאים.</li>
	<li>Decant סופר לתוך יחידת מסנן 0.2 יקרומטר, מסנן ואקום, ומדלג לתוך צינור חדש. הערה: האגרגטים של ביוilm מיוענים בפתרונות קונבנציונליים (כגון PBS) והיא תיצמד לדפנות הצינורות ולעצות הפיפטה. כיוון שהיא מאפשרת מניפולציה קלה יותר, אנו משתמשים באמצעי תקשורת ממוזגים (1% טריטונים) כדי להעביר בתחילה את הביוilm ולהשתמש ב-PBS חם מיד לפני הקישור החוצה (שלב 4.5) כדי להסיר את כל החלבונים המקשרים מצעים שיכול להיות נוכח במדיה.</li>
</ol>3. הפרדת התאים הבין-ביותוניים לבין תרביות בקבוקון2
<ol><li>באמצעות פיפטה סטרילי של 25 מ ל, בקבוקון תרבות לצינורות של 15 מ ל. צנטריפוגה במהירות איטית (210 x g) עבור 2 דקות, כדי להפריד בין שני סוגי התא. הערה: התאים הביויומים צריכים ליצור גלולה רופפת בתחתית הצינור</li>
	<li>פיפטה את הסופרנטנט המכיל תאים פלנקטון לתוך 2 40 mL לצינורות צנטריפוגה למועד מאוחר יותר (שלב 5). להסיר את כל הנוזלים הנותרים, להיזהר לא להפריע את הגלולה. חזור על הפעולה עד שסוגי התאים הופרדו מכל המדיה התרבותית של הבקבוקון.</li>
</ol>4. הכנת אגרגטים ביוilm
הערה: ביוilm נקצרו על ידי משקל רטוב כדי להניב 25 μg של דנ א, החומר ההתחלתי המינימלי המומלץ עבור שבב. פקטור המרת ביוilm (BCF) של S. Typhimurium היא 1.73 x 108 cfu/mg2. חוקרים הכנת סוגי ביוסוגים אחרים יצטרכו להגדיר מדעית את מספר התאים לכל משקל יחידה של ביוilm, אשר משמש כדי למצוא את המשקל של ביוilm נדרש עבור 25 μg של חומר התחלת ה-DNA באמצעות משוואה זו: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60736/60736eq1.jpg">
<ol><li>שוקלים כובע הצמדה של 2 מ"ל או לברגים במדויק.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של טריטונים ממוזגים. הזז את היישום המושהה מחדש לתוך כובע הצמדה מראש של 2 מ"ל או כובע בורג.</li>
	<li>צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11 000 x g ב -20 ° c</li>
	<li>הסירו בזהירות את כל הסופרנטאנט מהצינור ושוקלים את הצינורית במדויק. הפחת את משקל הצינורית מעובי הצינורית באמצעות ביוilm כדי למצוא את המשקל של ביוilm. זה אמור להיות ± 10%. ממשקל הביו, המטרה</li>
	<li>שטוף תאים כדי להסיר את הטריטונים הממוזגים הנותרים. הוסף 1 מ ל של PBS חם לצינור מערבולת בעדינות כדי להשעות את הגלולה מחדש. צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 8 000 x g כדי ביוilm גלולה ולהסיר את הסופרנטאנט. הוסף 1 מ ל של PBS לצינור ומערבולת כדי להשעות מחדש את הגלולה.</li>
</ol>5. הכנת תאי פלאנטוניק
<ol><li>הקלטת את עוצמת הקול ואת ה-OD600 של מהירות המטוס מצנטריפוגה (שלב 3.2) באמצעות ספקטרוסקופיה</li>
	<li>חשב את אמצעי האחסון הדרוש עבור OD הסופי600 של 6.0: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60736/60736eq2.jpg">
</li>
	<li>מגניב את הצנטריפוגה ל 10 מעלות צלזיוס ותאי פלנקטון משקעים על ידי צנטריפוגה (10,000 x g, 10 דקות ב -10 ° c)</li>
	<li>הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה בנפח הסופי של PBS המחושבת בשלב 5.2.</li>
	<li>למדוד מחדש OD600 של תאים פלנקטון באמצעות ספקטרוסקופיה ולוותר על נפח של 6.0 OD600 התאים פלנקטון לתוך כובע הצמד mL או שפופרת בורג כובע.</li>
	<li>הביאו נפח ל-1 מ ל עם PBS.</li>
</ol>6. הומוגניזציה של תאים
<ol><li>הוסף אחד מעוקר 5 מילימטר מפלדת אל-חלד לכל הצינורות.</li>
	<li>הומוגון באמצעות טחנת מערבל עבור 5 דקות ב-30 Hz. שימו לב לצינורות מצטברים כדי לוודא כי ביוilm התפרק.</li>
	<li>להעביר את התאים המהומוגניים לצינור חדש 1.5 mL, הימנעות חרוז מתכת. הביאי את הכרך ל-1 מ ל עם ה-PBS. הערה: בצע דילול טורי כדי לספור תאי קלט ובדוק שמספר התאים הסופי קרוב למספר הרצוי או החזוי.</li>
</ol>7. קישור צולב של חלבונים ל-DNA
<ol><li>מוותר פורמלדהיד טרי לתוך שפופרות לדוגמה הריכוז הסופי של 1%. דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב. זהירות: פורמלדהיד הוא מאכל, עור, עין, מטרד הנשימה, דליק. . מוותר על מכסה המנוע</li>
	<li>הוסף 1 מ גליצין לריכוז הסופי של 125 מ"מ כדי להפסיק את הקישור. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב.</li>
</ol>8. שטיפת תאים כדי להסיר הצלב העודף
<ol><li>משקע את התאים ב 8,000 x g עבור 3 דקות ולהסיר את הסופרנטנט</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב 20 μL של מעכבי הפרוטאז 25x ו-500 μL של מסנן מעוקר PBS.</li>
	<li>שפופרת צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 8000 x g ולהסיר את supernatant.</li>
</ol>9. לישיר תאים
<ol><li>השהה מחדש את הגלולה ב-600 μL הליזה מאגר (להתייחס לטבלה 1) ו-דגירה על הקרח 10 דקות.</li>
	<li>הוסף 1.4 mL של מאגר דילול ה-IP (עיין בטבלה 1) לצינור שפופרת סטרילי במשך 15 מ"ל והעבר תאים למטה לצינור 15 מ"ל. שמרו את השפופרת על הקרח במשך 1.5 – 2 h, ומערבולת בעדינות ולעיתים. הערה: חלק מהחומר העמיד בתאים עשוי להישאר בצינורות. תקופת הדגירה הארוכה על הקרח והוא מזדמן לפרק את החומר. . השארית תהיה מקולקלת דרך sonication</li>
</ol>10. הגדלת ה-DNA על ידי sonication
<ol><li>מניחים את הצינור 15 מ ל בגביע של קרח ומניחים את המקדח 3 מ"מ בתוך הצינור.</li>
	<li>לבצע 5 סיבובים sonication של 30 s ב 20-40% של 400 W עם 2 דקות קירור על הקרח בין התפרצויות.</li>
	<li>חומר זירז משקעים על ידי צנטריפוגה (8000 x g, 10 דקות ב -4 ° c). . העבר את הסופרנאנט לשפופרת חדשה</li>
	<li>באופן אופציונלי, לבצע קישור decrosslinking 65 ° c עבור 30 – 60 דקות לעכל RNA ו חלבון ב 45 ° צ' עבור 30-60 דקות לפני הפעלת על 2% agarose ג'ל כדי לבדוק שברי גודל המתאים. הערה: לטבול את המקדח לתוך הליפוסט התא. שמרו על הפתרון בקרח בזמן שsonicating ונחים. אין להסיר את הצינור בזמן שsonicator בדיקה פועם. הפתרון צריך להופיע מעונן pre-sonication וברור post-sonication.</li>
</ol>11. מכלולי Immunoprecipitating DNA-חלבון-נוגדן
<ol><li>כנה<ol>
<li>מוותר על אחד 1.35 mL לimmunoprecipitation ו 1 200 μL הנורית כבקרת קלט. אחסן את בקרת הקלט ב--80 ° צ' עד לביצוע שלבי הקישור והעיכול של decrosslinking</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunoprecipitation עם נוגדן ראשוני<ol>
<li>הוסף 10 μg של נוגדן העיקרי חלבון מטוהרים ל1.35 μL aliquot. המשך הלילה ב -4 ° c על גלגל מסתובב. הערה: הנוגדן העיקרי יכול להיות נוגדן חד-שבטיים, סרום רב-שבטיים באיכות גבוהה או נוגדן מסחרי (כלומר, אנטי דגל).</li>
		<li>הוסף 50 μL של חרוזי חלבון G מגנטי לצינורות משלב 11.2.1 ו-דגירה ב 4 ° צ' עבור 3 h על גלגל מסתובב.</li>
		<li>המקום מאגר שטיפת IP 1, מאגר לשטוף IP 2, ו-TE pH 8.0 (להתייחס לטבלה 1) בדלי קרח. מאגר הימנעות חם עד 65 ° c. הערה: אין לשים פתרון המכיל מאגר הימנעות על קרח.</li>
		<li>אגד את חרוזי חלבון G מגנטי לצד צינורות באמצעות עמדה מגנטית</li>
		<li>לבצע שוטף: לשטוף 2x עם 750 μL קר מאגר שטיפת IP 1, לשטוף 1x עם 750 μL קר מאגר שטיפת IP 2, ולשטוף 2x עם 750 μL קר TE ב-pH 8.0. שמרו את הצינורות על המעמד המגנטי במהלך שטיפת.</li>
		<li>הוסף 450 μL של מאגר הימנעות IP (להפנות לטבלה 1) על כל צינור ו-דגירה ב 65 ° צ' עבור 30 דקות עם הורטקנג עדין כל 5 דקות.</li>
		<li>אגד חרוזים לצד צינורות באמצעות מעמד מגנטי. המתן 2 דקות לפחות עד שהפתרון יהיה ברור.</li>
		<li>לוותר על סופר מנוקה לצינור חדש 1.5 mL, להיות זהיר לא להפריע את הגלולה חרוז מגנטי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. מכלולי מערכות DNA-חלבונים ועיכול שיתוף-רנ א וחלבון
<ol><li>הוסף 2 μg RNase A ו-המשך הריכוז הסופי של 0.3 מ ' לכל צינור.</li>
	<li>דגירה ב 65 ° c, עבור ≥ 6 h, או לילה.</li>
	<li>השלמת עיכול החלבון על ידי הוספת 180 μg פרוטטינואז K לכל צינור, ואז הדגירה ב 45 ° צ' עבור 3 – 5 h.</li>
</ol>13. הכנה לספריות ולעריכת רצף
<ol><li>טיהור דנ א באמצעות חרוזים מגנטיים הערה: חרוזים מגנטיים הם העדיפו לבידוד כמויות קטנות של DNA התאושש בדרך כלל במהלך שבב עם תאים חיידקיים.</li>
	<li>הכן ספריות באמצעות ערכה התואמת לפלטפורמת הרצף הנבחרת.</li>
	<li>בדוק ריכוז של הספרייה עם פלואורומטר ומגוון רחב dsDNA ערכת או ערכת הקוונפיקציה של הספריה-PCR. הערה: בניסיון שלנו, מדידות פלואורומטר עשויים להיות מיותר בריכוז DNA.</li>
	<li>ספריות בריכות, חשבונאות עבור כיסוי הולם עבור כל מדגם ספריה. לרצף הארה עם סלמונלה, היינו במאגר של 10 – 12 ספריות. הוסף טריס-HCl pH 8.0 לריכוז הסופי של 1 מ"מ.</li>
	<li>רצף לפי מפרט הפלטפורמה שנבחרה.</li>
</ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).</li>
<li>MacKenzie, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistable+Expression+of+CsgD+in+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Connects+Virulence+to+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bistable Expression of CsgD in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Connects Virulence to Persistence.</a> Infection and Immunity. 83 (6), 2312-2326 (2015).</li>
<li>Grantcharova, N., Peters, V., Monteiro, C., Zakikhany, K., Römling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistable+expression+of+CsgD+in+biofilm+development+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Bistable expression of CsgD in biofilm development of Salmonella enterica serovar typhimurium.</a> Journal of Bacteriology. 192 (2), 456-466 (2010).</li>
<li>MacKenzie, K. D., Palmer, M. B., Köster, W. L., White, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+Link+between+Biofilm+Formation+and+the+Ability+of+Pathogenic+Salmonella+Strains+to+Colonize+Multiple+Host+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Examining the Link between Biofilm Formation and the Ability of Pathogenic Salmonella Strains to Colonize Multiple Host Species.</a> Frontiers in Veterinary Science. 4, 307(2017).</li>
<li>Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+biofilms%3A+an+overview+on+occurrence%2C+structure%2C+regulation+and+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Research+International%22%5BJournal%5D)">Salmonella biofilms: an overview on occurrence, structure, regulation and eradication.</a> Food Research International. 45 (2), 502-531 (2012).</li>
<li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J. B., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, Pt 10 2847-2857 (2003).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Wu, D. -Y., Bittencourt, D., Stallcup, M. R., Siegmund, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+differential+transcription+factor+binding+in+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identifying differential transcription factor binding in ChIP-seq.</a> Frontiers in Genetics. 6, 169(2015).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nature Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+protein-DNA+interactions+by+chromatin+immunoprecipitation+and+DNA+microarray+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of protein-DNA interactions by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 224, Clifton, N.J. 99-109 (2003).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+map+of+active+promoters+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A high-resolution map of active promoters in the human genome.</a> Nature. 436 (7052), 876-880 (2005).</li>
<li>Dillon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+H-NS+and+Sfh+regulatory+networks+in+Salmonella+Typhimurium+identifies+a+plasmid-encoded+transcription+silencing+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the H-NS and Sfh regulatory networks in Salmonella Typhimurium identifies a plasmid-encoded transcription silencing mechanism.</a> Molecular Microbiology. 76 (5), 1250-1265 (2010).</li>
<li>Perkins, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+transcriptome+analysis+of+the+OmpR+regulon+of+Salmonella+enterica+serovars+Typhi+and+Typhimurium+reveals+accessory+genes+implicated+in+host+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and transcriptome analysis of the OmpR regulon of Salmonella enterica serovars Typhi and Typhimurium reveals accessory genes implicated in host colonization.</a> Molecular Microbiology. 87 (3), 526-538 (2013).</li>
<li>Gu, D., Liu, H., Yang, Z., Zhang, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Immunoprecipitation+Sequencing+Technology+Reveals+Global+Regulatory+Roles+of+Low-Cell-Density+Quorum-Sensing+Regulator+AphA+in+the+Pathogen+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Technology Reveals Global Regulatory Roles of Low-Cell-Density Quorum-Sensing Regulator AphA in the Pathogen Vibrio alginolyticus.</a> Journal of Bacteriology. 198 (21), 2985-2999 (2016).</li>
<li>Peano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Escherichia+coli+%CF%83%28S%29+core+regulon+by+Chromatin+Immunoprecipitation-sequencing+%28ChIP-seq%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Escherichia coli σ(S) core regulon by Chromatin Immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) analysis.</a> Scientific Reports. 5 (1), 10469(2015).</li>
<li>Blasco, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+regulator+EspR+of+Mycobacterium+tuberculosis+is+a+nucleoid-associated+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Virulence regulator EspR of Mycobacterium tuberculosis is a nucleoid-associated protein.</a> PLoS Pathogens. 8 (3), 1002621(2012).</li>
<li>Jones, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+and+RNA-Seq+reveal+an+AmrZ-mediated+mechanism+for+cyclic+di-GMP+synthesis+and+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq and RNA-Seq reveal an AmrZ-mediated mechanism for cyclic di-GMP synthesis and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS pathogens. 10 (3), 1003984(2014).</li>
<li>Sengupta, M., Jain, V., Wilkinson, B. J., Jayaswal, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+identifies+genes+under+direct+VraSR+regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation identifies genes under direct VraSR regulation in Staphylococcus aureus.</a> Canadian Journal of Microbiology. 58 (6), 703-708 (2012).</li>
<li>Gill, A. Cross-linking chromatin immunoprecipitation (X-ChIP) protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf</a> (2017).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>MacKenzie, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+evolution+leading+to+impaired+biofilm+formation+in+invasive+Salmonella+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Parallel evolution leading to impaired biofilm formation in invasive Salmonella strains.</a> PLoS Genetics. 15 (6), 1008233(2019).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137-139 (2008).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Schoppee Bortz, P. D., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%3A+revisiting+the+efficacy+of+sample+preparation%2C+sonication%2C+quantification+of+sheared+DNA%2C+and+analysis+via+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP): revisiting the efficacy of sample preparation, sonication, quantification of sheared DNA, and analysis via PCR.</a> PloS One. 6 (10), 26015(2011).</li>
<li>Tolstorukov, M. Y., Kharchenko, P. V., Goldman, J. A., Kingston, R. E., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+H2A.Z+nucleosome+organization+in+the+human+and+yeast+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of H2A.Z nucleosome organization in the human and yeast genomes.</a> Genome Research. 19 (6), 967-977 (2009).</li>
<li>Geertz, M., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+strategies+for+studying+transcription+factor-DNA+binding+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).</li>
<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+welcome+to+the+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: welcome to the new frontier.</a> Nature Methods. 4 (8), 613-614 (2007).</li>
<li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulatory+networks+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 298 (5594), 799-804 (2002).</li>
<li>Wade, J. T., Struhl, K., Busby, S. J. W., Grainger, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+protein-DNA+interactions+in+bacteria%3A+insights+into+transcription+and+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of protein-DNA interactions in bacteria: insights into transcription and chromosome organization.</a> Molecular Microbiology. 65 (1), 21-26 (2007).</li>
<li>Myers, K. S., Park, D. M., Beauchene, N. A., Kiley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+bacterial+regulons+using+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Defining bacterial regulons using ChIP-seq.</a> Methods (San Diego, Calif). 86, 80-88 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לביצוע שבב-seq עם סלמונלה enterica serovar ביויויום ותאי פלנקטון מהתרבות הטהורה, כדי למצוא מטרות רגולטוריות של הרגולטור הראשי של ביוilm, csgd. אנו מצפים למידע כריכה משלים בשל היציבות הדו של csgd בשני סוגי התא, עם רמות גבוהות באגרגטים של ביוilm ורמות נמוכות בתאי פלנקטון2,3. עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות גם להחיל על גורמים אחרים בקטריות שעתוק, סוגי תאים, או תנאי גדילה. בפרט, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לביואמים בקטריאליים אחרים באמצעות פקטור המרה קבוע של CFU למשקל יחידה של תאי ביויוונים.
שבב-seq יכול להיות נוטה הגברה של שגיאה טכנית באמצעות רצף; עם זאת, אישור בשלבים קריטיים יכול למנוע27זה. ספציפיות נוגדן עיקרי חשוב לבחור רק את מקדם שעתוק היעד ואת ה-DNA הוא שולט במהלך immunoprecipitation7. בניסוי זה, Csgd היה התמזגו תג פלאסיים מקודד 3xFLAG בקצה 3 ' של הגן, המתאים C-הטרמינוס של csgd22. P3xFLAG פלמיד ללא csgD שימש "שליטה" (S. Typhimurium 14028 ∆ csgD + p3xFLAG). הנחיות הצפנה ממליצים ביצוע החומרים האימונוts עם הנוגדן העיקרי נגד חלבון הריבית, ו lysates של זני שבב מחיקה זנים21. חשוב להבטיח שתנאי הגדילה יהיו עקביים באמצעות שכפול כדי להפחית את השונות בכריכה של גורם שעתוק ובתוצאות רצף הזרם. אם מישהו מקפיד להבטיח את הגודל ותנאי הגדילה הטרום-מוגדרים עקביים, הגידול הביואמיל בתרבות הבקבוקון הוא עקבי4. חשוב לאשר כי כל הביו, התפרקה לאחר לקות המגון, כדי להבטיח גישה שווה של ריאגנטים, במיוחד פורמלדהיד צולבות מקשר, לכל התאים.
מספר שינויים עשויים לאפשר לחוקרים להשתמש בפרוטוקול זה עבור החלבונים אחרים המחייבים DNA, סוגי תאים, זנים, תנאי גדילה, או ציוד מעבדה. אם הוא משמש עבור מינים היוצרים של ביוונים מאשר S. Typhimurium, גורם ההמרה של המושבה להרכיב יחידות למשקל יחידה של ביוilm צריך להיות באופן קבוע הניסויים על ידי איסוף כמויות שונות של ביוilm, הומוגניזציה באופן יסודי, וביצוע מדלל סדרתי וספירת צלחות כדי ליצור עיקול רגיל, אשר עשוי לא להיות מדויק על משקולות נמוכה יותר משקל2 Sonicator העברת אנרגיה תא התנגדות סוג עשוי להיות שונה; לפיכך, sonication מומלץ למצוא את מספר ההתפרצויות הsonication שיפיקו את טווח גודל הקטע הנדרש עבור הכנת הספרייה ורצף11של המטה. פיצול כרומטין על ידי מmicrococcal נוקלאז היא חלופה sonication המייצרת ברזולוציה גבוהה של אתרי תפוסת; עם זאת, שיטה זו עשויה להציג פיצולהטיה 7,28. את טווח גודל ה-DNA ניתן לשנות בהתאם ערכות הכנה ספריית במטה ופלטפורמות רצף. ניתן להשתמש בשיטות אחרות של הומוגון במקום טחנת המיקסר. לדוגמה, הומוגניצר רקמת זכוכית עשוי להיות מוחלף, אבל זה עשוי ניקה או באופן מוחלט לשבור את הבייוilm. במונחים של שולטת, pre-immunoprecipitate DNA ניתן לנרמל בעיבוד לאחר רצפי וניתוח. בקרת מדמה-IP עם מינים התואמים סרום רגיל יכול לשמש כפקד כמו גם13.
החוקרים חייבים לשקול את המגבלות על שיטה זו כאשר בהתחשב ניסוי שבב-seq. ייתכן שיהיה צורך בשינויים משמעותיים כדי להתאים אותו לסוגי ביוונים אחרים. לדוגמה, עם סלמונלה typhimurium מיידית השעיית מחדש של ביוilm ב-PBS מוביל לאובדן מדיד של אגרגטים ביוilm. Immunoprecipitation פילוח מטרות רגולטוריות של גורמי שעתוק בחיידקים עלול לגרום כמויות קטנות מאוד של דנ א, אשר הוא אתגר לטיהור ואיתור בשלבים מאוחרים יותר. הטיה ניתן להציג במהלך הטיה מניפולציה במורד במהלך זיהוי הספרייה9. בנוסף, שיטה זו אינה חושפת ברמות ביטויים vivo בתגובה לכריכה של גורם שעתוק. חוקרים בעלי ניסיון מועט בביואינפורמטיקה עשויים להיות מאותגרים על-ידי צינור הניתוח. שיטה זו עשויה להיות אינטנסיבית ויקרה בזמן; עם זאת, עלות הרצף נמוכה לעתים קרובות ממיקרו-מערך והיא יורדת לאורך זמן כאשר השיפורים הטכנולוגיים ממשיכים להתבצע.
כמה שיטות בספרות לתאר שבב עם חיידקים, והניסויים החיידקיים ביותר להתחיל במצב גדילה פשוטה13,14,15,17,18. ההכנה לדגימת שבב עם תאים בודדים היא פשוטה ומציגה פחות אתגרים מאשר הכנה לדגימת שבב עם אגרגטים של ביוilm. באשר שבב-seq, השיטות הקודמות של לימוד המעגלים cis-רגולציה, כולל האבולוציה שיטתית של ליגניות על ידי העשרה מעריכית (SELEX), הניידות electrophoretic משמרת (EMSA), שבב שבב, מחיקה מקדם וניתוח עיתונאי השלימה או הוחלף על ידי שבב-seq29. שבב-seq הוא החלפת שבב שבב בשל התקדמות טכנולוגיות וזמינות של רצף. רצף עמוק מספק לחוקרים כמויות אדירות של נתונים שיכולים לזהות אתרים בעלי זיקה מחייבת נמוכה יותר ורזולוציה של זוג בסיסי גבוה יותר עם חומר התחלתי פחות מאשר שבב-שבב11,30. ניתוח של נתוני שבב מתוך אורגניזמים עם התייחסות באיכות גבוהה גנום הוא בדרך כלל מהיר וספציפי. בנוסף, ChIP-seq היא שיטה יסודית לגילוי באתרי הכריכה החזויים שאינם כבושים בכל סוגי התאים, בשלב הגדילה, או בתנאי הסביבה31.
בעתיד, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להקל על הבנה של פתוגנזה בקטריאלי, במיוחד אורגניזמים היוצרים. אימוץ נרחב של טכניקה זו וזמינות של מערכות נתונים חדשות יכולות להוביל לאינטגרציית נתונים כדי לזהות קבוצות של חלבונים הניתנים לשימוש בשיתוף פעולה לשליטה בתהליכים סלולריים במיקרואורגניזמים היוצרים מיקרואורגניזמים32. בנוסף, שבב-seq ו-RNA-seq נתונים ניתן לשלב כדי לבנות מערכת הרגולציה דגמי33.

ביואמים חיידקיים, אגרגטים מבניים של תאים המוטבעים במטריצה מיוצרת עצמית, עמידים בפני התייבשות, אנטיביוטיקה ותגובות החיסון המארחות1. ככאלה, הם גורמים לזיהומים מתמידים וכרוניים ומציגים אתגרים ייחודיים לחוקרים בשל הפתרונות שלהם להישרדות ושידור. סלמונלה בידור שירומויום (S. Typhimurium) נמצא להקים אוכלוסיות הטרוגנית בדרך כלל של אגרגטים ביוארגור העמידים בפני התייבשות ואנטיביוטיקה, ותאי פלנקטון אשר מבטאים גורמים התקפה אלימה בתרבות טהורה כאשר נחשפים לחץ סביבתי (28 ° צ', הגבלת חומרים מזינים)2. שני סוגי תאים אלה נובעים בשל ביטוי bistable של הרגולטור הראשי של הביוilm, CsgD3. יש לנו שיערו כי זה יכול להיות אסטרטגיה מגידור ההימור עבור סלמונלה, כאשר התאים פלנקטון להשתתף שידור לטווח קצר ותאי ביוilm מסוגלים להתמיד לטווח ארוך בסביבה עד הזדמנות להדביק מארח חדש נובע2,4. רבים מרכיבי הרגולציה השולטים בביטוי csg אופרון מאופיינים היטב5. עם זאת, מלבד adra ו csg אופרון6, מטרות רגולטוריות מעטים של csg ידועים. זיהוי הרשת התקינה CsgD יעזור לנו להבין טוב יותר את מחזור החיים של סלמונלה ואת התפקיד כי ביוילאמים לשחק בשידור.
כרומטין immunoprecipitation ואחריו ברצף התפוקה הגבוהה (שבב-seq) היא חזקה בטכניקה vivo עבור זיהוי הגנום-כולל של אינטראקציות חלבון-DNA ומספק מידע על תהליכים הרגולציה מעורבים גורמי שעתוק, שינויים היסטון, או נוקלאוטיזומים7. מחקרים חדשים יותר השתמשו בטכניקה זו כדי להעריך את כריכת החלבון הדיפרנציאלי בין תנאי גדילה וסוגי תאים8. ב כרומטין immunoprecipitation (שבב), שברי דנ א עם חלבונים אינטראקציה מועשר באמצעות נוגדנים מבחר של חלבונים היעד. תאים הם קוצרים ו-DNA מחייב חלבונים הם מקושרים ל-DNA ב vivo דרך פורמלדהיד חוצה מקשר הטיפול. תאים הם מוקפצים, שחרור תוכן התאים, ו כרומטין הוא השזרמו כ 200 – 600 שברי bp7. שברי דנ א כרוך חלבון היעד הם immunoprecipitated באמצעות נוגדן, ומבודד על ידי דה-crosslinking קישור ואחריו עיכול החלבון9. שברי ה-DNA הללו מייצגים אתרי כריכת חלבון בהתאמה הכלאה למיקרומערך (שבב שבב) או על ידי רצף עמוק ומיפוי לרצף הגנום10,11. למרות הניסויים שבב צ'יפ להניב נתונים רגולציה נאותה, הם מוגבלים בשל השימוש בבדיקות יקרות, כמו גם היברידיזציה הטיה מערך12. שבב-seq יש טווח דינמי גדול יותר עם רזולוציה מוגברת נוקלאוטיד וכיסוי, יחס אות לרעש משופר, ופחות פריטים בהשוואה שבב שבב7.
שבב שימש לניתוח ה-sfh ו-ompr ב סלמונלה serovar typhimurium13,14, ויסות החישה של apha ב- vibrio alginolyפטיקוס15, תקנה rpos בתוך eschia coli16, התקפה אלימה הרגולטור ברגולציה ב- פטרת השחפתdiguanylate, פוטנציאל של בקרת amrz באמצעות התקנה של הפסאודומונס aeruginosa18, כמוגם vrasr . בסדר. הניסויים החיידקיים שבב-seq שתוארו להתחיל עם הגדלת תאים במדיה נוזלי וקצירת בצורת תא בודד. עם זאת, ניתוח של ביואילאמים ותקנות הגנים המתאימים מייצג קבוצה חדשה של אתגרים כדי ליצור פרוטוקול שבב-seq מוצלח. בפרוטוקול זה, שבב-seq משמש כדי למצוא מטרות הרגולציה הדיפרנציאלי של CsgD, S. הרגולטור הראשי של היומוופריום. בתוך ביוilm ובסוגי תאי הפלאנטוניק פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות כדי לקבוע את הכמויות המתאימות של הביו-משתמשים עבור שבב-seq, ביוכי הקציר מתרבות הבקבוקון, לנרמל את השימוש בדגימות ובקרת תאים בודדים, המגון ביוilm והשלמת immunoprecipitation. זה יהיה שימושי עבור לימוד מטרות הרגולציה של ביויואמים חיידקיים ניתן להתאים עבור מינים רבים.

<table><tbody><tr><td>אבקת אגרוז</td><td>FroggaBio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>איזון (אקספלורר פרו)</td><td>Ohaus</td><td>EP214</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה ספסלית (8510R)</td><td>Eppendorf</td><td>022627023</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>BR dsDNA ערכת ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>ChIP-Grade חלבון G חרוזים מגנטיים</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>9006</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, מעכב פרוטאז ללא EDTA קוקטייל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>COEDTAF-RO ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 15 מ"ל</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-500</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 50 מ"ל</td><td>FroggaBio</td><td>TB50-500</td><td></td></tr><tr><td>DC ערכת בדיקת חלבון II</td><td>BioRad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>קובטה חד פעמית, 1.5 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>ציוד אלקטרופורזה (מיני-PROTEAN)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגת רצפה (Sorvall Evolution RC)</td>פלואורומטר <td>728211</td><td></td> <td>תרמו סיינטיפיק</td></tr><tr><td>(קיוביט 3.0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>GelRed&reg; כתם ג'ל חומצת גרעין 10 000x במים</td><td>ביוטיום</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>ערכת DNA ברגישות גבוהה</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור (טלטול</td>)<td>VWR</td><td>1570-ZZMFG</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור (רעידת אמבט מים)</td><td>ניו ברונסוויק</td><td>G76D</td><td></td></tr><tr><td>LB מדיה</td><td>VWR</td><td>90000-808</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי (DynaMag)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה (מקוררת)</td><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>, 1.5 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ריאגנטים MiSeq v3 (150 מחזורים)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>טחנת מיקסר</td><td>Retsch</td><td>MM400</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 115 מ"ל יחידות סינון, סטריליות, 0.2 ומיקרו; m גודל נקבוביות</td><td>Thermo Scientific</td><td>73520-980</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext ערכת הכנה לספריית Ultra DNA עבור Illumina</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NGS ניקוי וגודל בחר חרוזים מגנטיים</td><td>Machery-Nagel</td><td>744970.5</td><td></td></tr><tr><td>סרום עכבר רגיל</td><td>AbCam</td><td>ab188776</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי עם מכסה שקוף (100 מ"מ x 15 מ"מ)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>בקר פיפטה</td><td>FroggaBio</td><td>MP001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2542</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-FLAG נוגדן פוליקלונלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>RNase A (10 מ"ג/מ"ל; ללא DNase ופרוטאז)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>גלגל מסתובב</td><td>טכנולוגיות קריסטל & תעשיות</td><td>TR 01A</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נעילה בטוחה (2.0 מ"ל, חסרי צבע)</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 25 מ"ל</td><td>FroggaBio</td><td>94024</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>מונטריאול ביוטק בע"מ</td><td>Libra S22</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי נירוסטה, 5 מ"מ</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטיפ מחודד 1/8 אינץ' (3 מ"מ) בדיקת סוניקטור</td><td>Sonics & חומרים, בע"מ</td><td>630-0418</td><td></td></tr><tr><td>מדיה טריפטון</td><td>VWR</td><td>90000-286</td><td></td></tr><tr><td>מעבד נוזלי אולטרסאונד (סוניקטור)</td><td>סוניקה & חומרים, בע"מ</td>ציוד ואקום <td>VC300</td><td></td></tr><tr><td>(ואקופוגה פלוס)</td><td>Eppendorf</td><td>022820001</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים 1 (אמבט מים בקו מעבדה)</td><td>Thermo Scientific</td><td>18000-1</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים 2 (דיוק)</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221044</td><td></td></tr></tbody></table>

גילוי מטרות רגולטוריות של csgd באמצעות כרומטין immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

כרומטין immunoprecipitation ואחריו ברצף (שבב-seq) היא טכניקה שניתן להשתמש בה כדי לגלות את המטרות הרגולטוריות של גורמי שעתוק, שינויים היסטון, ו-DNA אחרים הקשורים חלבונים. נתוני שבב-seq יכולים לשמש גם כדי למצוא כריכה דיפרנציאלית של שעתוק גורמים בתנאים סביבתיים שונים או סוגי תאים. בתחילה, שבב בוצע באמצעות היברידיזציה על מיקרוarray (שבב צ'יפ); עם זאת, שבב-seq הפך את השיטה המועדפת באמצעות פיתוחים טכנולוגיים, הפחתת מחסומים פיננסיים לרצף, וכמויות מסיבית של פלט נתונים באיכות גבוהה. טכניקות של ביצוע שבב-seq עם ביויואמים חיידקיים, מקור מרכזי של זיהומים מתמידים וכרוניים, מתוארים בפרוטוקול זה. שבב-seq מבוצע על סלמונלה בידור serovar ביוהיריום ותאי פלנקטון, מיקוד הרגולטור הראשי ביוilm, csgd, כדי לקבוע את הכריכה הדיפרנציאלית בשני סוגי התא. כאן, אנו מדגימים את הכמות המתאימה של הביו-היקף לקציר, נורמליזציה למדגם בקרת פלנקטון, הומוגניזציה עבור גישה חוצת-מקשר, וביצוע צעדים שגרתיים של שבב-seq כדי להשיג תוצאות באיכות גבוהה ברצף.

כרומטין immunoprecipitation בשילוב עם רצף הדור הבא (שבב-seq) היא שיטה המשמשת ליצירת אינטראקציות בין גורמי שעתוק ואת רצפי גנומי הם שולטים. פרוטוקול זה מתאר טכניקות עבור ביצוע שבב-seq עם ביומאמים חיידקיים, באמצעות סלמונלה בידור החיידק Typhimurium בקטריות כדוגמה.

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Chromatin immunoprecipitation ואחריו רצף, או ChIP-seq, היא טכניקה שניתן להשתמש בה כדי לגלות את המטרות הרגולטוריות של גורמי שעתוק, שינויים histone, וחלבונים אחרים הקשורים ל- DNA. ב- ChIP-seq, תאים נקצרים וחלבון מחייב DNA. מקושר לדנ"א בוויו עם פורמלדהיד.תאים הם lysed, שחרור תוכן התא כרומטין הוא ניתב לרסיסים של פחות מ 1000 זוגות בסיס, בדרך כלל בין 200 ו 600 זוגות בסיס. DNA, אינטראקציה עם חלבון היעד, הוא immunoprecipitated באמצעות נוגדנים מבודד על ידי דה crosslinking. הצלבות חלבון DNA הפוכות ו- RNA וחלבון מתעכלים.הדנ"א מטוהר, הופך לספריות, ורצף. ניתן להשתמש בנתונים של ChIP-seq גם כדי למצוא איגוד דיפרנציאלי של גורמי שעתוק בתנאים סביבתיים שונים או בסוגי תאים שונים. בתחילה, ChIP בוצע באמצעות הכלאה על microarray.עם זאת, רצף ChIP הפך לשיטה המועדפת בשל ההתקדמות הטכנולוגית, הפחתת חסמים פיננסיים לתהפוכות ותפוקת נתונים מסיבית באיכות גבוהה. בפרוטוקול זה, נדגים טכניקות של ביצוע ChIP-seq עם ביופילמים חיידקיים, מקור עיקרי של זיהומים מתמשכים וכרוניים. ChIP-seq תבוצע על ביופילם טיפימוריום סלמונלה ותאים פלנקטוניים, מיקוד הרגולטור הביופילם הראשי, CSGD, כדי לקבוע כריכה דיפרנציאלית בשני סוגי התאים.בסרטון זה, נדגים טכניקות של קביעת הכמות המתאימה של ביופילם לקציר, נרמול לדגימה בקרה פלנקטונית, הומוגניזציה של ביופילם לגישה לצלב וביצוע שלבי ChIP-seq שגרתיים כדי להשיג תוצאות רצף באיכות גבוהה. צלחת פס סלמונלה enterica לשרת טיפימוריום שלנו על צלחת אגר LB לבודד מושבות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לחסן חמישה מרק LB mL עם אחד עד שלוש מושבות מצלחת פס דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד במשך שבע שעות או לרשום צמיחה.מצא את הצפיפות האופטית של תרבות הבקבוק ב 600 ננומטר, באמצעות ספקטרופוטומטר ולהוסיף OD אחד 600 שווה ערך של תאים או 10 לתשעה תאים לבקבוק Erlenmeyer המכיל 100 מיליליטר של אחד אחוז טריפטון. דגירה ב 28 מעלות צלזיוס עם רעידות במשך 13 שעות. תאי ביופילם מופיעים כפתיתים מצטברים ותאים פלנקטוניים בודדים נמצאים במדיה המעוננת.ביופילם עמידים מאוד ונצמדים לצדדים של צינורות וטיפים פיפטה. אנו משתמשים במדיה מותנה כדי להזיז ביופילם בתחילה ולהשתמש PBS חם מיד לפני crosslinking כדי להסיר חלבון crosslinking מצעים בתקשורת. ייתכן שהחוקרים יצטרכו למצוא פתרון מתאים כדי להשעות מחדש את הביופילם.לאסוף את תרבות הבקבוק בצינור צנטריפוגה צנטריפוגה ב 12, 000 G במשך 10 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. דקאנטנט לתוך יחידת סינון 0.2 מיקרומטר ומסנן ואקום. תרבות בקבוקון Aliquot לתוך צינורות צנטריפוגה במהירות איטית להפריד בין שני סוגי התאים.תאי ביופילם נמצאים גלולה בחלק התחתון של הצינור ותאים בודדים הם על טבעי מעונן. פיפטה העל-טבעי המכיל תאים פלנקטוניים לתוך צינור צנטריפוגה לאחר כך. 25 מיקרוגרם של דנ"א מומלץ כקלט לניסויי ChIP-seq.במקרה שלנו, 30 מיליגרם של ביופילם מניבים כ-25 מיקרוגרם דנ"א. מאז אגרגטים biofilm יש שפע של חומר חוץ תאי חלבוני, הוא מתחרה על crosslinker עלול לגרום מוצר מקושרים לא שווים שהוצגו עבור immunoprecipitation. הצעת אסאי חלבונים לקביעת חומר תאים שווה ערך לפי ריכוז חלבונים מוצעת.במקרה זה, שישה תאים פלנקטוניים OD 600 נקצרים כפקד עבור 30 מיליגרם של ביופילם. ביופילם נקצר על ידי משקל רטוב ואת המושבה יחידות חקלאות של ביופילם ניתן למצוא באמצעות גורם ההמרה המוצג. החוקרים מעודדים למצוא את גורם ההמרה של המין יוצר ביופילם הם עובדים עם על ידי הומוגניזציה ודילול טיפה.להשעות מחדש את גלולת biofilm במיליליטר אחד של טריפטון מותנה ולעבור לתוך כובע הצמדה שני מיליליטר שקל מראש או צינור כובע בורג. צנטריפוגה לדקה אחת ב 11, 000 G. להסיר את העל טבעי מהצינור ולשקול את הצינור במדויק. הפחת את משקל הצינור ממשקל הצינור עם ביופילם כדי למצוא את המשקל של אגרגטים.זה צריך להיות בטווח של 10% ממשקל הביופילם של המטרה. הוסף מיליליטר אחד של PBS ומערבולת כדי להשעות מחדש אגרגטים ביופילם. מחלקים את העל-טבעי מצנטריפוגה במהירות איטית לצינורות צנטריפוגה.למדוד את הצפיפות האופטית של התאים פלנקטוניים ב 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר ולחשב את הנפח הנדרש עבור OD הסופי 600 של שישה. מצננים את הצנטריפוגה של פלורה ל-10 מעלות ומורידים את התאים הפלנקטוניים בעזרת הצנטריפוגה של פלורה. צנטריפוגה ב 10, 000 G במשך 10 דקות ב 10 מעלות צלזיוס.הסר את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת הכדור ב- PBS. Remeasure OD 600 של התאים פלנקטוני באמצעות ספקטרופוטומטר ולחלק את הנפח של שישה OD 600 תאים פלנקטוניים לתוך כובע הצמד שני מיליליטר או צינור כובע בורג. יש לפרק צבירות ביופילם כדי לאפשר ל-crosslinker לגשת לתאים.תאים פלנקטוניים מטופלים באותו אופן כמו תאי ביופילם כדי להפחית משתנים. שימוש חרוזים מתכת במפעל מערבל עשוי להיות יעיל יותר עבור פירוק ביופילם מאשר homogenizers רקמת זכוכית. באופן בלתי מתאים, מוסיפים חרוז מתכת מעקר אחד לכל אחד מהצינורות.הומוגניזציה באמצעות טחנת מיקסר במשך חמש דקות ב30 הרץ. שים לב צינורות צבירה כדי לאשר כי הביופילם נשבר לגזרים לפני העברת תאים הומוגניים לצינור חדש 1.5 מיליליטר, הימנעות חרוז מתכת. הבא את עוצמת הקול למיליליטר אחד עם PBS.בשלב זה, זה אופציונלי לבצע דילול טיפה כדי למנות תאי קלט. לוותר פורמלדהיד טרי לתוך צינורות מדגם לריכוז סופי של אחוז אחד. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב.מוסיפים גליצין לריכוז סופי של 125 מילימולרים כדי לרוות את הקישור הצולב ואת הדגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב. כדי לשטוף את התאים ולהסיר crosslinker עודף, צנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 8, 000 G ולהסיר את supernatant. להשעות מחדש את גלולה מעכבי פרוטאז ו 500 microliters של PBS מעוקר מסנן.להשעות מחדש את גלולה ב 600 microliters של חיץ תזה דגירה על קרח במשך 10 דקות. העבר את ה- lysate החלקי לצינור חדש המכיל 1.4 מיליליטר של מאגר דילול IP. שמור על קרח במשך שעה וחצי עד שעתיים ומערבולת מדי פעם.חומר עמיד כלשהו עשוי להישאר בצינורות. עם זאת, תקופת דגירה ארוכה ומערבולת מזדמנת יתפרקו חומר מצטבר והשאר יישבר במהלך sonication. כוונן את הקוליטור.מניחים את הצינור 15 מיליליטר בפקעת קרח וממקם את החללית בתוך הצינור. דופק ב 20 עד 40 אחוזים במשך חמישה פרצי sonication של 30 שניות וקריר בין סיבובי sonication. ליסוס התא ייראה מעונן לפני sonication ו ייראה ברור לאחר sonication.כדי להסיר חומר זירז, צנטריפוגה ב 8, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות ולחלק את supernatant לתוך צינור חדש, הימנעות גלולה שחורה. העברת אנרגיה Sonicator ועמידות לסוג התא עשויים להיות שונים ולכן אסיעת sonication מומלץ למצוא את מספר סיבובי sonication כי יפיק את טווח גודל שבר הנדרש להכנת ספרייה במורד הזרם רצף. מחלקים דנ"א קולי ל-1.35 מיליליטר לאליקוט אחד לכשל חיסוני ו-200 מיקרוליטר כדנ"א קלט.שמור על בקרת הקלט במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוק הצלבות וצעדי עיכול. לאחר בדיקת הנוגדנים כדי להבטיח את הספציפיות שלהם לחלבון היעד, מוסיפים את הנוגדן לצינורות immunoprecipitation ודגירה בארבע מעלות צלזיוס לילה על גלגל מסתובב. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של חלבון G חרוזים מגנטיים דגירה בארבע מעלות צלזיוס על גלגל מסתובב במשך שלוש שעות.לקשור את חרוזים לצדדים של צינורות באמצעות מעמד מגנטי ולבצע שטיפות. לשטוף פעמיים עם 750 microliters של מאגר שטיפת IP קר אחד. לשטוף אחד עם 750 microliters של מאגר שטיפת IP קר 2.ולשטוף פעמיים עם 750 microliters של TE קר ב pH שמונה. שמור את הצינורות על הדוכן המגנטי במהלך הכביסה. הוסיפו 450 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון IP לכל צינור ודגירה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם מערבולות עדינות כל חמש דקות.לקשור את חרוזים לצדדים של צינורות באמצעות מעמד מגנטי. המתן לפחות שתי דקות עד שהפתרון יתפנה ולאחר מכן לוותר על הפתרון פינה צינור חדש 1.5 מיליליטר. כדי להפוך crosslinks ולעכל RNA, להוסיף שני מיקרוגרם של RNase שמונה ולהוסיף נתרן כלורי לריכוז הסופי של 0.3 טוחן בכל צינור.דגירה ב 65 מעלות צלזיוס במשך יותר משש שעות או לילה. לעיכול חלבון, יש להוסיף 180 מיקרוגרם חלבון K לכל צינור ותצנרר ב-45 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש שעות. לטהר את ה-DNA.חרוזים מגנטיים עדיפים על בידוד כמויות קטנות של DNA התאושש במהלך ChIP עם תאים חיידקיים. עם זאת, החילוץ מבוסס עמודה או phenylchloroform עשוי לשחזר כראוי DNA ChIP. לאחר הטיהור, ספריות מוכנות מדנ"א מטוהר של ChIP באמצעות ערכה התואמת לפלטפורמת הרצף שנבחרה.ספריות DNA של ChIP דורשות לעתים קרובות להוסיף את הכמות המינימלית של מתאמים ולבצע את המספר המרבי של מחזורי הגברה של PCR. בדוק את גודל הספרייה על ידי bioanalyzer ולבדוק את ריכוז הספרייה עם cubit או ערכת כימות ספריית QPCR. אסוף את הספריות והמשך ברצף בהתאם למפרט הפלטפורמה שנבחרה.ניתוח נתוני ChIP-seq דורש ניקוד איכות הבסיס, קיצוץ בסיסים באיכות נמוכה, יישור הרכבה קורא לגנום התייחסות, קורא פסגות, שיוך פסגות עם גנים, וניתוח מוטיבים מחייבים מיוצגים יתר על המידה. נתוני ChIP-seq בדרך כלל יש רמה נמוכה של רקע. דנ"א הנשלט על ידי החלבון הממוקד על ידי immunoprecipitation יועשר ויופיע כפסגות שנמצאות לפחות פי שניים מעל הרקע.בסרטון זה תיארנו שיטות לביצוע ChIP-seq על ביופילם סלמונלה ותאים פלנקטוניים בודדים המניב פסגות של דנ"א מועשר בגנים הנשלטים על ידי גורם התמלול של עניין. רוב החיים החיידקיים בטבע נחשב קיים ביופילמים עד 40% של מחלות אנושיות נחשבים ביופילם הקשורים. אז יש להם השפעות רפואיות וכלכליות עצומות.עם זאת, biofilm הוא עמיד וקשה יותר למנות, לשבור פתוח, ולתפעל. חוקרים יכולים להשתמש בטכניקות ChIP-seq שתיארנו כדי לקצור כמות מתאימה של ביופילם, הומוגניזציה של הביופילם, תאי lyse, sonicate, לבצע immunoprecipitation, לטהר ורצף DNA ממין חיידקי יוצר ביופילם אחרים.

discovering-csgd-regulatory-targets-salmonella-biofilm-using

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

מאמר וידאו זה מתאר שיטת microarray מבוסס במבחנה כדי לקבוע את מטרות הגן ואתרי קישור לשני רגולטורים תגובת מערכת רכיב.

שיטת צ&#39;יפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

מאמר זה מתאר את assay התפוקה גבוהה כי כבר נקבע בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות קטנות עבור היכולת הפוטנציאלית שלהם לתפעל רמות סלולריות של di-GMP המחזורי Pseudomonas aeruginosa, מתן כלי רב עצמה חדש לגילוי סמים אנטיבקטריאלי ובדיקה מתחמת.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכין דגימות דנ א מזון, סביבתית microbiomes זיהוי מתואמת, subtyping של חיידקי סלמונלה דרך רצף quasimetagenomic. שימוש משולב של העשרת תרבות, immunomagnetic ההפרדה (IMS) ועקירה מרובים הגברה (מד א) מאפשרת ריכוז אפקטיבי של DNA גנומי סלמונלה מזון ודוגמאות סביבתיים.

ניתוח קוואזי-metagenomic של סלמונלה מזון, סביבתית דגימות

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג מוטציות ספציפיות חומצה deoxyribonucleic (DNA). פרוטוקול זה מתאר איך לעשות מוטגנזה בצעד 2, 3-צעד תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) המבוסס על הגישה, אשר חלים על כל מקטע DNA עניין.

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

פרוטוקול זה מתאר שיטה ניסיונית וזרימת עבודה של ניתוח נתונים עבור ביקוע תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&amp;RUN) בפתוגן הפטרייתי האנושי קנדידה אלביקנס.

פרופיל כלל-גנומי של אינטראקציות קשירה בין גורמי שעתוק לדנ"א בקנדידה אלביקנס: שיטת CUT&amp;RUN מקיפה וזרימת עבודה של ניתוח נתונים

מאמר זה מספק פרוטוקול פשוט וברור לסימון אפקטורים המופרשים בסלמונלה באמצעות אתר הרחבת קוד גנטי (GCE) ספציפי ותמונה של לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM)...

הדמיה ברזולוציית על של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים באמצעות הרחבת קוד גנטי

ההיתכנות של אסטרטגיות ריצוף גנום שלם (WGS) באמצעות מכשירי benchtop פישטה את חקירת הגנום של כל מיקרוב בעל רלוונטיות לבריאות הציבור בסביבה מעבדתית. מתוארת התאמה מתודולוגית של זרימת העבודה עבור WGS חיידקי ומוצג גם צינור ביואינפורמטיקה לניתוח.

אפיון זן Escherichia coli פתוגני שמקורו באוראוכרומיס spp. חוות המשתמשות בריצוף גנום שלם

גלו מטרות רגולטוריות של גורמי שעתוק בביופילמים חיידקיים באמצעות ChIP-seq. פרוטוקול זה מדגים טכניקות לבידוד DNA וריצוף ב-Salmonella Typhimurium.

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

גלה סרטונים נוספים