פקיעה זמן הדמיה של העכבר מקרופאג כימוטקסיס

באופן מסורתי, מקרופאגים היו קשים ללמוד בזמן אמת chemotaxis assays כי התאים הם איטיים נע. פרוטוקול זה מספק אמצעי לתמונה של מקרופאגים הנודדים במילוי הדרגתי צ'מוטקטי למשך עד שש שעות או יותר. בהשוואה למבחני שתלים כגון מבחיני העברה, טכניקה זו כוללת את היתרונות שניתן לראות במורפולוגיה מקרופאג', ו ניתן למדוד פרמטרים כגון מהירות תאים ויעילות כימוטקטית.

מקרופאגים מעורבים במחלות דלקתיות רבות, וטכניקה זו יכולה להיות שימושית כדי ללמוד תרופות שנועדו לעכב chemotaxis. זה יכול להיות מיושם גם על סוגי תאים אחרים כגון מונוציטים אנושיים. כאשר מנסים טכניקה זו בפעם הראשונה, עדיף לתרגל מילוי תאי chemotaxis לפני העבודה עם תאים.

אחד ההיבטים החשובים ביותר של הטכניקה הוא הימנעות של בועות אוויר. התחל על ידי מילוי מראש את הערוצים המחברים של שקופית chemotaxis אחת או שתיים עם RPMI 1640 HEPES מדיום שונה מוכן על פי הוראות כתב היד. מניחים שקופית לתוך צלחת תרבות התא, ולהגדיר את המנה על בלוק אלומיניום מחומם ל 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הכנס תקעים ליציאות 1 ו- 4. השתמש בקצה צינור משופע 200 מיקרוליטר להפקיד 15 microliters של RPMI 1640 HEPES מדיום שונה לתוך מילוי יציאה שלוש. לאחר מכן, הכנס את קצה הצינור ליציאה 2, ושוכך 15 מיקרוליטר בקצב מהיר למדי, אשר ימלא מראש את הערוץ המחבר, כמו גם את שני ערוצי האספקה האגף.

מכסים את יציאות המילוי שתיים ושלוש עם כובעים ומ מניחים את מגלשת chemotaxis על מתלה בתא לחות סגור בתוך אינקובטור יבש אחרת ללא פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לבודד את המקרופאגים, הכנס קטטר פלסטיק 24 מד לתוך חלל הצפי של עכבר מוקרב בן שלושה עד ארבעה חודשים, ולהשתמש מזרק פלסטיק חמישה מיליליטר כדי lavage את החלל עם תסכול מלח במאגר של האנק קר כקרח ללא סידן או מגנזיום. לאחר איסוף המדיום lavaged בצינור, צנטריפוגה אותו ב 300 פעמים G במשך 6.5 דקות.

השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב- 200 מיקרוליטרים של מדיום RPMI 1640 שעבר שינוי. לדלל aliquot של ההשעיה תאים אחד עד 20. לאחר מכן השתמש בהתקן ספירה כדי לספור את התאים.

מדללים את התאים לריכוז סופי של פי 10 עד ששת התאים למיליליטר, ושומרים עליהם ב-37 מעלות צלזיוס בבלוק אלומיניום מחומם. צינור ההשעיה התא למעלה ולמטה חמש פעמים כדי להפחית את הגושים, בעדינות להפקיד 10 microliters על הנמל שלוש של תא chemotaxis. מקם את קצה הצינור בנמל 2 וצייר באיטיות את מתלי התא לתוך הערוץ המחבר.

ברגע ההשעיה התא כבר הציג, להסיר את התקעים ביציאות 1 ו -4 כדי לעצור את הזרימה, ולמקום כובעים על כל ארבע יציאות מילוי. לאחר מכן, מניחים את מגלשות chemotaxis בתא לחות 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עד שלוש שעות. בדוק את אזור התצפית עם מיקרוסקופ הפוך.

לאחר מכן מקם תקעים ביציאות מילוי אחת ושתיים, ובדוק אם יציאה 3 מתמלאת בחלק העליון עם בינוני, ונופה מבועות אוויר. במידת הצורך, השתמש במחט מזרק סטרילית 27 מד כדי לנטרל בועות אוויר. לאחר מכן, שאף 60 מיקרוליטרים של מדיום עם צינור מכני 100 microliter, והמקום את הקצה לתוך מילוי יציאה שלוש.

השתמש בטבעת הגדרת אמצעי האחסון כדי להזריק לאט ובהתמדה את המדיום לתוך המאגר עד שהוא מגיע לראש יציאת המילוי ארבע לאחר שעה עד שתי דקות. כדי למלא את המאגר השני, הזז את התקע מהיציאה הראשונה והכנס אותו באיטיות ליציאה 3. שאף 50 מיקרוליטרים של מדיום, והכנס את קצה הצינור ליציאה 4, והזריק באיטיות את המדיום למאגר השני כך שיגיע לראש יציאת המילוי אחת אחרי אחת עד שתי דקות.

הוסיפו 495 מיקרוליטרים של צינור מיקרו-צנטריפוגה בינוני לשני מיליליטר, והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של חמש כחולות פטנט. בקצרה מערבולת את התערובת, ולאחר מכן להוסיף 5.4 microliters של עכבר רקומביננטי להשלים C5a ומערבולת שוב לערבב. ודא כי הדיכאון הרדוד בחלק העליון של הנמל אחד הוא בינוני חינם, ולהפקיד 15 microliters של כחול משלימים C5a המכיל בינוני.

לאחר מכן הכנס קצה צינור של 200 מיקרוליטר ליציאת מילוי ארבע, וסובב באיטיות את טבעת הגדרת אמצעי האחסון כדי למשוך את המדיום למאגר הנגדי. משוך אוויר לתוך העמודה האנכית הקצרה של יציאת המילוי הראשונה עד שממשק האוויר הנוזלי יהיה באמצע העמודה. לאחר מכן חבר את יציאה 1 לפני שהרים בעדינות את הצינור מהיציאה הרביעית, ודא שהשקופית נשארת במקום ונתק באיטיות את היציאה הרביעית.

כדי לבצע הדמיית זמן לשגות, למקם את השקופית chemotaxis על הבמה של מיקרוסקופ הפוך מצויד אינקובטור הבמה, ותמונה אזור התצפית עם עדשה אובייקטיבית ניגוד פאזה 10X, התמקדות lamellipodia מקרופאג. שקופית chemotaxis המשמשת למיקרוסקופ וידאו לשגות זמן של מקרופאגים צפק העכבר יש שלושה תאי chemotaxis, שלכל אחד מהם יש ארבע יציאות מילוי. תאים נזרעו באזור התצפית של כל תא.

ואחרי דגירה של שעתיים עד שלוש שעות, התאים התמלאו באיטיות במדיום. כאשר התאים באזור התצפית נבדקו, עד שני שליש מהתאים נשטפו החוצה. בדרך כלל, תאי B-1 חסידים חלשים נשטפו החוצה, והתאים הנותרים היו בעיקר מקרופאגים.

כדי להבדיל את המקרופאגים מתאים B, תאים מבודדים טריים תויגו בנוגדנים ספציפיים. המקרופאגים תויגו ב פלואורסצנטיות ירוקה, בתאי B באדום ובגרעין התא בכחול. הגירת מקרופאג' נחקרה על ידי החדרת המשלים C5a, כימואטרטנט, לאחד משני המאגרים.

מסלולי ההעברה של מקרופאגים הנודדים מעבר צבע משלים C5 נרשמו. נקודת ההתחלה של כל מסלול העברה מנורמלת ל- X שווה לאפס ו- Y שווה לאפס כדי ליצור התוויית העברה. לאחר מכן, מהירות התא והיעילות הכימותרפית של מקרופאגים בודדים חושבו.

טכניקה זו הייתה שימושית כדי ללמוד את התפקידים של תת-יוניות חלבון G, ו- Rho GTPases, ותניע מקרופאג' בכימותרפיה.