בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

שיטה זו מספקת דרך לכמת את גודל הכבד בדג זברה זחל. זה גם מאפשר הערכה של ההשפעות של מניפולציה גנטית פרמקולוגית על צמיחת הכבד והתפתחות. טכניקה זו מספקת דרך מהירה ומדויקת לדמיין ולמדוד את הכבד, כמו גם את המעיים והלבלב.

בנוסף לכימות גודל הכבד, שיטת ניתוח זו יכולה להיות מועילה להכנת הכבד, המעיים והלבלב להכלאה במקום או הדמיה קונפוקל. לפני שתנסה להתאמן על זחלים ניסיוניים, ודא שהשקעת זמן רב בתרגול על דגימות שאינן ניסיוניות ויש לך שיעור הצלחה משמעותי. זה קריטי כדי לדמיין אוריינטציה נכונה ותנועה של זחלים דגי זברה ומדפים על מנת להסיר את העור מבלי להפריע לאיברים שמסביב.

בשלושה עד שבעה ימים לאחר ההפריה, לאחר המתת זחלים, השתמשו בפיגט זכוכית ומשאבת פיפטה כדי לאסוף עד 15 זחלים בצינור של שני מיליליטר. לשטוף זחלים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS 1X קר על קרח. הסר PBS רבים ככל האפשר באמצעות פיפטה זכוכית משאבת פיפטה ולהוסיף מיליליטר אחד של קר ארבעה אחוז PFA ב PBS.

דגירה בארבע מעלות צלזיוס לפחות לילה עם נדנדה עדינה. באמצעות פיפטה זכוכית ומשאבת פיפטה, להסיר את PFA מהצינור ולשטוף שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS קר. רוק במשך חמש דקות בין שטיפות.

פיפטה כמה זחלים ב- PBS לתוך באר אחת של צלחת זכוכית עגולה תחתונה תשעה היטב. תחת מיקרוסקופ, להסיר את העור המקיף את הכבד באמצעות מלכודות בסדר להחזיק זחל אחד על גבו, אוחז משני צדי הראש בעדינות רבה ככל האפשר. ואז להשתמש מדפים עדין מאוד ביד השנייה כדי לתפוס את העור רק overlying את הלב.

משוך את העור כלפי מטה באלכסון לכיוון הזנב של הדג בתחתית המנה בצד שמאל או ימין של הדג. חזור על הפעולה עבור הצד השני. המשך לתפוס מדפים של העור מושך למטה עד כל העור מלנופורים overlying או ליד הכבד הוסרו.

אם חלמון קיים במשך חמישה עד שישה ימים לאחר ההפריה זחלים, להרים את החלמון בחתיכה אחת על ידי החזקת הדג עם מלקעות בסדר על גבו באמצעות מלקעות בסדר מאוד לדרבן בעדינות את החלמון. עבור שלושה עד ארבעה זחלי DPF, להחזיק את הדג עם מלקחי עדין על גבו ולהשתמש מלקחי עדין מאוד ללטף את החלמון החל מהצד הגחוני. מגרדים את החלמון בחתיכות.

מניחים את הזחלים המנותלים לתוך PBS טרי וקר בצינור שני מיליליטר באמצעות פיפטה זכוכית ומשאבת פיפטה. כדי לעלות על הזחלים, יוצקים כמה מיליליטר של שלושה אחוזים מתילקלוז על המכסה של צלחת פטרי נקייה מפלסטיק. השתמש פיפטה זכוכית משאבת פיפטה כדי להוסיף זחלים methylcellulose, הוספת PBS קטן עם הזחלים ככל האפשר.

תחת מיקרוסקופ מנותח בהגדלה נמוכה, השתמש במטסים עדין כדי לכוון את הדגים כך שהם שוכבים בצד ימין שלהם פונה שמאלה. אשר כי הדג להצטלם מיושר בצורה מושלמת עם עין אחת ישירות על גבי העין השנייה. אם זנב הדג מכופף, הסר את הזנב על ידי צביטתו בכוח במדפים כדי להסיר אותו כך שהדגים ישכבו שטוחים.

התקרבו להגדלה גבוהה והתמקדו בכבד, ודאו שמתווה הכבד נראה בבירור. לחץ על לחצן לכידת תמונה כדי להצמיד תמונה ולשמור את הקובץ. חזור על הפעולה עבור כל הדגים, ודא שההגדלה זהה עבור כל תמונה.

צלם תמונה של מיקרומטר באמצעות אותה הגדלה. כדי להשתמש בתוכנית R כדי לעוור את כל תמונות הכבד כדי למנוע הטיית חוקר פוטנציאלי ולקדם הקפדה מדעית, לשנות את שמות הקבצים באופן אקראי וליצור קובץ אקראי המכיל רשימה של שמות הקבצים המקוריים ושמות קבצים עיוורים תואמים. פתח קבצים אקראיים לפי הסדר, החל מקובץ אחד.

בחרו בכלי בחירות ביד חופשית והתוו כל כבד. לחץ Control-M כדי למדוד את האזור של כל כבד. עבור כל הכבדים שלא ניתן למדוד במדויק כי יש להם עור שיורית, חלמון, הם מחוץ לפוקוס, או לא שלמים, להכניס מדידת מציין מיקום.

שמור את המידות בקובץ טקסט. כדי לבטל את ההקצנה ולנתח נתונים, פתח את קובץ המדידות ואת קובץ האקראיזציה בתוכנית גיליון אלקטרוני. הוסיפו עמודה חדשה לקובץ המידות והוסיפו את שמות הקבצים המקוריים לקבצים המסונוורים באמצעות קובץ האקראיזציה.

שמור קובץ זה כקובץ המדידות הלא מרוסנות. מיין את הנתונים לפי שם הקובץ המקורי. אל תכלול מדידות כבד שעבורן תמונות לא היו מספיקות.

במידת הצורך, המירו ערכי מדידה לקנה המידה הרצוי במילימטרים רבועים. פתח את סרגל קנה המידה בתוכנת עיבוד התמונה. השתמש בכלי קו ישר כדי למדוד מילימטר אחד בסולם ההיקף.

תוכנת עיבוד התמונה לאחר מכן מודד באותן יחידות כמו הכבדים, נותן גורם המרה. השתמשו במקדם ההמרה להמרת מידות בקובץ 'מדידות לא מקובות'. קבע את הממוצע וסטיית התקן וחשב ערכי P.

בשישה ימים לאחר ההפריה, זחלי זברה לא מהוונגיים הראו מיקום טבעי וצורה של כבד מעל המעיים. דגי זברה מהו מהודרים הגדילו באופן משמעותי את גודל הכבד בהשוואה לאחים הלא מהו מהוונגיים שלהם. כמה דוגמאות של תמונות לא מספקות מיקרומטר מוצגים כאן.

זחל עם עור המכסה את הכבד, זחל עם חלמון מטשטש את הכבד, זחל עם חלקים של הכבד צבט, וזחל עם הכבד נקע ונופל, זחל עם כבד חסר, זחל עם קווי מתאר הכבד שקשה לזהות, וזחל עם מיקום לא תקין. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בתנועות קטנות ומבוקרות כדי למנוע נזק לכבד. בנוסף למיקרוסקופיה של שדה בהיר, אנו יכולים גם להשתמש בזחלים שנותרו בדרך זו, למיקרוסקופיה קונפוקאלית, כדי לדמיין חלבוני כתב פלואורסצנטיים או כתמים אימונו-פלואורסצנטיים, ולהכלאה באתרו.

הפורלדהיד או PFA הוא מסרטן מרגיז וחשוד. כפפות צריך להיות משוחק בעת טיפול PFA ופתרונות מרוכזים צריך להיות מטופלים ברדס אדים כימיים.