Name: צמיחת הקרנית של האדם והכבשים שכבות של תאי-על ביומטריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: למד שיטת תרבית תאי אנדותל קרנית אנושיים וכבשיים מנתחי רקמה. הפרוטוקול מונע מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי ומבטיח אספקה רציפה של תאים ראשוניים ממתן אחד לחקר רפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודות לנעמי גאורני לעזרתה במהלך הכנת איור 7. עבודה זו נתמכת על ידי מענק הפרויקט הוענק DH על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה (פרויקט גרנט 1099922), ועל ידי מימון המשלים שהתקבל קרן מכון העין קווינסלנד.

הקרנית האנושית עם הסכמת התורם למחקר התקבלו מהבנק עין קווינסלנד ובשימוש עם אישור האתיקה מתחנת המטרו דרום החולים וועדת המחקר האנושי של שירות הבריאות (HREC/07/QPAH/048). קרניות כבשים הושגו בעלי חיים מורדמים במכון המחקר הרפואי הראסטון של אוניברסיטת קווינסלנד תחת הסכם שיתוף רקמות.
1. הכנת כלי ניתוח
<ol><li>לחטא שני זוגות של מלקחיים מספר 4 השען על ידי לספוג אותם בפתרון של 70% אתנול עבור 5 דקות או על ידי אוטוקלינג אותם.</li>
</ol>2. הכנת צלחות תרבות בינונית ורקמה
<ol><li>הכינו 100 mL של מדיום התרבות המכיל Opti-הזיכרון 1 (1x) + גלוטמקס-1, 5% סרום העובר העוברי ו 100 U/mL עט/דלקת. זה בינוני התרבות הוא מתאים לתרבויות הקרנית כבשים בתאי האנדותל, עם זאת, עבור תרבויות תא הקרנית האדם המדיום צריך להיות שיושלם עם 50 μg/mL בלוטת יותרת הבלוטת הפרה, 0.08% כונדרויטין סולפט, 200 μg/mL סידן כלוריד ו 0.3 מ"מ חומצה אסקורבית 2-פוספט. ניתן לאחסן את בינוני התרבות בחשכה ב-4 ° c לשבועיים.</li>
	<li>לחלוק את הבארות של לוחית 6-היטב התרבות רקמה עם קובץ מצורף פקטור באמצעות הוראות היצרן ולאחר מכן להוסיף 1 מ ל של התרבות הבינונית כל באר מצופה. . הכינו באר אחת לקרנית</li>
</ol>3. לחקור ניתוח והליכי התרבות של התא
<ol><li>מניחים את הקרנית, מעלה האנדותל, לתוך צלחת פטרי סטרילית על הבמה של מיקרוסקופ מבתר. התאימו את התאורה כך שמשטח הקרניות יהיה מואר היטב בניגוד מספיק כדי להדגיש את שכבת האנדותל. התאימו את הזום כך שהקצה ומספר הקרניות המרכזיות יהיו בתצוגה.</li>
	<li>השתמש מלקחיים השען מעוקר כדי להרים בעדינות ולקרוע את הקרום של הורד הרחק מן הסטרומה הבסיסית (איור 1). הקרום יהיה להתנתק מסטרומה כמו רצועה כי מיד התלתלים. מניחים את הרצועה לתוך באר אחת של לוחית התרבות של 6-היטב עם רקמה שהיתה מצופה בפקטור מצורף ומכילה 1 מ ל של תרבות בינונית. את המכסה של צלחת התרבות רקמה יש לשמור על כל הזמן, למעט כאשר explants מתווספים אליו, כדי להפחית את הסיכון לזיהום.</li>
	<li>הסירו רצועות מקרום הממברנה מהפריפריה הקיצונית של האנדותל קודם ולאחר מכן מאזורים מרכזיים מאוחר יותר. מניחים את כל הרצועות מקרנית אחת לבאר אחת בתוך צלחת 6-הבאר.</li>
	<li>מודלת את האקסוצמחים בחממה תרבותית מחולל לחות הגדר ב 5% CO2 ו 37 ° c. להשאיר את התרבות ללא הפרעה במשך יומיים כדי לאפשר explants להתיישב ולצרף למשטח הצלחת. בדרך כלל, עד שליש מהשתילים. לא מצליחים להתחבר ללוחית</li>
	<li>הסר את המדיום ואת כל ההרחבות מחובר מהתרבות לאחר 4 ימים בעדינות להוסיף 2 מ ל של התרבות הטרייה בינונית לוקח טיפול לא להפריע explants מצורפים. יש לשנות את התרבות בינונית פעמיים בשבוע.</li>
</ol>4. הפקה רציפה של תאי הקרנית על ידי תרבות ההסבר הטורית
הערה: ניתן להעביר את האקכורים ללוחות של תרבית רקמות טריות לאחר 10 ימים להקמת תרביות תאים נוספות של הקרנית.
<ol><li>מניחים את תרבות ההסבר על הבמה של מיקרוסקופ מבתר ומתאימים את התאורה והזום כך שניתן לראות את האקסוצמחים.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים שען מעוקר, לקטוף בעדינות כל לחקור את לוחית התרבות שלה ולהעביר אותו היטב טרי של צלחת התרבות 6-גם רקמה כי כבר מצופה עם מקדם קובץ מצורף ומכיל 1 mL של מדיום התרבות.</li>
	<li>אפשר explants להתיישב על פני השטח של הצלחת החדשה שלהם במשך 4 ימים לפני החלפת מדיום התרבות עם 2 מ ל של מדיום תרבות טרייה. שנה את בינונית התרבות השתנתה פעמיים בשבוע.</li>
</ol>5. הגדלת תאים אנדותל הקרנית על שמיכות זכוכית עבור ניתוח מאימונוללואונציה
הערה: תרביות תאים שנועדו להיות מנותח באמצעות immunofluorescence יש להקים על שמיכות זכוכית שניתן לרכוב על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בעקבות הליך הצביעת.
<ol><li>לחטא חפיסה של שמיכות זכוכית עגולות של קוטר 13 מ"מ ב החיטוי או על ידי הטבילה ב 70% אתנול עבור 15 דקות ואחריו שלושה טיפות מלוחים באגירה פוספט (PBS).</li>
	<li>המקום שמיכות בודדות לתוך הבארות של לוח 24-היטב של תרבות הרקמה, לחלוק אותם עם מקדם קובץ מצורף, ולאחר מכן להוסיף 0.5 mL של התרבות בינונית לכל טוב.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים שען מעוקר להסיר explants מלוחות התרבות שלהם רקמה ולהעביר אותם בארות המכילות coverslips. אפשר explants להתיישב על הכיסויים 4 ימים לפני שינוי המדיום.</li>
	<li>לאחר תקופת הדגירה הנדרשת, לתקן ולהכתים את התרבויות שמיכות בתוך בארות התרבות שלהם. הר הוכתם שמיכות על מיקרוסקופ זכוכית שקופיות לניתוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית.</li>
</ol>6. תת-תרבות של תאי הקרנית באמצעות Dispase השני
הערה: תאים fibroblastic גדולים ניתן להסיר באופן סלקטיבי מתרבויות ההסבר ב 6-היטב צלחות לפני subculturing באמצעות הליך זה. אם כל התאים יהיו משניים, אל תבצע את השלבים 6.2 עד 6.4. מטרת הליך זה היא להעביר את התאים ללוחות טריים תוך שמירה על אנשי הקשר שלהם לתא-לתא ככל האפשר. התאים צריכים להיות מטופלים בעדינות. בארות שוטפת לחלוטין צריך להיות מיושן ביחס של 1:2, בעוד בארות subconfluent צריך להיות מיושן ביחס של 1:1 או פחות.
<ol><li>הסר את המדיום מן התרבות ולשטוף בקצרה עם DPBS.</li>
	<li>הוסף 1 מ ל של Versene. . בטמפרטורת החדר במשך 30 ס מ</li>
	<li>הסר את הversene והוסף 1 מ ל של טרילול. מודטה ב 37 ° c בחממה לתרבות רקמות במשך 3 דקות.</li>
	<li>צפו בתרבות בעזרת מיקרוסקופ לעומת פאזה. הקש בעדינות על התרבות כדי להוציא תאים מהצלחת. ברגע שהתאים הfibroblastic הגדולים מנותקים מהצלחת להסיר אותם ואת הטרילה באמצעות הפיפטה 1 mL. שטוף טרילול שיורית את התאים הנותרים על ידי שטיפה פעמיים עם 2 מ ל של DPBS.</li>
	<li>הוסף 1 מ ג של 1 מ"ג/mL Dispase II אל התרבות, הדגירה בחממה תרבות הרקמה עבור 1 עד 2 h או עד כל התאים התנתק מן הצלחת. התאים צריכים לרחף בהדרגה מן הצלחת במקבצים.</li>
	<li>לאסוף את התאים באמצעות מנקז 1 mL ולהעביר 20 מ ל של DPBS בתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסירו את הסופרנטאנט והשהה בעדינות את הגלולה הסלולרית בעזרת מפית מ-mL ב-1 מ ג של התרבות הבינונית. העבר את ההשעיה התא אל אחת או שתי בארות של צלחת 6-היטב, למעבר ביחס של או 1:1 או 1:2 בהתאמה.</li>
	<li>למעלה את המדיום בכל באר לעשות 2 מ ל ולמקם את התרבויות לתוך החממה תרבות רקמות. החלף את המדיום עם 2 מ ל של מדיום טרי פעמיים בשבוע.</li>
</ol>7. צמיחת שכבות של תאי הקרנית על גבי ממברנות
הערה: הפרוצדורה הבאה מתארת את השלבים המעורבים בהרכבה של חומר ביוקרומי במכשיר הרכבה מותאם אישית-הנקרא תא מיקרו-בוידן-לתרבות התא. נאלעיין בפרסום האחרון שלנו לקבלת מידע נוסף על המכשיר ולרכישת פרטים.
<ol><li>הרכיבו את החדר העליון של חדר המיקרו-בוידן באמצעות הצבת טבעת אדומה למרכזו.</li>
	<li>השתמש בטפין בקוטר 18 מ"מ כדי לחבוט בדיסק מתוך גיליון ביואטי על גבי קרש חיתוך פוליארביואתילן. מניחים את הדיסק מעל הטבעת האדומה בחדר העליון של החדר של מיקרו-בוידן.</li>
	<li>, לעזאזל עם החדר התחתון לחדר העליון. ולאבטח את הדיסקית באמצע</li>
	<li>להשרות את החדר התאספו micro-Boyden ב 70% אתנול עבור 1 h כדי לעקר אותו.</li>
	<li>לטבול לחלוטין את החדר התאספו מיקרו-Boyden ב HBSS סטרילי עבור 10 דקות כדי להסיר את האתנול. חזור על שלב השטיפה פעמיים. בצע כביסה הסופי צעד עבור 10 דקות בינונית תרבות ללא תוספת.</li>
	<li>להעביר את החדר מיקרו-Boyden מעוקר לתווך התרבות בבאר של 6-היטב צלחת להבטיח כי החדר העליון הוא כלפי מעבר. התאימו את רמת התווך התרבותי כך שהוא ייצור קשר עם המשטח התחתון של קרום הרפידה, אך לא יזרום לתוך התא העליון.</li>
	<li>הכן השעיה של תאי הקרנית אנדותל באמצעות ההליך המתואר בסעיף 6. צפיפות תאים מספקת בהשעיה צריך להיות מושגת כדי לאפשר צפיפות הזריעה של לפחות 100,000 תאים לכל ס מ2 על קרום בחדר Micro-boyden. שטח התרבות בתוך החדר מיקרו-Boyden הוא 0.5 ס"מ2 וזה יכול להכיל נפח של 100 μl. לכן, השעיה המכילה 500,000 תאים/mL צריך להיות מוכן.</li>
	<li>פיפטה 100 μL של השעיית תא (50,000 תאים) אל הקרום בחדר מיקרו-Boyden. מודטה בחממה תרבות הרקמה עבור 4 שעות לפני הציפוי בינוני כדי להטביע לחלוטין את החדר. מודאת התרבות לפרק זמן הנדרש, החלפת המדיום פעמיים בשבוע. הערה: ברגע שתאי הקרנית של הקרניות מחוברים למשטח העליון של קרום הממברנה, ניתן להפוך את חדר המיקרו-בוידן בתוך התרבות, כך שהחדר התחתון יהיה כלפי מעבר. תאים נוספים ניתן להוסיף לחדר כדי ליזום תרביות תאים על פני השטח השני של קרום. לדוגמה, תאים סטרומה הקרנית ניתן להחיל בקלות על משטח חלופי ובכך לחקות את המיקום היחסי של סוגי תא הקרנית כפי שניתן לראות בתוך הקרנית האחורי.</li>
</ol>

<ol><li>Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+Review+and+Update+of+Surgical+Treatment+for+Corneal+Endothelial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases.</a> Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).</li>
<li>Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Corneal transplantation.</a> The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).</li>
<li>Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+issues+for+human+corneal+endothelial+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regnerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).</li>
<li>Senoo, T., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle+Kinetics+in+Corneal+Endothelium+from+Old+and+Young+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).</li>
<li>Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).</li>
<li>Harkin, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+of+Biomaterials+for+Use+in+Ophthalmic+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies.</a> Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).</li>
<li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).</li>
<li>Walshe, J., Harkin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+explant+culture+provides+novel+insights+into+the+potential+location+and+phenotype+of+corneal+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells.</a> Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).</li>
<li>Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+corneal+endothelial+cells+from+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cultivation of corneal endothelial cells from sheep.</a> Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).</li>
<li>Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+An+Update+on+the+Culture+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).</li>
<li>Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+human+corneal+endothelial+cells+isolated+from+paired+donor+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas.</a> PLoS One. 6 (12), 28310(2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

אתגר טכני משמעותי הקשור להקמת והרחבת תאי הקרנית האנושית של הקרניות מונע מצוות החירום להתרחש בתרבויות. החובשים יכולים להיות מופעלות בתאי הקרנית בתוך התאים על ידי אובדן מגע תא אל התא, אך רוב הפרוטוקולים של תרבות התא עבור תאים אלה כרוך דיסוציאציה אנזימטית לתאים בודדים במהלך בידוד ותת-תרבות10. כאן אנו מציגים פרוטוקול אלטרנטיבי של תרבות התאים עבור תאי הקרניות הרתל, המקטינה את הסיכון לתאים מאבדים קשר אחד עם השני במהלך הבידוד ושלבי תת-תרבות.
השיטה שלנו להקמת תרביות תאים של הקר...

הקרנית היא רקמה שקופה הממוקמת בקדמת העין. הוא מורכב משלוש שכבות עיקריות: שכבת אפיתל על המשטח החיצוני, שכבת משתית אמצעית, ושכבה פנימית בשם הקרנית אנדותל. אנדותל הקרנית הוא מונייר של תאים היושבים על קרום מרתף בשם הקרום של הספר, והוא שומר על השקיפות של הקרנית על ידי ויסות כמות הנוזל המוסיפה את הסטרומה מההומור המשמש כבסיס. יותר מדי נוזל בתוך משתית גורם נפיחות הקרנית, אטימות אובדן ראייה. לכן האנדותל חיוני לשמירה על הראייה.
האנדותל הקרנית יכולה להיות מתפקדת בגלל מספר סיבות, כולל הזדקנות, מחלה ופציעה, והטיפול הנוכחי היחיד הוא ניתוח השתלה. במהלך ניתוח זה, מסירים האנדותל והממברנה של המטופל את הקרנית ומוחלפים בשתל של אנדותל והקרום של האישה המתקבלת מקרנית של התורם. שתלי אנדותל רבים מכילים גם שכבה דקה של רקמת סטרומה כדי לסייע לטיפול המצורף הקרנית המארחת1.
ברחבי העולם, הביקוש של רקמת תורם הקרנית לניתוחי השתלה גדול יותר מהכמות שניתן לספק על ידי בנקים עין2. יש אפוא כונן לפתח השתלות רקמה הנדסה אנדותל שיכול לשמש כדי להקל על הגרעון הזה3. הרציונל של זה מבוסס על העובדה כיום, אנדותל מן הקרנית הפרט יכול להיות רק מועבר לחולה יחיד, עם זאת, אם התאים האנדותל הקרנית התרחבו הראשון וגדל על ביוקפלי החומר בתרבית רקמות, הם יכולים לשמש לטיפול בחולים מרובים.
האתגרים העיקריים כי צריך להיות ממוען לפני השתלת רקמות מהונדסים הקרנית אנדותל להפוך אופציה אפשרית עבור מנתחים כוללים: (1) הקמת טכניקות להרחבת תאים אנדותל הקרנית באיכות גבוהה להפקת בוגרת ו הקרנית פונקציונלי שכבות תא אנדותל מבחנה, ו (2) הקמת טכניקות לגידול התאים על מקפלים ביוטומטל לייצר שתלי רקמות מהונדסים כי הם שווים, או טוב יותר, שתלי קרנית נגזר התורם המשמשים כיום.
תאים הקרנית אנדותל יש פוטנציאל מתרבים נמוך מאוד vivo אבל יכול להיות מגורה כדי לחלק בתוך מבחנה4. למרות זאת, יש להם נטייה חזקה לעבור במעבר האפיתל-אל-מסנצ'יאל (חובש), המפחית את יכולתם ליצור שכבת אנדותל בוגרת ופונקציונלית. הגורמים המוכרים לחובשים בתאי הקרנית של הקרניות כוללים חשיפה לגורמי גדילה מסויימים ואובדן של מגע תא-אל-תא5. זה כמעט בלתי נמנע כי הקרנית התרביות התאים האנדותל כי הם מנוכה אנזימטי במהלך תת-תרבות יעברו שינויים הקשורים פרמדיק. כאן, אנו מציגים שיטה של תרבות התא עבור תאים אנושיים או כבשים הקרנית לתאי שנועד למזער את ההפרעה של הקשר תא אל התא במהלך בידוד, בשלבים הרחבה ותת-בית, כדי להפחית את הפוטנציאל של חובש. יתר על כן, אנו מדגימים כיצד רקמות הנדסה שתלים הדומות לקרנית הנגזרת של ממברנה/שתלי רקמת העור/מסטרומה של הרקמה ניתן לייצר על ידי גידול שכבות התא מתורבת בשני הצדדים של קרום ביומטריה במכשיר מותאם אישית הרכבה.

<table><tbody><tr><td>גורם התקשרות</td><td>Gibco</td><td>S006100</td><td>תמיסה סטרילית פי 1 המכילה ג'לטין המשמשת לציפוי משטחי תרבית רקמות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>תמצית יותרת המוח של בקר</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>בקבוקון יחיד מכיל 25 מ"ג. להקפיא בכמויות.</td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>Merck</td><td>C5670</td><td>מתמוסס ב-HBSS ליצירת תמיסת מלאי של 1 מ"מ. מסנן סטריליז.</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה, 50 מ"ל</td><td>Labtek</td><td>650.550.050</td><td></td></tr><tr><td>כונדרויטין סולפט</td><td>מעבדות LKT</td><td>C2960</td><td>זהו כונדרויטין סולפט בקר. ממיסים ב-HBSS ליצירת תמיסת מלאי של 0.08 גרם/מ"ל. מסננים, מעקרים ומקפיאים בקליקוטות.</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>מתמוסס ב-DPBS ליצירת תמיסת מלאי של 2 מ"ג/מ"ל. מסננים, מעקרים ומקפיאים בקליקוטות.</td></tr><tr>יש לדלל <td>אתנול</td><td>Labtek</td><td>EA043</td><td>100% אתנול לא מפורק ל-70% במים נטולי יונים לעיקור מכשירים ומשטחים.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>GE Healthcare Australia Pty Ltd</td><td>SH30084.03</td><td>זהו מותג HyClone של סרום בקר עוברי.</td></tr><tr><td>כיסוי מס' 1, ואוסלאש; 13 מ"מ</td><td>Proscitech</td><td>G401-13</td><td>הנח את הכיסוי המעוקר לתוך צלחות של 24 בארות לתרבית רקמות.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק, 1X, המכילה סידן כלורי ומגנזיום כלוריד.</td></tr><tr><td>חומצה L-אסקורבית 2-פוספט</td><td>Merck</td><td>A8960</td><td>מתמוסס ב-HBSS ליצירת תמיסת מלאי של 150 מ"מ. מסנן סטריליז.</td></tr><tr><td>מיקרו-בוידן תא</td><td>CNC רכיבי Pty. בע"מ</td><td>טבעת עליונה: QUT-0002-0006, טבעת בסיס: QUT-0002-0007</td><td>שני הרכיבים עשויים מפוליטטרפלואורואתלין (PTFE).</td></tr><tr><td>טבעת O לתא מיקרו-בוידן</td>, <td>Ludowici Sealing Solutions</td><td>RSB012</td><td>מורכב מגומי סיליקון.</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>51985-034</td><td>מדיום סרום מופחת המכיל גלוטמין.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco, 1X, ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד.</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>תמיסת אנטיביוטיקה 100X המכילה 10,000 יחידות/מ"ל פניצילין ו-10,000 ומיקרו; גרם/מ"ל סטרפטומיצין.</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>Sarstedt</td><td>82.14473.001</td><td>צלחת פטרי סטרילית, 92X16 מ"מ, לדיסקציה של רקמות.</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות, 24 בארות</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3524</td><td>צלחת המכילה 24 בארות, כל אחת בשטח פנים של 2 ס"מ 2.</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות, 6 בארות</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3516</td><td>צלחת המכילה 6 בארות, כל אחת בשטח פנים של 9 ס"מ 2.</td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>תמיסת אנזים 1X לניתוק תאים.</td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-066</td><td>תמיסת EDTA 1X לניתוק תאים.</td></tr><tr><td>מלקחיים של שען</td><td>Labtek</td><td>BWMF4</td><td>Number 4 מלקחיים של שען עובדים היטב להסרת רצועות של קרום אנדותל/דסמט מהקרניות.</td></tr></tbody></table>

צמיחת הקרנית של האדם והכבשים שכבות של תאי-על ביומטריה

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

לתרביות תאים של הקרנית אנדותל יש נטייה לעבור מעבר אפיתל-אל-mesenchymal (חובש) לאחר אובדן של קשר תא לתאים. צוות החירום מקטין את התאים כאשר הוא מפחית את יכולתם ליצור שכבת בוגרת ופונקציונלית. כאן, אנו מציגים שיטה להקמת ולתת האנושית וכבשים הקרנית מתרביות תאים אנדותל ממזער את אובדן של מגע תא אל התא. הקרום של ממברנה של הקרנית אנדותל/הורד באמת נלקח מקרניות תורמות וממוקמות בתוך התרבות הרקמה בתנאים המאפשרים לתאים להגר באופן קולקטיבי אל משטח התרבות. לאחר הקמת תרבות, האקסוצמחים מועברים לצלחות טריות כדי ליזום תרבויות חדשות. Dispase II משמש כדי להרים בעדינות גושים של תאים מתוך לוחיות התרבות רקמות עבור subculturing. תרביות תאים של הקרנית אנדותל אשר הוקמו באמצעות פרוטוקול זה מתאימים להעברת לממברנות ביואטימי כדי לייצר שכבות תא רקמות מהונדסים להשתלה בניסויים בבעלי חיים. מכשיר בהזמנה מותאמת אישית לתמיכה ביואגמי-ממברנות במהלך תרבות הרקמה מתואר ודוגמה של השתלת רקמה מהונדסים מורכב שכבה של תאי הקרנית אנדותל ושכבה של תאים סטרומה הקרנית משני צדי סוג של קולגן אני הממברנה מוצג.

השיטה לבידוד והרחבה של תאי הקרנית מתוך הקרניות האנושיות או הכבשים מסוכמות באיור 1 ובאיור 2. רוב האקכורים הנגזרים מן הקרניות 1 עד 2-בן כבשים או תורמים אנושיים של פחות מ -30 שנים של גיל יהיה לצרף את מארז מצופה לוחיות העור בתוך שבוע, עם זאת, זה לא יוצא דופן לגלות כי עד שליש מהצומח להיכשל לצרף בזמן הזה. אלה "צף" explants ניתן להסיר מן התרבויות. הרחבות של תורמים אנושיים מעל גיל 30 שנים פחות סביר לצרף לצלחת וגם פחות סביר לייצר תרביות תאים. תמונות מייצגות של תרביות תא ...

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הקריטיים הנדרשים כדי ליצור ולגדל תרביות תאים של הקרנית מפני הצמח של רקמת האדם או הכבשים. שיטה לתאי הקרנית משנית של תאים אנדותל על קרומי ביוארילים מוצג גם.

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

פרוטוקול זה של תרבות התאים נועד למנוע מתאי אנדותל הקרנית לעבור מעבר אפיתל למצ'ימלי במהלך בידוד, התרחבות ותת-תרבות. תרבות תאים הוקמו ממפזרי רקמת הקרנית, אשר ניתן לעשות בהם שימוש חוזר כדי להבטיח אספקה מתמשכת של תאים ראשוניים מתורם אחד. התחל על ידי ציפוי בארות של צלחת תרבות רקמות שש באר עם גורם מצורף באמצעות הוראות היצרן.לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של תרבות בינוני לכל מקודד היטב. מניחים את צד אנדותל הקרנית לתוך צלחת פטרי סטרילית על הבמה של מיקרוסקופ ניתוח. התאימו את התאורה כך שמשטח הקרנית מואר היטב עם ניגודיות מספקת כדי להדגיש את שכבת ה אנדותל, והתאימה את הזום כך שהקצה וקצת אנדותל קרנית מרכזי נמצאים בתצוגה.השתמש במטלות השען הסטריליות כדי להרים בעדינות ולקרוע את הממברנה של דסמט הרחק מהסטרומה שמתחת. מניחים את רצועת הממברנה לתוך אחת בארות מוכנות של צלחת התרבות, הקפדה מיד להחליף את המכסה של הצלחת כדי להפחית את הסיכון לזיהום. הסר תחילה את רצועות הקרום של דסמט מהפריפריה הקיצונית של ה אנדותל, ומתוך אזורי המרכז מאוחר יותר, והצב את כל הרצועות מקורנית אחת לתוך באר אחת.בסיום, האינקובטים באינקובטור לתרבות תאים לחים נקבעים על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. להרכיב את התא העליון של תא בוידן מיקרו על ידי הצבת טבעת O אדום למרכזו. השתמש טרפין בקוטר 18 מילימטר כדי אגרוף החוצה דיסק מתוך גיליון ביו על קרש חיתוך PTFE.לאחר מכן, מניחים את הדיסק מעל טבעת O האדומה בתא העליון של תא המיקרו בוידן. בורג התא התחתון לתא העליון, אבטחת הדיסק של החומר הביולוגי בין לבין. ולהשרות את תא המיקרו בוידן שהורכב באתנול של 70% למשך שעה כדי לעקר אותו.לאחר השרייה, לחלוטין לטבול את התא HBSS סטרילי במשך 10 דקות כדי להסיר את האתנול. ואז לשטוף את התא במדיום תרבות במשך 10 דקות. ולהעביר למדיום תרבות בתוך באר של צלחת שש בארות, לוודא כי התא העליון מכוון כלפי מעלה.התאימו את רמת המדיום כך שיגעו במשטח התחתון של הממברנה הביו-חומרית, אך לא יזרמו לתא העליון. פיפטה 100 מיקרוליטרים של השעיית תאים על הממברנה לתוך תא המיקרו בוידן, ודגירה אותו באינקובטור תרבות הרקמה במשך ארבע שעות, לפני הוספת בינוני כדי להטביע לחלוטין את התא. רוב ההתפוצצויות שנגזרו מהקרניות של כבשה בת שנה עד שנתיים או תורמים אנושיים בני פחות מ-30 נקשרו לצלחות תרבות רקמה מקודדות של גורם מצורף בתוך שבוע.לאחר שישה שבועות, תאים קטנים רבים, ארוזים היטב היו נוכחים ליד explant. תאים קטנים ועמוסים היטב בתוך תרבות תאי ה אנדותל הקרנית עמידים לעיכול עם פי שלושה, בעוד שתאים פיברובלסטיים גדולים יותר רגישים יותר אליו. הבדל זה נוצל כדי להסיר באופן סלקטיבי תאים גדולים מהתרבויות לפני העברת התאים הקטנים יותר לצלחות חדשות.ניתוחי קמח חיסוני נערכו על תרבות תאי אנדותל הקרנית כדי לאתר ZO-1, חלבון צומת הדוק, ו- N-cadherin, חלבון צומת דבקות. אותם נוגדנים שימשו הן לכבשים והן לתאים אנושיים, ושני החלבונים התגלו בקרום הפלזמה של תאים משני המינים. תא המיקרו בוידן המותאם אישית איפשר לשני צידי הממברנה לשמש כמשטחים של תרבות תאים בו זמנית.מבט חוצה חתך של מבנה תא מהונדס רקמה מראה שכבה אחת של תאי אנדותל הקרנית על משטח אחד, ותרבות רב שכבתית של תאים סטרומה הקרנית על השני. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב להימנע מגרד את האנדותל עם המדפים שלך כאשר אתה מקלף את הקרום של Descemet מהקרנית. בעקבות הליך זה, את השלמות של שכבת תא אנדותל הקרנית על קרום ניתן לבדוק על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית שלה.

growth-human-sheep-corneal-endothelial-cell-layers-on-biomaterial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

אנו מדווחים טכניקה לייצור של micropockets בתוך ממברנות electrospun בי ללמוד התנהגות תא. באופן ספציפי, אנו מתארים שילוב של microstereolithography וelectrospinning לייצור PLGA (פולי (lactide-CO-glycolide)) ההתקנים ביולוגי קרני מצוידים בmicrofeatures.

שילוב של Microstereolithography וElectrospinning כדי לייצר ממברנות מצויד בגומחות להתחדשות קרנית

דוגמה לטיפול גנטי אדנו-ויראלי בקרניות אנושיות בתרבית איברים סוכרתיים מוצגת לקראת נורמליזציה של ריפוי פצעים מושהה והפחתה ניכרת בביטוי סמני תאי גזע אפיתל בקרניות אלה. הוא גם מתאר את האופטימיזציה של תהליך זה בתרביות אפיתל לימבליות מועשרות בתאי גזע.

תרפיה adenoviral ג&#39;ין עבור סוכרתית keratopathy: השפעות על ריפוי פצע גזע ביטוי נייד מרקר ב קרניות אדם איברים בתרבית תאים לימבלית אפיתל

תרבות עיקרית של תאי אנדותל קרניים שור שמשה לחקור את המנגנון של מעבר אנדותל-mesenchymal הקרני. יתר על כן, מודל cryoinjury האנדותל עכברוש הקרני שמש להפגין מעבר אנדותל-mesenchymal קרני in vivo.

במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

פרוטוקול זה מתאר את הרומן תלת מימדי במבחנה מודל, שבו תאי סטרומה הקרנית ואת תאים עצביים מתורבתים יחד כדי לסייע בדיקה והבנה של האינטראקציות של תא שני הסוגים.

הנדסת רקמות הקרנית: במבחנה מודל של אינטראקציות סטרומה-עצב של הקרנית האנושית

אנו מתארים שיטה להנדס רקמת רשתית מורכב של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית על גבי קרום מי השפיר האנושי והכנה שלו הרכבה במודלים של בעלי חיים.

הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים

פרוטוקול עבור אקסית vivo איברים הקרנית תרבות מודל שימושי עבור לימודי ריפוי הפצע מתואר. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של סוכני כדי לקדם ריפוי משובי או רעילות התרופה סביבה מאורגנת multicellular תלת-ממד.

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד להכנה וטיפוח של כפתורי הקרנית מפוצל חזירי מוצג. כמו זה אורגאנו-מעובד בדרך כלל מודל תרבות האיברים מראה שיעורי מוות של תאים בתוך 15 ימים, המקבילה לקרנית התורם האנושי, הוא מייצג את המודל הראשון המאפשר טיפוח לטווח ארוך של קרניות לא אנושיות מבלי להוסיף דקטרן רעיל.

מודל של הקרנית של הקרניות הפותל באמצעות לחצני הקרנית מפוצלת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתק את תאי הקרניות של הקרנית (CEC) מהקרום של האישה (DM) באמצעות "YAG" (בלייזר) של ממברנה הvivo לשעבר של המחלה של keratopathy בולולס (BK).

פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל

Stripping Only של Descemet הוא הליך ניסיוני שבו מטופלים עם גוטה מרכזית של הקרנית כתוצאה מדיסטרופיה של האנדותל של פוקס פשטו את הממברנה של Descemet עבור תאים היקפיים כדי לחדש את שכבת האנדותל. אנו מציגים מתודולוגיה חדשנית המדמה DSO בקרניות אנושיות דיסטרופיות ex vivo עם ריפוי מואץ המעורר על ידי eFGF1 (NM141).

מודל תרבית איברי הקרנית האנושית של הפשטת Descemet רק עם ריפוי מואץ מגורה על ידי גורם גדילה פיברובלסט מהונדס 1

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשגת תליות חד-תאיות איכותיות מקרניות עכבר שלמות באמצעות עיכול רציף עם קולגנאז A וטריפסין. שיטה זו מניבה תאים בודדים ברי קיימא עם שלמות RNA גבוהה, מה שהופך אותם לתואמים ליישומים בהמשך כמו ריצוף RNA חד-תאי וציטומטרי זרימהy.

פרוטוקול לאיסוף תלייה חד-תאית מקרנית עכברים

למד שיטת תרבית תאי אנדותל קרנית אנושיים וכבשיים מנתחי רקמה. הפרוטוקול מונע מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי ומבטיח אספקה רציפה של תאים ראשוניים ממתן אחד לחקר רפואה רגנרטיבית.

צמיחת הקרנית של האדם והכבשים שכבות של תאי-על ביומטריה

גלה סרטונים נוספים