Name: בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: למדו שיטה לכימות גודל הכבד בזחלי זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה ומדויקת של השפעות מניפולציות גנטיות ותרופתיות על התפתחות הכבד והאיברים הסמוכים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

היינו רוצים להכיר במרין הובס ועל משאבי בעלי החיים מרוכז של דג (הצאר) באוניברסיטת יוטה על מתן גידול בדגים, שטח מעבדה, וציוד לביצוע חלקים של מחקר זה. התרחבות הצאר נתמכת בחלקו על ידי NIH גרנט 1G20OD018369-01. אנחנו גם רוצים להודות רודני סטיוארט, קלואי לים, לאנס גרהאם, קודי ג'יימס, גארט nickum, ואת סרטן הצייד המכון (hci) דג זברה מתקן לטיפול דג זברה. אנחנו רוצים להודות לקנת קומפאס לקבלת עזרה בתכנות R. עבודה זו ממומנת בחלקו על ידי מענקים מן הקרן לסרטן הצייד (בשילוב עם גרנט P30 CA042014 הוענק מכון סרטן הצייד) (KJE) ו-NIH/NCI R01CA222570 (KJE).

מחקרים בעלי חיים מתבצעים בעקבות הליכים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת יוטה.
1. תיקון הזחלים
<ol><li>בשעה 3 – 7 ימים הפריה פוסט (dpf), להרוג הזחלים עם טריקיין מתיונין (0.03%) ולאסוף עד 15 הזחלים בצינור 2 מ"ל באמצעות פיפטה זכוכית משאבת פיפטה.</li>
	<li>שטוף הזחלים פעמיים עם 1 מ ל של קר (4 ° c) 1 x פוספט מאגור מלוחים (PBS) על קרח. עבור כל כביסה, להסיר את הנוזל ככל האפשר מן הצינורית עם צינור זכוכית משאבת פיפטה, ולאחר מכן להוסיף 1 מ ל של הערוץ הקר לצינור.</li>
	<li>להסיר כמו PBS ככל האפשר באמצעות משאבת זכוכית ומשאבה פיפטה, ולהוסיף 1 מ ל קר (4 ° צ') 4% פאראפורמלדהיד (כחול) ב PBS. התראה: המטה הוא מטרד וחשוד מסרטן. יש לענוד כפפות בעת טיפול בתחום הכרומטוגרפיה, ולטפל בפתרונות מרוכזים בתוך מכסה כימי.</li>
	<li>מודטה ב -4 ° c לפחות לילה (אבל עד מספר חודשים) עם נדנדה עדינה.</li>
</ol>2. מבתר רקמות סביב הכבד
<ol><li>להסיר את הזחלים מתוך החול על ידי שטיפה 3x עם 1 מ ל של קר (4 ° c) PBS ונדנדה עבור 5 דקות בין rinses. הערה: זה בסדר לשמור את הזחלים ב-PBS ליום או יומיים ב -4 ° c.</li>
	<li>לתוך באר אחת של. צלחת זכוכית באורך 9 היטב</li>
	<li>להסיר את העור מסביב לכבד.<ol>
<li>השתמש מלקחיים עדינים להחזיק זחל על גבו (בטן למעלה), מחזיק משני צדי הראש בעדינות ככל האפשר. ואז להשתמש מלקחיים עדין מאוד ביד השנייה כדי לתפוס את העור רק על הלב.</li>
		<li>למשוך את העור באלכסון לכיוון הזנב של הדג ואת החלק התחתון של המנה בצד שמאל או ימין של הדג. חזור לצד השני (ימין או שמאל).</li>
		<li>המשך לתפוס כנפיים של העור משיכת למטה/בחזרה עד כל העור מלנומה על גבי או ליד הכבד הוסרו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להסיר חלמון, אם קיים.<ol>
<li>עבור 5 – 6 הזחלים dpf, להרים את החלמון בחתיכה אחת על ידי החזקת הדג עם מלקחיים עדינים על גבו ושימוש מלקחיים בסדר מאוד לעורר את החלמון בעדינות.</li>
		<li>במשך 3 – 4 הזחלים של הזחל, לגרד את החלמון בחתיכות. להחזיק את הדג עם מלקחיים עדינים על גבו ולהשתמש מלקחיים עדין מאוד ללטף את החלמון, החל הצד הגחוני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מניחים הזחלים לגזור PBS קר טרי באמצעות פיפטה זכוכית ומשאבת פיפטה.</li>
</ol>3. הדמיה
<ol><li>כדי הר הזחלים, יוצקים מספר mL של 3% מתיל תאית על המכסה של צלחת פטרי נקייה פלסטיק.</li>
	<li>השתמש בפיפטה זכוכית ומשאבת הפיפטה כדי להוסיף זחלים למתיל תאית, והוסיפו כמעט PBS עם הזחלים האפשריים.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ מבתר על הגדלה נמוכה, השתמש מלקחיים עדינים כדי לכוון את הדג כך שהם שוכב בצד ימין שלהם, פונה שמאלה. הערה: ודא כי הדג מונחה בצורה מושלמת בצד שלהם או שמידות הכבד אינן מדויקות.</li>
	<li>. תצלם כל דג<ol>
<li>ודא כי הדג להצטלם מיושר בצורה מושלמת, עם עין אחת ישירות מעל העין השנייה. במקרה הצורך, להשתמש מלקחיים עדינים להקיש בקלילות על הראש או זנב של דגים כדי להתאים את הכיוון. אם הזנב של הדג הוא כפוף, להסיר את הזנב על ידי צובט אותו בחוזקה עם מלקחיים כדי להסיר אותו כך הדג מניח.</li>
		<li>התקרבות להגדלה גבוהה והתמקד בכבד, וודא שקווי המתאר של הכבד גלויים בבירור.</li>
		<li>הצמד תמונה ושמור את הקובץ.</li>
		<li>חזור על הפעולה עבור כל הדגים, ודא שההגדלה זהה עבור כל תמונה.</li>
		<li>צלם תמונה של מיקרומטר תוך שימוש באותה הגדלה (ראה איור 2ח').</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניתוח תמונה
<ol><li>למדוד את האזור של הכבד של כל דג באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.<ol>
<li>עיוורון כל הכבד תמונות כדי למנוע הטיית חוקר פוטנציאלי ולקדם את הקשיחות המדעית15. שלב זה יכול להיעשות באופן ידני על-ידי חבר מעבדה אחר או באמצעות תוכנית מחשב (חומר משלים). שינוי שם של קבצים באופן אקראי וליצור "קובץ רנדומאלי" המכיל רשימה של שמות הקבצים המקוריים ושמות הקבצים העיוורים התואמים.</li>
		<li>פתח קבצים אקראיים לפי הסדר, החל בקובץ 1.</li>
		<li>בחרו בכלי בחירה ביד חופשית והתווה כל כבד.</li>
		<li>הקש Ctrl-M כדי למדוד את האזור של כל הכבד.</li>
		<li>עבור כל כבדים שלא ניתן למדוד באופן מדויק, הוסף מדידה של מציין מיקום (קטנה מאוד או גדולה מאוד, כך שניתן יהיה להוסיפה בקלות בהמשך).</li>
		<li>שמור את המידות בקובץ טקסט ("קובץ מדידות").</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבטל את העיוורון ולנתח נתונים<ol>
<li>פתח "קובץ מדידות" ו "קובץ אקראיות" בתוכנית גיליון אלקטרוני.</li>
		<li>הוסף עמודה חדשה ב"קובץ המדידות" והוסף את שמות הקבצים המקוריים עבור הקבצים העיוורים, באמצעות "קובץ האקראיות". שמור קובץ זה כ-"קובץ מדידות שלא עיוורו".</li>
		<li>מיין נתונים לפי שם קובץ מקורי.</li>
		<li>הקפד לא לכלול מדידות כבד אשר תמונות היו לקוי (ראה איור 2א – G).</li>
		<li>במקרה הצורך, המירו ערכי מדידה לקנה מידה רצוי (mm2, לדוגמה).<ol>
<li>פתחו את סרגל הסרגל בתוכנת עיבוד התמונה.</li>
			<li>השתמשו בכלי קו ישר למדידת 1 מ"מ בסרגל הסרגל. תוכנת עיבוד התמונה יהיה למדוד באותם יחידות כמו הכבדים (פיקסלים), מתן פקטור ההמרה.</li>
			<li>השתמש בפקטור ההמרה כדי להמיר מדידות בקובץ המדידות הבלתי עיוור.</li>
		</ol>
</li>
		<li>באמצעות תוכנית הגיליון האלקטרוני או הדבקת נתונים בתוכנת גרפים וסטטיסטיקה מדעית, קבע ממוצע וסטיית תקן וחשב ערך p (ים).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lin, D. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li>
<li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+hepatocellular+carcinoma%3A+Epidemiology%2C+etiology%2C+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+%CE%B2-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras%28V12%29+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+kras%28V12%29+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).</li>
<li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish%3A+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).</li>
<li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae%3A+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).</li>
<li>Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li>
<li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).</li>
<li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הקוונפיקציה של גודל הכבד היא קריטית במחקרים שמטרתם הבנת התפתחות הכבד, התחדשות, ו אונגנזה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא טכניקה מהירה יחסית, קלה וזולה לכמת את גודל הכבד בזחל צראדג. הפעלת זהירות מתאימה תוך ביצוע היבטים מסוימים של הפרוטוקול יכולה לסייע בדיוק מוגבר של תוצאות ולהקטין את התסכול.
קיבעון תקין של הזחלים הוא חיוני כלפי קבלת דגימות ביולוגיות משומרים היטב ומניעת התפוררות שלהם. דילול של 4% בכיוון הערוץ יכול להתרחש כאשר PBS לא מוסרת לחלוטין לפני הוספת התחתית לזחלים שוטפים. שימוש בפתרונות בעלי כי...

קרצינומה hepatocellular (HCC) הוא הגורם העיקרי הנפוץ ביותר של הכבד1 ואת הסיבה המובילה השלישית לתמותה הקשורות לסרטן2. כדי להבין טוב יותר מנגנונים של hepatocarcinogenesis ולזהות HCC therapeutics פוטנציאלי, אנחנו ואחרים פיתחנו בעלי החיים הטרנסגניים שבהם הביטוי הספציפי hepatציט של אונגנס כגון β-catenin3,4, קראס (רובוטית v12)5,6, myc7, או Yap18 מוביל HCC בבעלי חיים למבוגרים. ב זה zebrafish, הגדלת הכבד הוא ציין מוקדם ככל 6 ימים הפריה הפוסט (dpf), מתן פלטפורמת נתיישב לבדיקת ההשפעות של תרופות ושינויים גנטיים על הצמיחה אונגן מונחה הכבד. מדידה מדויקת ומדויקת של גודל בכבד זחל חיוני לקביעת ההשפעות של המניפולציות האלה.
גודל הכבד והצורה ניתן להעריך חצי-כימות הזחלים של דג זברה קבוע על ידי CY3-SA תיוג9 או ב חיים דג זברה הזחלים באמצעות hepatocyte-כתבים פלורסנט ספציפיים הניתוח מיקרוסקופ5,6. השיטה האחרונה היא מהירה יחסית, והיעדר דיוק שלה ניתן לטפל על ידי צילום ומדידת האזור של כל כבד באמצעות תוכנה עיבוד תמונה7,10. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית מיקום אחיד כל הזחלים לחיות בניסוי כזה שאזור כבד דו מימדי הוא ייצוג מדויק של גודל הכבד. טכניקה דומה לכמת את גודל הכבד כוללת שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אור לכמת את עוצמת הזחל הכבד8, אשר עשוי להיות מדויק יותר לזיהוי הבדלים בגודל כאשר הכבד מורחב לא אחיד בממדים שונים. מיון תא מופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) יכול לשמש כדי לספור את מספר החומרים המסומנים fluorescently וסוגים אחרים של תאי הכבד בזחל כבדים8,11. בשיטה זו, כבדי זחל הם במאגר והנתק, כך מידע על גודל הכבד בודדים וצורה הוא איבד. בשילוב עם שיטת קביעת גודל כבד אחרת, FACS מאפשר הבדלה בין מספר התאים המוגבר (היפרפלזיה) וגודל התא גדל (היפרפרס). כל השיטות הללו מעסיקים טכנולוגיה פלואורסצנטית יקרה (מיקרוסקופ או סדרן תאים) ו, למעט תיוג CY3-SA, דורשים תיוג של hepatocytes עם כתב פלורסנט.
כאן אנו מתארים בפרוטרוט שיטה לכמת את השטח של הזחל הכבד באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ותוכנה עיבוד תמונה3,12,13,14. פרוטוקול זה מאפשר כימות מדויקות של אזור הכבדים הבודדים באתרו ללא שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. במהלך ניתוח גודל הכבד, אנו מעוורים את זהות התמונה כדי להפחית את הטיית החוקר ולשפר את הקשיחות המדעית15.

<table><tbody><tr><td>מצלמה לניתוח מיקרוסקופ</td><td>Leica, למשל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>Leica, למשל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>צנרת זכוכית</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונה</td><td>J/FIJI</td><td></td><td>ניתן להוריד את ImageJ/FIJI בחינם: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td></tr><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט</td><td>ספקים</td><td></td><td></td>שונים</tr><tr><td>משאבת פיפטה</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי מפלסטיק</td><td>ארה"ב סיינטיפיק בע"מ</td><td>2906</td><td></td></tr><tr><td>פיירקס צלחת זכוכית תחתונה עגולה 9 בארות</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לעיוורון קבצים</td><td>R</td><td></td><td>פרויקט R ניתן להוריד בחינם: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>תוכנת גרפים וסטטיסטיקה מדעית</td>תוכנית <td>גיליון אלקטרוני GraphPad Prism</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td> <td>Western Chemical</td><td>200-226</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים מאוד (Dumont #55)</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11255-20</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

בכמה מודלים הטרנסגניים של דגי hepatocellular (HCC), hepatomegaly ניתן לצפות במהלך שלבי הזחל המוקדמים. בדיקת גודל הזחל הכבד ב דג זברה מודלים HCC מספק אמצעים כדי להעריך במהירות את ההשפעות של תרופות ומניפולציות אחרות על פניטיפים הקשורים אונאוגן. כאן אנו מראים כיצד לתקן הזחלים דג זברה, לנתח את הרקמות סביב הכבד, צילום כבדים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, למדוד את אזור הכבד, ולנתח את התוצאות. פרוטוקול זה מאפשר כימות מהירה ומדויקת של גודל הכבד. כאשר שיטה זו כרוכה במדידת אזור הכבד, הוא עשוי להמעיט בערכם של עוצמת הכבד, ומתודולוגיות משלימות נדרשות כדי להבדיל בין שינויים בגודל התא ושינויים במספר התאים. טכניקת החיתוך המתוארת בזאת היא כלי מצוין להמחיש את הכבד, הבטן והלבלב בעמדותיהם הטבעיות לצורך מספר יישומים בזרם המים, כולל כתמים immunofluorescence והיברידיזציה באתרו. האסטרטגיה המתוארת עבור כימות הכבד הזחל היא ישימה היבטים רבים של התפתחות הכבד והתחדשות.

ביטוי מיוחד המופעל β-catenin (Tg (fabp10a: pt-β-cat) מופעל באמצעותשלושה אחים שאינם טרנסגניים הורדמים באזור 6 dpf ובכבד שימוש במיקרוסקופיה ברייטפילד ובתוכנת עיבוד תמונה. דג הטרנסגניים הגביר באופן משמעותי את גודל הכבד (0.0006 ס"מ2) לעומת האחים הלא-טרנסגניים שלהם (0.0004 ס"מ2, p &lt; 0.0001; איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/6074...

כאן אנו להפגין שיטה לכמת את גודל הכבד בזחל zebrafish, מתן דרך להעריך את ההשפעות של מניפולציות גנטיות ופרמקולוגית על גידול בכבד ופיתוח.

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

שיטה זו מספקת דרך לכמת את גודל הכבד בדג זברה זחל. זה גם מאפשר הערכה של ההשפעות של מניפולציה גנטית פרמקולוגית על צמיחת הכבד והתפתחות. טכניקה זו מספקת דרך מהירה ומדויקת לדמיין ולמדוד את הכבד, כמו גם את המעיים והלבלב.בנוסף לכימות גודל הכבד, שיטת ניתוח זו יכולה להיות מועילה להכנת הכבד, המעיים והלבלב להכלאה במקום או הדמיה קונפוקל. לפני שתנסה להתאמן על זחלים ניסיוניים, ודא שהשקעת זמן רב בתרגול על דגימות שאינן ניסיוניות ויש לך שיעור הצלחה משמעותי. זה קריטי כדי לדמיין אוריינטציה נכונה ותנועה של זחלים דגי זברה ומדפים על מנת להסיר את העור מבלי להפריע לאיברים שמסביב.בשלושה עד שבעה ימים לאחר ההפריה, לאחר המתת זחלים, השתמשו בפיגט זכוכית ומשאבת פיפטה כדי לאסוף עד 15 זחלים בצינור של שני מיליליטר. לשטוף זחלים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS 1X קר על קרח. הסר PBS רבים ככל האפשר באמצעות פיפטה זכוכית משאבת פיפטה ולהוסיף מיליליטר אחד של קר ארבעה אחוז PFA ב PBS.דגירה בארבע מעלות צלזיוס לפחות לילה עם נדנדה עדינה. באמצעות פיפטה זכוכית ומשאבת פיפטה, להסיר את PFA מהצינור ולשטוף שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS קר. רוק במשך חמש דקות בין שטיפות.פיפטה כמה זחלים ב- PBS לתוך באר אחת של צלחת זכוכית עגולה תחתונה תשעה היטב. תחת מיקרוסקופ, להסיר את העור המקיף את הכבד באמצעות מלכודות בסדר להחזיק זחל אחד על גבו, אוחז משני צדי הראש בעדינות רבה ככל האפשר. ואז להשתמש מדפים עדין מאוד ביד השנייה כדי לתפוס את העור רק overlying את הלב.משוך את העור כלפי מטה באלכסון לכיוון הזנב של הדג בתחתית המנה בצד שמאל או ימין של הדג. חזור על הפעולה עבור הצד השני. המשך לתפוס מדפים של העור מושך למטה עד כל העור מלנופורים overlying או ליד הכבד הוסרו.אם חלמון קיים במשך חמישה עד שישה ימים לאחר ההפריה זחלים, להרים את החלמון בחתיכה אחת על ידי החזקת הדג עם מלקעות בסדר על גבו באמצעות מלקעות בסדר מאוד לדרבן בעדינות את החלמון. עבור שלושה עד ארבעה זחלי DPF, להחזיק את הדג עם מלקחי עדין על גבו ולהשתמש מלקחי עדין מאוד ללטף את החלמון החל מהצד הגחוני. מגרדים את החלמון בחתיכות.מניחים את הזחלים המנותלים לתוך PBS טרי וקר בצינור שני מיליליטר באמצעות פיפטה זכוכית ומשאבת פיפטה. כדי לעלות על הזחלים, יוצקים כמה מיליליטר של שלושה אחוזים מתילקלוז על המכסה של צלחת פטרי נקייה מפלסטיק. השתמש פיפטה זכוכית משאבת פיפטה כדי להוסיף זחלים methylcellulose, הוספת PBS קטן עם הזחלים ככל האפשר.תחת מיקרוסקופ מנותח בהגדלה נמוכה, השתמש במטסים עדין כדי לכוון את הדגים כך שהם שוכבים בצד ימין שלהם פונה שמאלה. אשר כי הדג להצטלם מיושר בצורה מושלמת עם עין אחת ישירות על גבי העין השנייה. אם זנב הדג מכופף, הסר את הזנב על ידי צביטתו בכוח במדפים כדי להסיר אותו כך שהדגים ישכבו שטוחים.התקרבו להגדלה גבוהה והתמקדו בכבד, ודאו שמתווה הכבד נראה בבירור. לחץ על לחצן לכידת תמונה כדי להצמיד תמונה ולשמור את הקובץ. חזור על הפעולה עבור כל הדגים, ודא שההגדלה זהה עבור כל תמונה.צלם תמונה של מיקרומטר באמצעות אותה הגדלה. כדי להשתמש בתוכנית R כדי לעוור את כל תמונות הכבד כדי למנוע הטיית חוקר פוטנציאלי ולקדם הקפדה מדעית, לשנות את שמות הקבצים באופן אקראי וליצור קובץ אקראי המכיל רשימה של שמות הקבצים המקוריים ושמות קבצים עיוורים תואמים. פתח קבצים אקראיים לפי הסדר, החל מקובץ אחד.בחרו בכלי בחירות ביד חופשית והתוו כל כבד. לחץ Control-M כדי למדוד את האזור של כל כבד. עבור כל הכבדים שלא ניתן למדוד במדויק כי יש להם עור שיורית, חלמון, הם מחוץ לפוקוס, או לא שלמים, להכניס מדידת מציין מיקום.שמור את המידות בקובץ טקסט. כדי לבטל את ההקצנה ולנתח נתונים, פתח את קובץ המדידות ואת קובץ האקראיזציה בתוכנית גיליון אלקטרוני. הוסיפו עמודה חדשה לקובץ המידות והוסיפו את שמות הקבצים המקוריים לקבצים המסונוורים באמצעות קובץ האקראיזציה.שמור קובץ זה כקובץ המדידות הלא מרוסנות. מיין את הנתונים לפי שם הקובץ המקורי. אל תכלול מדידות כבד שעבורן תמונות לא היו מספיקות.במידת הצורך, המירו ערכי מדידה לקנה המידה הרצוי במילימטרים רבועים. פתח את סרגל קנה המידה בתוכנת עיבוד התמונה. השתמש בכלי קו ישר כדי למדוד מילימטר אחד בסולם ההיקף.תוכנת עיבוד התמונה לאחר מכן מודד באותן יחידות כמו הכבדים, נותן גורם המרה. השתמשו במקדם ההמרה להמרת מידות בקובץ 'מדידות לא מקובות'. קבע את הממוצע וסטיית התקן וחשב ערכי P.בשישה ימים לאחר ההפריה, זחלי זברה לא מהוונגיים הראו מיקום טבעי וצורה של כבד מעל המעיים. דגי זברה מהו מהודרים הגדילו באופן משמעותי את גודל הכבד בהשוואה לאחים הלא מהו מהוונגיים שלהם. כמה דוגמאות של תמונות לא מספקות מיקרומטר מוצגים כאן.זחל עם עור המכסה את הכבד, זחל עם חלמון מטשטש את הכבד, זחל עם חלקים של הכבד צבט, וזחל עם הכבד נקע ונופל, זחל עם כבד חסר, זחל עם קווי מתאר הכבד שקשה לזהות, וזחל עם מיקום לא תקין. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בתנועות קטנות ומבוקרות כדי למנוע נזק לכבד. בנוסף למיקרוסקופיה של שדה בהיר, אנו יכולים גם להשתמש בזחלים שנותרו בדרך זו, למיקרוסקופיה קונפוקאלית, כדי לדמיין חלבוני כתב פלואורסצנטיים או כתמים אימונו-פלואורסצנטיים, ולהכלאה באתרו.הפורלדהיד או PFA הוא מסרטן מרגיז וחשוד. כפפות צריך להיות משוחק בעת טיפול PFA ופתרונות מרוכזים צריך להיות מטופלים ברדס אדים כימיים.

quantifying-liver-size-larval-zebrafish-using-brightfield

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

אנו מציגים פרוטוקול ללכידת הדינמיקה של התחדשות סנפיר זנב זחל דג הזברה בקנה מידה של רקמה שלמה באמצעות סטריאומיקרוסקופיה מבוססת שדה בהיר. טכניקה זו מאפשרת ללכוד את דינמיקת ההתחדשות ברזולוציית תא בודד. ניתן להתאים מתודולוגיה זו לכל סטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמת CCD ותוכנת זמן-lapse.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור היא כלי מצוין להדמיית התפתחות עוברית. הוא מאפשר הקלטה של סרטוני זמן-lapse ארוכים של עוברים חיים בתנאים כמעט פיזיולוגיים. אנו מדגימים את היישום שלו להדמיית התפתחות עין דג הזברה על פני קני מידה רחבים מרחביים-זמניים ומציגים צינור לאיחוי ודה-קונבולוציה של מערכי נתונים מרובי תצוגות.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

דג הזברה מתגלה כמודל רב ערך של עיבוד שומנים תזונתי ומחלות מטבוליות. מתוארים פרוטוקולים של הזנת זחלים עשירה בשומנים, הדמיה חיה של אנלוגים של שומנים פלואורסצנטיים תזונתיים וכימות צריכת מזון. ניתן ליישם טכניקות אלו במגוון טכניקות סינון, הדמיה וחקירה מונעת השערות.

עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון

כאן, אנו מתארים שיטה להפחתת הגודל של עוברי דגים מבלי להפריע תהליכים התפתחותיים נורמליים. טכניקה זו מאפשרת לימוד שינוי קנה מידה וחוסן התפתחותי נגד שינוי גודל.

הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.

כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים

כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד, עם טיפים ליצירת קסנוגרפטים והנחיות לניתוח התנהגות הגידול, חיסוניות של כל ההר, וכימות הדמיה confocal.

דור של זברה דג זחל קסנוגרפטים וניתוח התנהגות הגידול

במאמר זה אנו מציגים כיצד ליצור מודל של דגי זברה הקשורים למחלת כבד שומני שאינו אלכוהולי (NAFLD) כדי לחקור את ההשפעה של עודף כולסטרול על המיקרו-סביבה של הכבד ועל הנוף של תאי מערכת החיסון.

ניתוח של מיקרו-סביבה של הכבד במהלך התקדמות מוקדמת של קרצינומה הפטוצלולרית שאינה אלכוהולית הקשורה למחלת הכבד השומני בדגי זברה

בהירות אופטית היא יתרון משמעותי לעבודה הביולוגית והפיזיולוגית של התא בדגי זברה. מתוארות שיטות חזקות למדידת צמיחת תאים בבעלי חיים בודדים המאפשרות תובנות חדשות על האופן שבו צמיחת שרירי השלד והרקמות השכנות משולבת עם צמיחת כל הגוף.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית מוח שלם in vivo של דגי זברה זחלים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת ממדי. הליך הניסוי כולל הכנת דגימה, רכישת תמונה והדמיה.

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

פרוטוקול זה משתמש בהדמיה של יריעות אור כדי לחקור את תפקוד התכווצות הלב בזחלי דגי זברה ולקבל תובנות על מכניקת הלב באמצעות מעקב אחר תאים וניתוח אינטראקטיבי.

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

למדו שיטה לכימות גודל הכבד בזחלי זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה ומדויקת של השפעות מניפולציות גנטיות ותרופתיות על התפתחות הכבד והאיברים הסמוכים.

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

גלה סרטונים נוספים