Name: קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: למדו כיצד לכמת רמות אתנול בעוברי זברה דניו רריו באמצעות כרומטוגרפיית גז החלל הראשי. שיטה זו מאפשרת מדידה מהירה וחוזרת של פרמקוקינטיקת האתנול בפיתוח עוברי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר המוצג במאמר זה היה נתמך על ידי מענקים קודמים מן המכונים הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי לרפואת שיניים ומחקר הגולגולת (NIH/נדבך) R01DE020884 ל J.K.E. והמכון הלאומי לבריאות/המכון הלאומי על אלכוהול התעללות ואלכוהוליזם (NIH/NIAAA) F32AA021320 כדי C.B.L. ועל ידי המענק הנוכחי מן המוסדות הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי על אלכוהול התעללות (NIH/NIAAA) R00AA023560 כדי C.B.L. אנו מודים לרואבן גונזלס למתן ולסייע בניתוח כרומוטוגרף גז. אנחנו מודים לטיטנה בונטיקוס. וד ר ג'ינה נובלס כותבים עזרה

כל העוברים דגים בשימוש בהליך זה הועלו והתרבו בעקבות הוקמה פרוטוקולים IACUC27. פרוטוקולים אלה אושרו על ידי אוניברסיטת טקסס באוסטין ובאוניברסיטת לואיוויל.
הערה: קו הדגים Tg (fli1: EGFP)y1 שימש במחקר זה28. כל המים המשמשים בהליך זה הוא סטרילי מים אוסמוזה הפוכה. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות ה8.2.1 מנסרה.
1. הפיכת מדיה לעובר
<ol><li>כדי להפוך את מלאי 20x של מדיה העובר, לפזר 17.5 g של הנרוג, 0.75 g של KCl, 2.9 g של CaCl2, 0.41 g של K2hpo4, 0.142 g של NA2Hpo4, ו 4.9 g של mgso4· 7h2O ב 1 ליטר של מים. התעלם מהזרז הלבן בטפסים; פעולה זו לא תשפיע על המדיה. המסנן מעקר את פתרון המניה ומאחסן אותו ב-4 ° c.</li>
	<li>כדי ליצור את פתרון המדיה העובר עובד, לפזר 1.2 g של נחקו3 ב 1 L של 20x העובר מניות מדיה ולהוסיף 19 L של מים. שמרו על פתרון המדיה של העובר הפועל ב -28 ° c.</li>
</ol>2. מדידת נפח עובריים באמצעות הזחה במים
הערה: בפרוטוקול זה, משמשות 24 שעות הפריה (hpf) עוברים (איור 1). העוברים המשמשים במדידות אמצעי האחסון אינם משמשים בניתוח האתנול.
<ol><li>מקום 10 עוברים ונוזלים מתחלקים ב 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה מסומן בנפח של 250 μL (איור 2א). הוסיפו מים לקו המילוי של 250 μL (ראו דגימת מים צבועים באיור 2ב').</li>
	<li>חזור על שלב 2.1 כדי להגדיר את נפחים עבור עוברים שהוסרו מורמונים.<ol>
<li>כדי להסיר את chorion, למקם את העוברים בתוך כורכותיהם בצלחת פטרי 100 מ"מ עם 2 מ"ג/mL של קוקטייל פרוטאז במדיה העובר בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות. כל כמה דקות, מערבולת בעדינות את העוברים כדי לשבור את הצ.</li>
		<li>לאחר כל העוברים הם חופשיים chorion שלהם, להסיר את העוברים מתוך מדיה העובר הפרוטאז/קוקטייל מקום חדש 100 מ"מ צלחת פטרי עם מדיית העובר טרי לשטוף את העוברים. חזור על השטיפה הזאת עוד פעם אחת (בסכום של 2 שטיפות). העבירו את העוברים לצלחת פטרי חדשה 100 מ"מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעזרת הטיפ הקטן ביותר האפשרי ומבלי לפגוע בעוברים, הסירו בזהירות את כל הנוזלים מסביב לעוברים באמצעות p200 מיקרופיפיאור (איור 2ג) ושוקלים את המים בקנה מידה עם &lt; 0.1 מ ג בדיוק. כדי לקבוע את נפח המדגם של 10 עוברים, להפחית את המשקל/הנפח של המים (1 mL של מים = 1 גרם של מים.) הוסרו מ 250 μL. כדי לקבוע את הנפח של העובר בודד, לחלק את ההפרש בין 250 μL ואת משקל המים הוסרו על ידי 10.</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ01.jpg">
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ02.jpg">
3. טיפול בעוברים באתנול
<ol><li>אסוף עוברים ממיכלי ההזדווגות ומקום בצלחת פטרי 100 מ"מ סטנדרטית. לספור את לא יותר מ 100 עוברים לכל צלחת פטרי אחת הדגירה ב 28.5 ° c. הערה: אם chorion יוסר (שלב 2.2), זה צריך להיות מוסר לפני הוספת אתנול.</li>
	<li>ב 6 hpf, להוסיף עד 100 עוברים תקן חדש 100 מ"מ צלחת פטרי או עם העובר מדיה או העובר מדיה + 1% אתנול (v/v). כיסוי, אבל לא לאטום את צלחת פטרי. מניחים את העוברים בחממה הטמפ ' הנמוכה שנקבעה ב-28.5 ° צ' למשך 18 שעות, או עד שהעוברים יגיעו לנקודת הזמן ההתפתחותית של 24 hpf.</li>
</ol>4. הכנת זרימת עבודה לפני עיבוד העוברים עבור גז החלל הראשי כרומטוגרפיה
<ol><li>לעשות פתרון של 5 M הנאל במים (450 μL יהיה צורך בכל שפופרת לדוגמה) כדי להפוך את כל החלבונים ולמנוע חילוף החומרים אתנול. הפוך את קוקטייל הפרוטאז (טבלת חומרים) בריכוז של 2 מ"ג/mL במדיה העובר.</li>
	<li>תווית a 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה ו 2 mL גז כרומטוגרף בקבוקון עבור כל מדגם. תווית נוספת 2 מ ל כרומטוגרף גז מבחנות עבור תקני האתנול שתוארו להלן, כמו גם אוויר, מים, ו 5 כדורי משקה מדיום/פרוטאז.</li>
	<li>כוונן שלושה p200 מיקרופיפטורים שניים מוגדרים ל-50 μL, והקבוצה השלישית ל-200 μL; p1000 מיקרופיפיאו מוגדר ל-450 μL ומיקרופיפיפיפיאור p2 מוגדר ל-2 μL. עבור פיפטות זכוכית המשמש להעברת עוברים מצלחות פטרי לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL, במהירות לעבור את העצה באמצעות הלהבה כדי להחליק את הקצוות כדי לא לפגוע העוברים כאשר למשוך אותם לתוך הפיפטה.</li>
</ol>5. עיבוד עוברי גז כרומטוגרפיה בחלל הראש
הערה: שני העוברים בורחוריהם ואלה שהוסרו בעבר מהורמונים שלהם מטופלים באופן זהה לעקביות בחישוב גורמי דילול.
<ol><li>באמצעות שני p200 מיקרופיפטורים להגדיר ל50 μL, לצייר 50 μL של פתרון הקוקטייל פרוטאז לתוך אחד ולצייר 50 μL של מים אל השני.</li>
	<li>באמצעות פיפטה זכוכית ומיקרופיפיאור, מניחים במהירות 10 עוברים (משלב 3.2) בצינור המיקרו-מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL וסוגרים את המכסה (כמתואר באיור 2א). חזור על כל הדגימות כדי להיבדק, פקדים, והעוברים שטופלו אתנול.</li>
	<li>באמצעות p200 מיקרופיפיאור להגדיר μL, 200 לפתוח במהירות את כובע ולהסיר את כל מדיית העובר שיורית (כפי שמתואר באיור 2ג). מקום במהירות את הפיפטה המכיל 50 μL של מים בצינור במהירות אך בעדינות (לא לפגוע העוברים) להוסיף, ולאחר מכן להסיר את המים. הוסף במהירות 50 μL של פתרון קוקטייל פרוטאז מתוך הפיפטורים הממתינים וסגור את כובע הצינור (איור 2ד). הערה: בצע תהליך זה מדגם אחד בכל פעם.</li>
	<li>תן את המדגם לשבת ב-RT עבור 10 דקות כדי לאפשר קוקטייל פרוטאז לבזות את chorion. לאחר מכן, להוסיף במהירות 450 μL של 5 M הנאל ולסגור את כובע הצינור (איור 2E). מערבולת הדגימות עבור 10 דקות. כדי להאיץ את התהליך, להגדיר את המיקסר כדי מערבולת דגימות מרובות באותו זמן. הערה: הוסף כמות קטנה (~ 100 μL) של תערובת חרוזים סיליקה (2 גדלים, 0.5 מ"מ ו 1 מ"מ חרוז) לכל צינור עם עוברים מבוגרים יותר 24 hpf. בעוברים מבוגרים, מיתר הנוטואקורד יישאר שלם בלי קשר לכמה זמן הם הומוגניים.</li>
	<li>לאחר הומוגניזציה עבור 10 דקות, להסיר במהירות 2 μL של העובר הומוגניים מוליך supernatant ולהוסיף בקבוקון כרומטוגרף גז. אטום במהירות את המבחנה. עם כובע הפוליטאואתילן</li>
</ol>6. הכנת תקני תקשורת ואתנול
<ol><li>כדי להכין את תקני המדיה, לדלל את המדיה על ידי פקטור של 10 עם פתרון של 5 M/פרוטאז קוקטייל. הוסף 2 μL של כל מדגם לבקבוקון כרומטוגרף גז וחותם עם כובע פוליארברואואתילן.</li>
	<li>כדי להכין את תקני אתנול, ליצור דילול סדרתי של 100% אתנול בתוך 5 M התקן/פרוטאז הפתרון לריכוזים הבאים: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, ו 40 mM. הוסף 2 μL של כל תקן לבקבוקון כרומאטוגרף גז וחותם עם כובע פוליארבאואתילן.</li>
</ol>7. הכנת כרומאטוגרף גז החלל הראשי
הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות את ההתקנה והפרוטוקול בהתאם לשימוש בכרומטוגרף הגז. גז כרומטוגרפיה של החלל הראשי משמש לכמת רמות אתנול, לא להפרדה.
<ol><li>הגדר את התנור עבור הדגם האוטומטי עד 58 ° c והפעל. אפשר את החימום כדי להגיע 58 ° c, ולהדליק את האוויר ואת קווי גז מימן האכלה כרומטוגרף גז (להבה יינון המשמש לכמת את האתנול). הערה: psi צריך להיות מוגדר כראוי להפעיל את chromatograph על פי מפרטים של היצרן. וודא שקו ההליום מופעל. ומכוון למסילה הנכונה</li>
	<li>בשביל המחיצה, ודא שמספר הדגימות שהוזרק אינו &gt; 100. עבור סיבי ההזרקה, ודא שמספר הדגימות שהוזרק אינו &gt; 500. הערה: אם מדובר על כמות הזריקות, יהיה עליהם לשנות אותם לפני הפעלת דגימות הבדיקה.</li>
	<li>הפעל את תוכנת הניתוח וודא שתחנת העבודה מוגדרת כראוי. אחסן את כל הנתונים לפי תקני מעבדה/מחלקה. צור רשימה מדגם חדשה כדי שהדגימות יופעלו.</li>
	<li>הפעל את שיטת ההפעלה והמתן עד שגלאי הלהבה לייצוב יתייצב לפני הפעלת הדגימות. פעם אחת יציבה, הפעל את שיטת ההפעלה של התוכנה כדי לנקות את סיבים.</li>
</ol>8. מדידות לדוגמה באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי
<ol><li>לאחר השלמת שיטת האתחול, צור שורה חדשה אחת לכל מדגם ברשימה לדוגמה. מתפריט השיטות בתוכנת הניתוח, טען 436 שליטת האתנול spme 2013 3min לקלוט 2_5min rg לרוץ. מתאמפטמין עבור כל דוגמה ברשימת המדגם.<ol>
<li>מלאו את הרשימה לדוגמה, החל מהאוויר, מים, 5 כדורי משקה מדגם "נl/פרוטאז". לאחר מכן הזן את הסטנדרטים לפי סדר, מ 0.3125 עד 40 mM. עקבו אחר הסטנדרטים בסיבוב השני של האוויר, המים, ו-5 כדורי הקוקטייל הנאני/פרוטאז.</li>
		<li>הזן את כל דגימות סופר הומוגניים העובר כדי להיבדק, מן הנמוך ביותר לריכוז האתנול החזוי ביותר. מסתיים בכניסה לסיבוב השלישי והאחרון של האוויר, המים, ו-5 כדורי הקוקטייל הנאני/פרוטאז.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף את מבחנות כרומטוגרף הגז לדגם האוטומטי בסדר בו הוזנו הדגימות. אפשר דוגמאות לחימום במשך 10 – 15 דקות. הפעל את הדוגמה המופעלת בתוכנה.</li>
	<li>לאחר הפעלת כל הדגימות והרווחים הסופיים, הפעל את שיטת הכיבוי בתוכנה על-ידי הוספת דוגמה סופית ברשימה לדוגמה והפעלה במצב המתנה. לילא. גבה את כל הנתונים שנרכשו במהלך הפעלת המדגם. כבו את הציוד בסדר הבא: מדוד חימום אוטומטי, מיכל מימן, רק לאחר טמפרטורת chromatograph מגיע 30 ° c, מיכל האוויר. תשאיר את מיכל ההליום. כדי לשמר את עמוד השעווה</li>
</ol>9. לדוגמא שילוב של מפיק האתנול וניתוח ריכוז לדוגמה
הערה: כל הערכים מ-9.3 ב-, חושבו בקובץ excel שכל המשוואות התמלאו מראש.
<ol><li>לאחר השלמת שיטת הכיבוי, לחץ על כרומאטוגרם הפתוח . פתח את התיקיה המכילה את התוצאות. דגימות משולבות באופן אוטומטי בתוכנית זו.</li>
	<li>בתוצאות, ודא שהפסגות הנכונות שולבו (פסגות האתנול בין 2 ל-2.5). לאחר שכל הדגימות אושרו, להדפיס או לייצא את התוצאות.</li>
	<li>התווה את גובה השיא של תקני האתנול בגרף. חישוב השיפוע, Y ליירט ו-R2 ערכים עבור תקני אתנול (r2 צריך להיות &gt; 0.99). הערה: ערכים אלה ישמשו לקביעת ריכוז האתנול מגובה המדגם.</li>
	<li>לכל דוגמה, הפחת את גובה השיא של המדגם מנקודת החיתוך של ה-Y של תקני האתנול. חלק ערך זה על-ידי השיפוע של תקני האתנול כדי להשיג את ערך האתנול עבור כל מדגם בבקבוקונים GC.</li>
</ol><img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ03.jpg">
<ol start="5"><li>כדי לחשב את ריכוז האתנול בעוברים, לחשב תחילה את פקטור הדילול עבור כל דוגמה. לקחת את אמצעי האחסון מחושב בשלב 2.3 של פרוטוקול זה ולחלק אותו על ידי מדידת אמצעי האחסון בתוספת 500 μL. זה מייצג את התמיסה 5 מ ' ליטר/פרוטאז שנוספו לכל מדגם במהלך עיבוד העובר (שלבים 5.3 ו 5.4).</li>
</ol><img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ04.jpg">
<ol start="6"><li>בעזרת פקטור הדילול לדוגמה, הכפל לפי ערך האתנול לדוגמה עבור כל דוגמה. התוצאות יהיו בריכוז mM. חישוב דגימות של הפניית מדיה על-ידי הכפלת ערך האתנול של המדיה בפקטור הדילול של 10.</li>
</ol><img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ05.jpg">
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ06.jpg">

<ol><li>Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome%3A+a+prospective+national+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archive+of+Diseases+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study.</a> Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).</li>
<li>Cudd, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+systems+for+the+study+of+alcohol+teratology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal model systems for the study of alcohol teratology.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).</li>
<li>Williams, J. F., Smith, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Committee+on+Substance+Abuse.+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders.</a> Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).</li>
<li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).</li>
<li>Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+%28PAE%29%3A+insights+into+FASD+using+mouse+models+of+PAE%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).</li>
<li>Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+Alcohol+Consumption%3A+Studies+with+Mutant+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice.</a> International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).</li>
<li>Marquardt, K., Brigman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+prenatal+alcohol+exposure+on+social%2C+cognitive+and+affective+behavioral+domains%3A+Insights+from+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models.</a> Alcohol. 51, 1-15 (2016).</li>
<li>Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+of+alcohol-induced+craniofacial+dysmorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).</li>
<li>Lipinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+face-brain+dysmorphology+patterns+are+correlative+and+exposure-stage+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent.</a> PLoS One. 7 (8), 43067(2012).</li>
<li>Eberhart, J. K., Parnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">The genetics of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).</li>
<li>Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratogenic+actions+of+ethanol+in+the+mouse%3A+a+minireview%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview.</a> Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).</li>
<li>Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+rescues+cranial+neural+crest+from+cell+death+induced+by+ethanol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).</li>
<li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).</li>
<li>Hong, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdon+mutation+and+fetal+ethanol+exposure+synergize+to+produce+midline+signaling+defects+and+holoprosencephaly+spectrum+disorders+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSGenetics%22%5BJournal%5D)">Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice.</a> PLoSGenetics. 8 (10), 1002999(2012).</li>
<li>Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+ethanol+exposure+activates+protein+kinase+A+and+impairs+Shh+expression+in+prechordal+mesendoderm+cells+in+the+pathogenesis+of+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).</li>
<li>Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+inhibition+of+retinoic+acid+synthesis+as+a+potential+mechanism+for+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome.</a> The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).</li>
<li>Wentzel, P., Eriksson, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+fetal+dysmorphogenesis+in+the+mouse+is+diminished+by+high+antioxidative+capacity+of+the+mother%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother.</a> Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).</li>
<li>Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+absence+of+nNOS+worsens+fetal+alcohol+effects+in+mice.+II%3A+microencephaly+and+neuronal+losses%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).</li>
<li>Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+genetics+in+fetal+alcohol+effects%3A+null+mutation+of+the+nNOS+gene+worsens+alcohol-induced+cerebellar+neuronal+losses+and+behavioral+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits.</a> Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).</li>
<li>Bonthius, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+%28nNOS%29+worsens+alcohol-induced+microencephaly+and+neuronal+loss+in+developing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research.+Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice.</a> Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).</li>
<li>Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fancd2+counteracts+the+toxic+effects+of+naturally+produced+aldehydes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice.</a> Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).</li>
<li>Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders%3A+Zebrafish+as+a+Model+for+Ethanol+Teratogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis.</a> Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).</li>
<li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis%3A+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).</li>
<li>Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+age+strengthens+barriers+to+ethanol+accumulation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish.</a> Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).</li>
<li>Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol%27s+molecular+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Ethanol's molecular targets.</a> Science Signaling. 1 (28), (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+Danio+%28Brachydanio%29+rerio%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio</a>. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+Distribution+and+permeability+of+zebrafish+embryos%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio.</a> Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).</li>
<li>Lippi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alcohol+used+for+cleansing+the+venipuncture+site+does+not+jeopardize+blood+and+plasma+alcohol+measurement+with+head-space+gas+chromatography+and+an+enzymatic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemia+Medica%22%5BJournal%5D)">The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay.</a> Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).</li>
<li>Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+concentration+in+56+refillable+electronic+cigarettes+liquid+formulations+determined+by+headspace+gas+chromatography+with+flame+ionization+detector+%28HS-GC-FID%29%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Testing+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).</li>
<li>Heit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Neural+Ethanol+and+Acetaldehyde+Using+Headspace+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).</li>
<li>Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Validation+of+a+Method+for+Alcohol+Analysis+in+Brain+Tissue+by+Headspace+Gas+Chromatography+with+Flame+Ionization+Detector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector.</a> Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).</li>
<li>Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+methanol%2C+acetaldehyde%2C+acetone%2C+and+ethanol+in+human+blood+by+gas+chromatography+with+flame+ionization+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Human+and+Experimental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection.</a> Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).</li>
<li>Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdialysis+of+ethanol+during+operant+ethanol+self-administration+and+ethanol+determination+by+gas+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4142(2012).</li>
<li>Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+ethanol+kinetics+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).</li>
<li>Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+ethanol+concentrations+and+ethanol+discrimination+in+rats%3A+effects+of+dose+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time.</a> Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).</li>
<li>Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily-conserved+mechanism+of+calcium-dependent+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).</li>
<li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).</li>
<li>Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+and+hindbrain+development+in+zebrafish+is+sensitive+to+ethanol+exposure+involving+agrin%2C+Fgf%2C+and+sonic+hedgehog+function%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כמערכת מודל התפתחותית, הדגים מתאימים באופן אידיאלי לחקר ההשפעה של גורמים סביבתיים בפיתוח. הם מייצרים מספר גדול של עוברים מופרות חיצוני, אשר מאפשר תזמון מדויק ומינון בלימודי אתנול. זה, בשילוב עם יכולות הדמיה חיה ושימור גנטי והתפתחותי עם בני אדם, להפוך את הדגים מערכת מודל רבת עוצמה ללימודי התרולוגיה. מתוארים הוא פרוטוקול למדידת ריכוזי אתנול עובריים בפיתוח העוברים ומדגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי.
קביעת ריכוז האתנול העובריים הוא קריטי כדי להבין את ההשפעה של אתנול לעובר המתפתח. במודלים של ...

הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) מתאר מגוון רחב של ליקויי נוירולוגיות ו הגולגולת דיסקוורפולוגיות הקשורים לחשיפה האתנול העובריים1. גורמים מרובים, כולל עיתוי ומינון של חשיפה אתנול ורקע גנטי, לתרום וריאציה של fasd2,3. בבני אדם, מערכת היחסים המורכבת של משתנים אלה עושה לימוד והבנה של האטיולוגיה של FASD מאתגרת. דגמי בעלי חיים הוכיחו באופן קריטי בפיתוח ההבנה שלנו לגבי הבסיס המכניסטי של האתנול הטרוגניות. מגוון רחב של מערכות מודל בעלי חיים נעשה שימוש כדי ללמוד היבטים מרובים של FASD ותוצאות היו עקביים במידה ניכרת עם מה נמצא בחשיפה בבני אדם4. מערכות דגם מכרסמים משמשים כדי לבחון היבטים רבים של fasd, עם עכברים להיות הנפוצים ביותר5,6,7. רוב העבודה התמקדה פגמים התפתחותיים לחשיפה מוקדמת של אתנול8, למרות מאוחר יותר חשיפה לאתנול הוכח לגרום לחריגות התפתחותיות כמו גם9. יתר על כן, היכולות הגנטיות של עכברים סייעו מאוד היכולת שלנו לחקור את בסיס גנטי של fasd10,11. מחקרים אלה בעכברים מצביעים מאוד על כך יש אינטראקציות ג'ין אתנול עם מסלול קיפוד סוניק, חומצה retinoic איתות, סופראוקסיד dismutase תחמוצת חנקן סטנדרטים I, Aldh2 ו Fancd28,10,11,12,13,14,15,16, 17, 18, 5, 19,19,19, 19,20,21. מחקרים אלה מראים כי מודלים בעלי חיים הם קריטיים כדי לקדם את ההבנה שלנו של FASD ואת המנגנונים הבסיסיים שלה.
דג דג זברה התפתחה כמערכת דגם רב עוצמה כדי לבחון היבטים רבים של אתנול teratogenesis22,23. בשל ההפריה החיצונית שלהם, פוריות גבוהה, מעקב גנטי, ויכולות הדמיה חיה, מתאימים באופן אידיאלי לגורמי לימוד כגון עיתוי, מינון, וגנטיקה של האתנול teratogenesis. האתנול יכול להינתן לעוברים מבויים בדיוק והעוברים יכולים להיות בתמונה כדי לבחון את ההשפעה הישירה של אתנול במהלך תהליכים התפתחותיים. עבודה זו יכולה להיות קשורה ישירות לבני אדם, כי התוכניות הגנטיות של הפיתוח הם שימור מאוד בין דג ובני אדם ולכן יכול לעזור להנחות FASD מחקרים אנושיים24. בעוד דגים שימשו כדי לבחון את האתנול teratogenesis, חוסר הסכמה בדיווח ריכוזי אתנול עובריים עושה השוואה לבני אדם קשה25. במערכות היונקים, רמות אלכוהול בדם מתאם ישירות לרמות האתנול של רקמות26. רבים ממחקרי הדגים מתייחסים לעוברים לפני היווצרות מוחלט של מערכת הדם שלהם. ללא מדגם אימהי לבחון, תהליך להערכת ריכוזי אתנול נדרש כדי לכמת את רמות האתנול בתוך העובר. כאן אנו מתארים תהליך לכמת ריכוזי אתנול בתוך העובר בפיתוח דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה גז שטח הראש.

<table><tbody><tr><td>אוויר</td><td></td><td></td><td>מסופק בחוזה לאוניברסיטה</td></tr><tr><td>מאזן אנליטי</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>AutoSampler, CP-8400</td><td>Varian</td><td></td><td>גז כרומטוגרף Autosampler</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון כרומטוגרף גז עם מחיצת פוליטטרפלואורואתילן/סיליקון וכובע פלסטיק 2 מ"ל</td><td>Agilent</td><td>8010-0198</td><td>יכול לעשות שימוש חוזר בבקבוקונים לאחר הניקוי, אך לא במכסים/מחיצות</td></tr><tr><td>כרומטוגרף גז, CP-3800</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helium</td><td></td><td></td><td>מסופק בחוזה לאוניברסיטה</td></tr><tr><td>HP Innowax עמוד נימי</td><td>Agilent</td><td>19095N-123I</td><td>30 מ' x 0.53 מ"מ x 1.0 &mu; m סרט עבה</td></tr><tr><td>Hyrdogen</td><td></td><td></td><td>מסופק בחוזה לאוניברסיטה</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט (Heptahydrate)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682002</td><td></td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטה 10 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>טיפים למיקרופיפטות 1000 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטה 200 &mu; L</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי 100 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>פיפטמן L p1000L מיקרופיפטה</td><td>גילסון</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>פיפטמן L p200L מיקרופיפטה</td><td>גילסון</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>פיפטמן L p2L מיקרופיפטה</td><td>גילסון</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>מחיצת פוליטטרפלואורואתילן/סיליקון ו כובע פלסטיק</td><td>Agilent</td><td>5190-7021</td><td>מכסי החלפה/מחיצות לבקבוקוני כרומטוגרף גז</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט (דו-בסיסי)</td> <td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>פרונאז</td><td>VWR</td><td>97062-916</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי סיליקה .5 מ"מ</td><td>מוצרי Biospec</td><td>11079105z</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי סיליקה 1.0 מ"מ</td><td>Biospec Products</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט (דו-בסיסי)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>מכלול סיבים מיקרו-מיצוי בשלב מוצק Carboxen/Polydimethylsiloxane</td><td>Millipore Sigma</td><td>57343-U</td><td>סיבים חלופיים</td></tr><tr><td>כוכב כרומטוגרפיה תחנת עבודה</td><td>תוכנת כרומטוגרפיה</td><td>וריאן</td><td></td></tr><tr><td>תרמוגרין דימום נמוך (LB-2) Septa</td><td>Millipore Sigma</td><td>23154</td><td>מחיצת כניסה חלופית</td></tr></tbody></table>

קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) לתאר רצף משתנה מאוד של מומים התפתחותיים המושרה אתנול, כולל מורפולוגיות הפנים וליקויים נוירולוגיים. עם פתולוגיה מורכבת, FASD משפיע על כ 1 ב 100 ילדים שנולדו בארצות הברית בכל שנה. בשל האופי המשתנה מאוד של FASD, מודלים בעלי חיים הוכיחו ביקורתית הבנה המכונה הנוכחי שלנו של פגמים המושרה בפיתוח אתנול. מספר גדל והולך של מעבדות התמקד בשימוש בדגים כדי לבחון פגמים התפתחותיים המושרה אתנול. Zebrafish לייצר מספר גדול של הופרות חיצוני, מעוקב גנטית, עוברים שקופים. זה מאפשר לחוקרים לשלוט בדיוק בעיתוי והמינון של חשיפה אתנול בהקשרים גנטיים מרובים לכמת את ההשפעה של חשיפה האתנול עובריים באמצעות טכניקות הדמיה חיה. זה, בשילוב עם הרמה הגבוהה של שימור של גנטיקה ופיתוח עם בני אדם, הוכיחה הדגים להיות מודל רב עוצמה שבו ללמוד את הבסיס המכונה של הטרוגניות האתנול. עם זאת, חשיפה האתנול משטרי יש מגוון בין מחקרים שונים דג זברה, אשר יש לבולבל את הפרשנות של נתוני דג זברה על פני מחקרים אלה. הנה פרוטוקול כדי כמת ריכוזי האתנול בעוברי דג דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי.

רמות האתנול בדם לא יכול להיקבע ב zebrafish מוקדם, כי הם חסרי מערכת הדם שנוצר במלואו. כדי לקבוע את רמת הריכוז האתנול בעוברי הדגים דג זברה, רמות האתנול נמדדות ישירות מרקמת הומוגניים מעובריים. כדי למדוד כראוי את ריכוזי האתנול עובריים, נפח עובריים יש לקחת בחשבון. העובר (החלמון מוצמד) יושב בתוך הצ (קליפת ביצה) מוקף בנוזלים מעובריים (איור 1). כל אמצעי האחסון של העובר צריך להתבצע על עוברים בזמן החשיפה, כי נפח עובריים ישתנה על פני זמן התפתחותי כאשר העובר גדל בגודל. בנוסף, איך העובר מעובד יש לקחת בחש...

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכמת רמות האתנול בעובר דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה הראש שטח גז משיטות חשיפה נכונה לעיבוד העובר ניתוח אתנול.

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה עוזר להבין את הפרמקוקינטיקה של אתנול בפיתוח עוברי זברה וזה יעזור לתקנן אתנול חשיפה משטרים במחקרים זברה. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים למדוד במהירות ובשכפול רמות אתנול במהלך התפתחות עוברית, במיוחד בעוברים שבהם אספקת הדם אינה זמינה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות על מערכות מודל אחרות, כמו גם גורמים סביבתיים אחרים בהנחה טכניקה נכונה והגדרת ציוד.הייתי מצפה מאנשים המבצעים פרוטוקול זה בפעם הראשונה להיאבק עם המהירות הדרושה כדי למנוע אידוי אתנול במהלך עיבוד עובר. התחל בהעברת 10 עוברים עם נוזל עוברי נוסף לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המסומנים בקו בנפח של 250 מיקרוליטרים. מוסיפים מים לקו המילוי.הכינו צינורות מיקרוצנטריפוגה נוספים לדגימות מנוונות. כדי להסיר את chorion, דגירה העוברים בצלחת פטרי 100 מילימטר עם שני מיליגרם למיליליטר של קוקטייל פרוטאז במדיית עובר במשך 10 דקות. בעדינות מערבל את המנה כל כמה דקות כדי לשבור את המקהלה.לאחר שכל העוברים חופשיים מהבחירה, מוציאים אותם מקוקטייל הפרוטאז ושוטפים אותם פעמיים עם מדיה טרייה. ואז להעביר את העוברים לצלחת 100 מילימטר טרי. כאשר כל הדגימות מוכנות למדידת נפח, השתמש במיקרופייפאט P200 עם הקצה הקטן ביותר האפשרי כדי להסיר בזהירות את כל הנוזלים מרחבי העוברים.לשקול את המים עם סולם עם פחות מ 0.1 מיליגרם דיוק, ולאחר מכן לקבוע את הנפח של 10 עוברים על ידי חיסור המשקל של המים שהוסרו מ 250 microliters. כדי לקבוע את הנפח של עובר יחיד, חלק את ההפרש ב- 10. אוספים את העוברים ממיכלי ההזדווגות ומ מניחים אותם בצלחת פטרי סטנדרטית של 100 מ"מ ואז דוגרים את המנה ב-28.5 מעלות צלזיוס.בשש שעות לאחר ההפריה, מעבירים עד 100 עוברים לתבשיל חדש עם תקשורת עוברית ו-1%אתנול או מדיה בלבד. מכסים אך לא לאטום את צלחות פטרי ומ מניחים אותן באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות או עד שהן מגיעות ל-24 שעות לאחר ההפריה. השתמשו בשני מיקרופיפטים P200 מוגדרים ל-50 מיקרוליטרים ושאפו את תטגם קוקטייל הפרוטאז לאחד ומים לשנייה.ואז במהירות למקם 10 עוברים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה זכוכית ולסגור את הכובע. חזור על תהליך זה עבור כל הדגימות להיבדק, פקדים ועוברים שטופלו באתנול. עבודה עם מדגם אחד בכל פעם, לפתוח במהירות את הכובע ולחושף את כל המדיה עובר שיורית עם micropipette P200 להגדיר 200 microliters.במהירות אך בעדינות להוסיף ולהסיר את 50 microliters של מים, ולאחר מכן להוסיף את 50 microliters של קוקטייל פרוטאז ולסגור את מכסה הצינור. תן את המדגם לשבת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואז במהירות להוסיף 450 microliters של חמישה נתרן כלורי טוחן ולסגור את כובע הצינור. הומוגניזציה המדגם על ידי מערבולת במשך 10 דקות ולהעביר שני microliters של על טבעי לבקבוקון כרומטוגרפיה גז.לאטום את הבקבוקון עם כובע polytetrafluoroethylene. לאחר השלמת שיטת האתחול, טען 436 אתנול SPME נוכחי שתיים עד חמש דקות של הפעלת RG. ספיד מתפריט השיטות בתוכנת הניתוח עבור כל מדגם ברשימת הדוגמיות.מלאו את רשימת הדגימות החל מהאוויר, המים, וחמישה בקבוקי פרוטאז נתרן כלורי טוחנים. לאחר מכן הזן את תקני אתנול לפי סדר מ 0.3125 כדי 40 מילימולר. בצע את הסטנדרטים עם הסיבוב השני של החסר.הזן את כל דגימות עובר הומוגני supernatant להיבדק מן הנמוך ביותר לריכוז אתנול החזוי הגבוה ביותר ולסיים על ידי הזנת סיבוב שלישי של כדורי סרק. מוסיפים את בקבוקוני כרומטוגרפיה גז לדגימה כדי שבו הדגימות הוזנו ולאפשר להם להתחמם במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן התחל את הפעלת הדוגמה באמצעות התוכנה.לאחר השלמת כל הפעולות, הפעל את שיטת הכיבוי על-ידי הוספת דוגמה סופית ברשימת הדוגמיות והפעלת המתנה.meth. גבה את כל הנתונים שנרכשו במהלך הריצה לדוגמה. לאחר השלמת שיטת הכיבוי, לחץ על כרומטוגרמה פתוחה ולפתוח את התיקייה עם התוצאות.דוגמאות משולבות באופן אוטומטי בתוכנית זו. בתוצאות, ודא שהפסגות הנכונות שולבו. לאחר שכל הדגימות אושרו, הדפס או יצא את התוצאות.התווה את גובה השיא של תקני האתנול בגרף ולאחר מכן חשב את ערכי השיפוע, y-intercept וה- r בריבוע. השג את ערך האתנול עבור כל מדגם על-ידי חיסור גובה השיא של המדגם מחיתוך-y של התקנים וחלוקת ערך זה על-ידי שיפוע התקנים. כדי לחשב את ריכוז האתנול בעוברים, לחשב את גורם הדילול עבור כל מדגם ולהכפיל את ערך אתנול המדגם על ידי גורם דילול זה.לבסוף, לחשב דגימות הפניה למדיה על ידי הכפלת ערך אתנול התקשורת על ידי גורם דילול של 10. כדי לחשב כראוי את ריכוזי האתנול העובריים, נמדדו כמויות העוברים הן בכוריון שלהם והן הוסרו מה chorion שלהם. בניתוח זה, העובר היווה 56% מהנפח הכולל בתוך המקהלה.בהתבסס על עבודה שפורסמה בעבר, 73.6% שימשו כתכני המים העובריים עבור כל הניתוחים שהוצגו. זה הביא מים הכוללים 0.82 microliters של 1.1 microliters של נפח עוברי. מתוך נפח המים הכולל, 49% כלולים בעובר ו-51% נמצאים בנוזל החוץ-מבריוני.לצורך ניתוח כרומטוגרפיה של גז, נותחו שתי קבוצות של 15 דגימות והתקשורת שבה טופלו נמדדו חמש פעמים לכל קבוצה. רמות אתנול התקשורת היו 143.6 מילימולר לקבוצה אחת ו 133.6 מילימולר לקבוצה 2. ריכוזי האתנול של העוברים היו בממוצע 63.5 מילימולרים ו-53.1 מילימולרים לקבוצות 1 ו-2 בהתאמה.יחס של ריכוז אתנול עוברי לרמות התקשורת של אתנול עבור כל מדגם חושב. לקבוצה הראשונה היו 44% מרמות האתנול במדיה, בעוד שלקבוצה היו 40% מרמות האתנול התקשורתי. עוברי בקרה לא מטופלים נמדדו בריכוז אתנול תקשורתי אפס מילימולרי.הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא כי עיבוד העוברים לניתוח GC כראוי הוא קריטי כמו אתנול הוא נדיף יהיה להתאדות במהירות. הדרך הטובה ביותר לבצע שלב זה מתוארת, אבל זה צריך להיות מתורגל לפתח זיכרון שריר תקין. הליך זה יסייע לתקנן משטרים לטיפול באתנול בזברהפיש ויאפשר לעבודה עתידית לנתח את המנגנונים הגנטיים והתאיים של טרטוגניות אתנית.

quantification-ethanol-levels-zebrafish-embryos-using-head-space-gas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של אתנול הנזק הנגרמת התפתחותית, פיתחנו מודל של דג הזברה חשיפה אתנול בוחנים את פיזיים, שינויים הסלולר, וגנטיים המתרחשות לאחר החשיפה...

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

דג זברה מייצג מודל חוליות חזקה שהיה תחת מנוצל למחקרים מטבוליים. כאן אנו מתארים את הדרך מהירה...

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

סרטון זה מדגים את השימוש בכרומטוגרפיית גז headspace כדי לקבוע את ריכוזי האתנול בעוברים של דגי זברה. שיטה זו מספקת כלי שימושי לניתוח איכותי וכמותי של תרכובות אורגניות נדיפות.

כרומטוגרפיית גז Headspace: טכניקה להערכת ריכוז אתנול בעוברים של דגי זברה

מוסברת שיטה חדשה להפחתת השונות בעת חשיפת דגים לתרופות.  דגים שנחשפו לדפוסים שונים של חשיפה לאתנול נמצאו כבעלי רמות חרדה שונות במהלך הגמילה במבחן סקוטוטקסי בהיר/כהה.

שיטה חדשה של תרופות אמריקניות לדג הזברה מרובה ( Rerio Danio) וכימות של נסיגה

פיברוזיס מתמשך עם שקיעה של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים מוגזמים מוביל לשחמת. שימוש לרעה באלכוהול הוא אחד הגורמים העיקריים למחלת כבד קשה. הקמנו מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי אתנול כדי לחקור את המנגנונים והאסטרטגיות לקידום התחדשות הפטוציטים בעת פציעה הנגרמת על ידי אלכוהול.

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

פרוטוקול זה מתאר ניתוח היסטולוגית של הכבד מן הזחלים דג הזברה כי טופלו באתנול 2% עבור 24 שעות. טיפול כזה אתנול חריפה התוצאות סטאטוזיס כבד נפיחות של כלי הדם הכבד.

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

טכנולוגיות לעריכת גנים אפשרו לחוקרים ליצור מוטציות דג זברה לחקור פונקציה גנטית בקלות יחסית. כאן, אנו מספקים מדריך לבצע היפוך העובר מקבילי וכימות של אותות היברידיזציה באתרו ב zebrafish. גישה זו לא משוחדת מספק דיוק גדול יותר בניתוחים פנוטיניים המבוססים על היברידיזציה באתרו.

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

מאמר זה מתאר פרוטוקול לניטור מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברי דגי זברה שלמים.

ניטור מרחבי-טמפורלי מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברים שלמים של דגי זברה

מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להתוות את הצעדים הדרושים כדי לבסס ולהשתמש במבחן העדפה חברתית עבור דג זברה בוגר ולהוכיח שניתן להשתמש בו כדי לאפיין פגמים חברתיים הנגרמים על ידי אתנול.

מידול הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי בדגי הזברה כדי לאפיין את ההשפעה של סביבה עוברית שלילית על התנהגות חברתית של מבוגרים

כאן, אנו מציגים שיטה ליישור והקפאה של דגימות זחלי דג זברה מרובות (Danio rerio) ואיסוףן בשקופית אחת לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי.

סידור קומפקטי מרחבית של קטעי דג זברה זחלים לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי

פיתחנו שיטת QuEChERS-HPLC שונה כדי להעריך את הרמות הפנימיות של 16 PAHs בעוברי דג הזברה.

שיטת QuEChERS-HPLC שונה לזיהוי פחמימנים ארומטיים פוליציקליים בעוברי דג זברה שנחשפו לחלקיקים עדינים

למדו כיצד לכמת רמות אתנול בעוברי זברה דניו רריו באמצעות כרומטוגרפיית גז החלל הראשי. שיטה זו מאפשרת מדידה מהירה וחוזרת של פרמקוקינטיקת האתנול בפיתוח עוברי.

קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

גלה סרטונים נוספים