ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

פלואור שתייגת אנטיביוטיקה הם כלים רבי-עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד היבטים מרובים של עמידות מיקרוביאלית. מאמר זה מתאר את הכנת אנטיביוטיקה מתויג fluorescently היישום שלהם כדי ללמוד עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. רגשים יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים של עמידות חיידקים (למשל, אפלוקס) על ידי ספקטרופוטומטר, זרימה cy try, ו מיקרוסקופ.

הכנת אנטיביוטיקה פלואורסצנטית מאפשרת הערכה של לוקליזציה של בריאגנטים טיפוליים אלה בתוך חיידקים באמצעות טכניקות אנליטיות נוחות כגון ספקטרופוטומיה ומיקרוסקופיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הקלות שבה ניתן לקבוע לוקליזציה אנטיביוטית. לוקליזציה זו רלוונטית למספר תופעות כולל efflux.

כדי לבצע את הליך התגובה לחץ על, מניחים את האנטיביוטיקה azide של עניין בבקבוקון תחתון עגול ולהוסיף 25 מיליליטר של tert-butanol ו 25 מיליליטר של מים למילימול של אזיד לבקבוק. מוסיפים את הפלואורופור אלקין המוכן לפתרון ומחממים את התגובה ל -50 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף 0.6 שווה ערך של נחושת סולפט ו 2.4 שווה ערך של חומצה אסקורבית לבקבוק.

מערבבים את התגובה במשך שעה אחת או עד ניתוח על ידי LCMS מציין השלמת תגובה. לאחר מכן מצננים ומטהרים את התגובה בהתאם לפיגום האנטיביוטי. כאן, התגובה מפתח מפתח לחץ כימיה להכנת אנטיביוטיקה פלואורסצנטית עם דוגמאות של המבנה מסונתז מן האנטיביוטיקה המתאימה באמצעות ביניים אזיד מבוסס על ציפרופלוקסאצין, linezolid, ו trimethoprim מוצגים.

אלה ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית עקבות של אזיד ציפרופלוקסאצין ותגובת קליק NBD אלקין, azide היה eluted ב 3.2 דקות המוצר היה eluted ב 3.8 דקות. התקדמות תגובת הקליק יכולה להיות מלווה בהיעלמותה של פסגת האזיד. בספקטרום זה, ניתן לדמיין את השפעת הטיהור כשפסגות שגויות נעלמות.

כדי להעריך את הפעילות האנטי מיקרוביאלית של אנטיביוטיקה מסונתז, רצף גליצרול מניות של זנים חיידקיים המתאימים פיגום אנטיביוטי על צלחות אגר LB ולגדל את התרבויות לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לבחור מושבה אחת מכל צלחת ותרבות המושבות לילה בחמישה מיליליטר של CAMHB לכל תרבות ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, לדלל את התרבויות כ 40-פי CAMHB טרי לגדל את החיידקים לשלב יומן באמצע עם צפיפות אופטית ב 600 ננומטר בין 0.4 ו 0.8.

לאחר מכן, הכינו את פתרונות המלאי של כל אנטיביוטיקה פלואורסצנטית ב-1.28 מיליגרם למיליליטר ב-20% דימתיל סולפוקסיד במים סטריליים והוסיפו 10 מיקרוליטרים של אנטיביוטיקה לכל באר של העמודה הראשונה של צלחת של 96 בארות. הוסף 90 microliters של CAMHB לכל באר של העמודה הראשונה ו 50 microliters לכל בארות אחרות. לאחר מכן בצע דילול טורי כפול על פני הצלחת.

לאחר ערבוב יסודי, מדללים את תרבות שלב הרישום ה הבינוני ל בערך פי 10 למושבה השישית ויוצרים יחידות למיליליטר ומוסיפים 50 מיקרוליטרים של כל תרבות ל בארות הדילול כדי להשיג ריכוז סופי של כחמש פעמים 10 למושבה החמישית להרכיב יחידות למיליליטר. כאשר כל החיידקים כבר מצופים, מניחים מכסים על הצלחות ו דגירה התרבויות במשך 18 עד 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בלי לרעוד. למחרת, תבדקו את הצלחות.

ריכוז העיכוב המינימלי יהיה הריכוז הנמוך ביותר היטב ללא צמיחה נראית לעין. לניתוח הצטברות בדיקה, מניות גליצרול פס של זנים חיידקיים על צלחות אגר LB עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, בחר מושבה אחת מהצלחת לתרבות הלילה במרק לייסוגניים ב-37 מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר, לדלל את תרבות הלילה כ 50-פי במדיום טרי. כאשר התרבות מגיעה לשלב יומן אמצע, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ו decant המדיום. תן שוב את החיידקים במיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה של החיידקים שוב.

Decant supernatant ו resuspend גלולה שטף PBS לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר של שניים. הוסף 10.1 microliters של 10 מילימולר CCCP ב PBS למיליליטר אחד של חיידקים דגירה החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בסוף הדגירה, לאסוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה resuspend את גלולה במיליליטר אחד של 10 כדי 100 פתרון אנטיביוטיקה פלואורסצנטי מיקרומולרי PBS.

לאחר דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ארבע פעמים במיליליטר אחד של PBS קר לכל לשטוף. לאחר הכביסה, lyse החיידקים עם 180 microliters של חיץ תיזה ו 70 microliters של lysozyme. לאחר 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להקפיא-להפשיר את החיידקים שלוש פעמים במינוס 78 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ו 34 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בהתאמה.

לאחר הסיבוב האחרון של הפשרת הקפאה, sonicate המדגם במשך 20 דקות ואחריו דגירה 30 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לאסוף את המדגם lysed על ידי צנטריפוגה ומאמץ את תכולת הצינור דרך קרום מסנן 10 קילודלטון. לשטוף את המסנן ארבע פעמים עם 100 microliters של מים לכל לשטוף aliquot כל לשטוף לתוך בארות בודדות של צלחת שחורה שטוחה 96 היטב.

לאחר מכן למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות על קורא צלחת עם אורך גל של העירור וההפלה המתאים הפלואורופור. תוצאות אופייניות אלה מהערכת הצטברות תאית על ידי ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית בנוכחות והיעדר אפלוקס מראות כי הפלואורסצנטיות תאית של החיידקים גבוהה משמעותית לאחר טרום טיפול עם CCCP המציין כי אפלוקס מפחית את ההצטברות בתוך החיידקים. בתמונות מיקרוסקופיות קונפוקאליות מייצגות אלה של חיידקים שליליים Gram חיובי ו Gram, לוקליזציה של אנטיביוטיקה בתוך החיידקים ניתן לדמיין לאחר טיפול CCCP.

תופעה זו אינה נצפית כאשר לא CCCP מתווסף. בעת שימוש באנטיביוטיקה פלואורסצנטי, להיות מודעים איזה מידע אתה מכוון לאסוף הקפד לשקול איזה פרוטוקול יהיה שימושי ביותר בעת קבלת נתונים אלה. בעקבות הסינתזה שלהם, אנטיביוטיקה פלואורסצנטי יכול לשמש כדי ללמוד מספר תהליכים חיידקיים כולל אינטראקציות יעד התרופה ושינויים התנגדות.