הדמיה, קוונפיקציה, ומיפוי של אוכלוסיות תאים החיסונית במיקרו סביבה הגידול
25 במרץ 2020
כאן, אנו מתארים אסטרטגיה פשוטה ונגישה להמחיש, לכמת, ומיפוי תאים חיסוניים ב-formalin-קבוע פרפין מוטבע רקמת הגידול סעיפים. מתודולוגיה זו משלבת הדמיה קיימת טכניקות ניתוח דיגיטלי עם המטרה של הרחבת יכולת ריבוב וניתוח רב פרמטרים של הדמיה מספר.
לארגון המרחבי של תאי החיסון במיקרו-וירוס הגידולי יש ערך קליני. אסטרטגיה זו יכולה לשמש בקלות להדמיה, כימות ומיפוי של תאי מערכת החיסון בתוך רקמת הגידול. האימונותרפיה חוללה מהפכה בטיפול בסרטן.
עם זאת, לא כל החולים מגיבים היטב. אסטרטגיה זו עשויה לשמש להגדרת החתימות החסינות-רקמות שיכולות לחזות תגובה טובה נגד גידולים. לפני ביצוע ניסוי, לבדוק את שילובי הנוגדנים וטכניקות הפשטה על רקמות שליטה ולוודא כי APPs מדויקים בזיהוי שלהם סמנים של עניין.
כמו תיאורים כתובים של שיטות ניתוח תמונה להשתמש בשפה טכנית מתוחכמת, שילוב טקסט עם וידאו מקל על הבנה טובה יותר ושכפול של המתודולוגיה. לאחזור אנטיגן של סעיפי רקמת גידול קבועים פורמלין, פרפין מוטבע, לטבול את דגימת רקמה dewaxed בצנצנת קופלין של פתרון אחזור אנטיגן ולמקם את הצנצנת לתוך סיר לחץ חשמלי המכיל מי ברז. מפלס המים לא יעלה על מחצית מגובה הצנצנת, כך שהמים לא יתערבבו עם פתרון אחזור האנטיגן.
סגור את המכסה ואת שסתום הלחץ על הבישול ולטפל שקופיות בלחץ גבוה במשך 10 דקות. בסוף הטיפול, לנתק את הבישול, לשחרר את הלחץ, ולפתוח את המכסה. לאחר השקופיות התקררו בתיר במשך 30 דקות, לשטוף את הדגימות פעמיים במשך חמש דקות PBS טריים לכל לשטוף בצנצנת קופלין חדשה, ולאחר מכן להשתמש בעט הידרופובי לצייר מחסום סביב כל קטע רקמה.
לאחר מכן, לטבול את השקופיות 0.1-טוחן גליצין ב PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני שטיפה שקופיות פעמיים PBS כפי שהודגם. לאחר הכביסה השנייה, מעבירים את המגלשות לתא לחות ומכסים כל קטע רקמה בתתא חסימה. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, יש לשטוף את החלקים פעמיים במשך חמש דקות ב- PBS-Tween טריים לכל שטיפה ולאחר מכן להוסיף את הנוגדנים העיקריים של עניין, מדולל בתת פתרון חסימה, לכל שקופית, מוגן מפני אור.
בסוף הדגירה, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS-Tween טרי במשך חמש דקות לכל לשטוף, ולאחר מכן לתייג את החלקים עם נוגדנים משניים המתאימים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS טרי-Tween במשך חמש דקות לכל לשטוף. בצע עם שטיפה אחת במים מזוקקים כפולים.
הסר את המים העודפים מכל מגלשה והתקע את הרקמות עם מדיום הרכבה בתוספת DAPI ושקופית כיסוי. לאחר סחיטת מדיום ההרכבה העודף, תן לשקופיות להתייבש במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנות מפני אור, לפני רכישת תמונות עבור כל הערוצים באמצעות סורק שקופיות שלם. לאחר הסריקה, פתח את התמונות בתוכנת ניתוח התמונות ולחץ על הכרטיסיה רקמה.
כדי לייבא את התמונות שיש ליישר למגש השקופיות, בחר את התמונה הראשונה שיש ליישר ממסד הנתונים. לאחר שכל התמונות נטענו, לחץ על הבא בשלבי זרימת עבודה כדי לקשר את התמונות ולגרור ולשחרר את כל התמונות שיש ליישר לתמונה הראשונה. כאשר כל התמונות קושרו בהתאם לצורך, השתמש במינימום של שלושה פינים לתמונה המציינים תכונות רקמה הומולוגיות בתמונות המקושרות.
השתמש בסיכה כדי לעקוב אחר התמונה הראשונה כדי לבדוק את איכות היישור שנוצר. אם הושג יישור משביע רצון, לחץ על הבא כדי להציג את שכבות התמונה ולשמור את התמונה ללא הפרדות צבע במסד הנתונים. כדי לבצע זיהוי רקמות באמצעות פרוטוקול APP 1 המוגדר על-ידי המשתמש, פתח את הכרטיסיה ניתוח תמונה ופתח את התמונה ללא הפרדות צבע במודול ניתוח התמונה.
לחצו על הסמל 'פתח אפליקציה' ובחרו את האפליקציה המתאימה. כדי לוודא שהאפליקציה פועלת, נווט למיקום רקמה שנבחר ולחץ על תצוגה מקדימה. אם התוצאות משביעות רצון, לחץ כדי לעבד את התמונה באמצעות APP שנבחר.
במהלך העיבוד האפליקציה תקבע אם הפיקסל משויך לרקמה כדי לאפשר המרה של כל הפיקסלים הקשורים לרקמות לאזור מעניין. לאחר מכן ניתן להעביר את אזור העניין החדש שנוצר לכל אחת מהתמונות המיושרות. בסוף הניתוח, לחץ על קובץ ושמור כדי לשמור את התמונה ששונתה עם אזור העניין החדש שנוצר.
לפילוח הרקמה לסטרומה ופרנצ'ימה, פתחו את הכרטיסייה 'ניתוח תמונה' ובחרו את הקבצים המעניינים את מסד הנתונים. פתח את APP 2, APP 2 משתמש בתמונה המוכתמת ב- PSR לפילוח רקמות. תצוגה מקדימה של APP 2 על-ידי עיבוד התמונה בשדה תצוגה שנבחר.
אם התוצאות משביעות רצון, לחץ על הפעל כדי לעבד את APP 2 בתמונה המלאה. אזור העניין של הרקמה יחולק לסטרומה ופרנצ'ימה ואזוריהם בהתאמה ייקבעו. ניתן להעביר את אזורי העניין החדשים שנוצרו עבור הסטרומה והפארנצ'ימה לתמונות המיושרות, ולאחר מכן לייצא ולשמור את התמונה ששונתה כפי שהוכח.
כדי לזהות ולכרות אוכלוסיות תאים מעניינות, יבא את התמונה המפולחת של עניין למודול ניתוח התמונה. לאחר התאמת הצבע, פתחו את APP 3. APP 3 יזהה את אוכלוסיות התאים המעניין ויכומת אותן בתוך הפרנצ'ימה והסטרומה.
אם התוצאות משביעות רצון, הפעל את APP 3 בתמונה המלאה. כל התאים הבודדים של עניין יהיה שכותרתו, קואורדינטות הרקמה שלהם מאוחסנים, ואת הצפיפות של התאים של עניין באזורים סטרומה ועל-טבעי נקבע. לאחר מכן ניתן לשמור את התמונה ששונתה כפי שהוכח.
כדי לבצע מיפוי חום של רקמות של האובייקטים המסווים בתא הריבית, פתח את הפרוטוקול המתאים המוגדר על-ידי המשתמש בחלון בחירת APP ולחץ על הפעל כדי לבקש מה- APP להשתמש בקואורדינטות של האובייקטים המסווים בנוגדנים כדי ליצור את מפת החום. אזורי נקודה חמה, המסומן באדום, מכילים את הצפיפות הגבוהה ביותר של אוכלוסיית התאים המעניינים בעוד האזורים הכחולים הכהים הם הנמוכים ביותר. מפת החום של אוכלוסיית תאים ספציפית יכולה להיות על גבי התמונות המיושרות כדי לספק מידע נוסף על האופן שבו תאים אלה מאורגנים בתוך microenvironment הגידול.
ואז לייצא ולשמור את מפת חום הרקמה. חשוב מאוד לאמת את הספציפיות של התיוג, את הדיוק של ה- APPs המעוצבים ואת יעילות ההפשטה וההוכחה של הכתמים השונים באותו מקטע. על-ידי שילוב הדמיה טורית, תיוג רציף ויישור רקמות, ניתן לדמיין סמנים נוספים בו-זמנית ו ניתן לחלץ מידע נוסף מדגימות קליניות מוגבלות.
כתמי H&E של מקטעי רקמת גידול חתוכה מאפשרים הערכה של ארכיטקטורת הרקמה, מורפולוגיה של התאים ופרמטרים רלוונטיים קלינית כגון סוג הממאירות, ציון הגידול וחדירה כללית למערכת החיסון. כתמי CD34 מאפשרים זיהוי של תאי אנדותל. ציטוקרטין 8/18 כתמים מגלה את נוכחותם של תאי אפיתל, וכתמים אנטי אלפא חלקה שרירים actin מאפשר זיהוי של פיברוגניים, מופעל, תאי stellate הכבד.
תוכחה עם נוגדנים נגד CD68 ו Desmin לאפשר זיהוי של מקרופאגים myofibroblasts בהתאמה. כדי לאפיין טוב יותר את חדירת הגידול-חיסוני, ניתן לבצע כתמים עבור סמני תאי T ו myeloperoxidase. כתמים אדום Picro Sirius יכול להתבצע גם כדי לדמיין קולגן פרפור ולהקל על פילוח סטרומה ופרנצ'ימה.
ניתן לזהות פיקסלים הקשורים לרקמות בתוך המקטעים המוכתמים כדי לאפשר פילוח של תאים שונים בתוך אזור מסוים של עניין. לאחר מכן ניתן לזהות את אוכלוסיות התאים המעניין בתוך כל אזור, דבר המאפשר ליצור מפות רקמות שעבורן אזורים בעלי צפיפות גבוהה עבור אוכלוסיית תאים נתונה מוצגים כנקודות חמות ואזורים עם צפיפות נמוכה יחסית מופיעים כנקודות קרות. מתודולוגיה זו לזיהוי, כימות ומיפוי תאים חיסוניים בדגימות רקמות יכולה להיות מותאמת ולאמתת עבור שאלות מחקר ספציפיות וסמן עניין.
אסטרטגיה זו יכולה להיות מיושמת על מערכי מיקרו רקמות לניתוח תפוקה גבוהה. זה יכול גם להיות משולב עם היברידיות situ לבחון בו זמנית חלבון situ וביטוי גנים. השתמשנו באסטרטגיה זו כדי לזהות למפות תאים המייצרים IL-17A במקום ברקמת כבד פיברוטית מחולים.
כפי שצוין בפרוטוקול, מספר רייגנטים מסוכנים מבחינה כימית ויש לבצע את ההליכים הרלוונטיים במכסה המנוע הכימי באמצעות ציוד ההגנה האישי ואמצעי הזהירות המתאימים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג אסטרטגיה להדמיה, הכמת ומפת תאים חיסוניים בחלקי רקמת גידול. המתודולוגיה משלבת טכניקות הדמיה וניתוח דיגיטלי כדי לשפר את יכולת ה-multiplexing של מבחני הדמיה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של סרטן
- היסטולוגיה
רקע
- הארגון המרחבי של תאי החיסון בגידולים הוא בעל משמעות קלינית.
- טיפול חיסוני שינה את טיפול הסרטן, אך התגובות משתנות בין חולים.
- הבנת חתימות רקמת-חיסון עשויה לסייע בחיזוי תגובות לטיפול.
- שיטות קיימות לניתוח תמונות יכולות להיות מורכבות וטכניות.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה להדמיה והכמת יעילה של תאים חיסוניים ברקמות גידול.
- להקל על זיהוי חתימות רקמת-חיסון.
- לשפר את הנגישות של טכניקות הדמיה לחוקרים.
שיטות ששימשו
- שחזור אנטיגן של חלקי רקמות קבועות בפורמלין ומשובצות בפרפין.
- יישום של נוגדנים ראשוניים ומשניים לצורך סימון.
- רכישת תמונה באמצעות סורק שלמות גליל.
- ניתוח תמונה באמצעות פרוטוקולים המוגדרים על ידי המשתמש לזיהוי וריבוד רקמות.
תוצאות עיקריות
- הדמיה ומיפוי מוצלחים של אוכלוסיות תאי חיסון.
- זיהוי אזורי סטרומה ופרנכימה ברקמה.
- כימות של צפיפויות תאים באזורים שונים של הרקמה.
- יצירת מפות חום להדמיה של התפלגויות אוכלוסיית התאים.
מסקנות
- המתודולוגיה שפותחה משפרת את ניתוח תאי החיסון ברקמות גידול.
- גישה זו יכולה לסייע בהבנת תגובות החיסון בסרטן.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול אסטרטגיות טיפול חיסוני מותאמות אישית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding the spatial organization of immune cells in the tumor microenvironment is critical for predicting immunotherapy response and guiding target validation. This method enables quantitative mapping of immune cell populations from limited clinical specimens, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By providing unbiased, whole-tissue visualization, it enhances predictive confidence in target selection and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through spatial quantification of immune infiltrates in tumor tissue.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating immune cell localization with tissue-immune signatures predictive of anti-tumor response.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying immune phenotypes associated with treatment response or resistance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining immune contexture in stromal and parenchymal compartments.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through user-defined protocols for tissue detection, segmentation, and quantification.
- Scalability: Enables platform reuse via virtual multiparameter slides and automated analysis workflows compatible with tissue microarrays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains translational continuity from discovery through preclinical validation by mapping immune cell densities across tissue regions.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by generating heat maps that visualize hot and cold spots of immune cell populations.
- Biomarker Alignment: Facilitates translational biomarker development through quantification of cell-of-interest densities in stroma and parenchyma.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to assay readiness in screening and biomarker alignment in translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling identification and mapping of immune cell populations in tissue sections.
- Screening: Enhances assay readiness through quantitative outputs such as cell densities in stromal and parenchymal regions, enabling reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers statistical outputs including cell population quantification and spatial heat mapping that help teams compare conditions across samples.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing tissue-immune signatures that inform biomarker alignment and risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability through serial imaging, sequential labeling, and tissue alignment, allowing multiple markers to be visualized from limited specimens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through spatial immune cell mapping.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability via automated image analysis using user-defined protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling data-driven prioritization based on immune contexture.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantification of immune cell densities and distribution patterns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, image analysis, and protocol optimization for multiplexed staining.
- Dependent on whole-slide scanner infrastructure and image analysis software supporting user-defined protocols (Tissuealign, Author, HISTOmap).
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, stripping efficiency, and APP validation across sites.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different tissue types or disease models beyond tumor microenvironment.
- Includes practical limitations such as the need to verify labeling specificity, APP accuracy, and stripping/reprobing efficiency before full implementation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:03
Heat-Induced Antigen Retrieval
1:46
Nonspecific Binding Blocking
2:28
Immunofluorescence Labeling
3:36
Image Alignment
4:36
Tissue Detection
5:35
Tissue Segmentation
6:28
Cell of Interest (COI) Identification and Quantification
7:15
Tissue Heatmapping
8:10
Results: Representative Visualization, Quantification, and Mapping of Cell Populations of Interest in the Tumor Microenvironment
10:02
Conclusion
