Name: תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: למדו שיטה לתיוג דקסטרן בצבע Texas Red בתאי שיער שמיעתיים חיים עם תעלות מכנוטרנסדוקציה תפקודיות. טכניקה זו מאפשרת הערכת פעילות התעלות וחקר אנדוציטוזה באיבר קורטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לוינסנט Schram מתוך המיקרוסקופיה וליבת ההדמיה לסיוע ברכישת תמונה מרכזית, ו-Tsg-Hui Chang לעזרה לא יסולא בפז בניהול המושבה ובטיפול בעכברים. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של NINDS, NIH, בת, MD, כדי K.J.S. א יהושע נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של NINDS, NIH, ועל ידי רוברט Wenthold מלגת השתלמות מתוכנית המחקר התוך-קיר של ה-נדבך.

הטיפול בבעלי חיים והליכים ניסיוניים נערכו בעקבות ההנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, אשר אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים השימוש של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות שבץ (פרוטוקול בעלי חיים #1336 KJS).
1. עכברים
<ol><li>הגדר כמה זוגות הרבייה של C57BL/6J פראי סוג להתרבות במתקן החי לשלוט על תאריך הלידה של הליטות ולעקוב אחר גיל של גורים.</li>
</ol>2. ניתוח כנימת שבלול
<ol><li>הגדר שטח נקי קרוב לstereomicroscope לביצוע הניתוח (איור 1א). השתמש 70% אתנול כדי לנקות את החלל והסביבה ולמקם פד ספסל נקי. שקית פלסטיק פתולוגית לפסולת רפואית (MPW) תידרש להשליך את הגוויות של בעלי החיים.</li>
	<li>הכינו מספר מנות 35 מ"מ עם מדיה L15 של ליבוביץ '. הערה: המדיה הסלולרית של ליבוביץ ' מכילה 1 – 2 מ"מ Ca2 +, אשר נדרש כדי לשמור על שלמות של קישורי הקצה, ומכיל חומצות אמינו חיוניות, ויטמינים, ו פירובט נתרן כדי לשפר את בריאות התאים וההישרדות. סרום לא נכלל כדי להימנע השתנות ניסיוני בשל הרכב מוגדר גרוע שלה הפרעה פוטנציאלית עם dextran.</li>
	<li>המתת החסד postnatal-יום 6 (P6) עכברים על ידי עריפת ראש. הערה: עכברים בני 6 ימים עמידים במידה מסוימת להרדמה ממסים נדיפים. למרות שניתן להשתמשבחשיפות ממושכות (עד 50 דקות), מומלץ לעשות שימוש בשיטה פיזית משנית כדי להבטיח את המוות.</li>
	<li>השתמש במספריים לניתוח כדי להסיר את העור של הגולגולת על ידי ביצוע חתך שטחי מן הקדמי אל הקצה האחורי ולרוחב תעלות השמיעה החיצונית.</li>
	<li>מקפלים את העור לכיוון האף כדי לחשוף את הגולגולת (איור 2ב).</li>
	<li>לעשות חתך מאחור לקדמת הגולגולת ולרוחב קו העין (איור 2ב-C).</li>
	<li>הפרידו את הגולגולת בשני חצאים והסירו את המוח בעזרת מרית קטנה לחשיפת עצמות הרקה (איור 2ג-ד).</li>
	<li>עם מספריים קטנים, חותכים מסביב לעצמות. הזמן, ובבלו את הרקמה</li>
	<li>מניחים את שתי עצמות הזמן בצלחת 35 מ"מ ולוודא שהם מכוסים L15 מדיה (איור 2E). הערה: השלבים הבאים מתבצעים תחת הstereomicroscope. רקע שחור מסייע בדרך כלל להמחיש את הרקמה במהלך צעדי החיתוך העדינים.</li>
	<li>תחת מstereomicroscope מצויד העין שדה (כוח ההגדלה 10X (WF10X) ומקור חיצוני זרם חילופין (AC) הלוגן), להסיר את הרקמה המקיפה שבלול, תעלות בחצי עיגול, ושיווי הבמה איברים עם מלקחיים כירורגי (איור 2F).</li>
	<li>כדי לאפשר את תוספי ו-L15 מדיה להיכנס צינור שבלול, לבצע שני הנקב הגבול על כנימת הפצע, אחד על החלון העגול ואחרים באזור השבלול האפובית פסגה.</li>
	<li>הוסף 300 mL של מדיה L15 של ליבוביץ בכל טוב מ 9-היטב משקע הזכוכית.</li>
	<li>מניחים לפחות שלושה שבלול בגזור על כל באר.</li>
</ol>3. תיוג דקטרן
<ol><li>מהווים מחדש את תוספי בפתרון מלח מאוזנת של הנקס ללא Ca2 + ו-Mg2 + (hbss-cfm) בריכוז הסופי של 10 מ"ג/mL. פתרון מניות זה חייב להיות מצוטט בצינורות שחורים אטומים (מוגן מפני אור) ומאוחסן ב-30 ° צ' עד השימוש. הערה: השימוש בקוד ליזין לתיקון הוא קריטי לתוצאה מוצלחת של פרוטוקול זה.</li>
	<li>הכינו כל תוספי בריכוז הסופי של 2 מ"ג/ml ב 500 מ ל של ליבוביץ ' s L15 מדיה.</li>
	<li>הסר את המדיה מתוך השבלול והוסף את המדיה הL15 של ליבוביץ ' המכילה דקטרן של עניין בריכוז הסופי של 2 מ"ג/mL. הערה: למרות שחלק מערוצי ה-MET פתוחים במנוחה41,42, הדגירה של תוספי בוצעה עם טלטול עדין של האקסוצמחים כדי להגדיל את ההסתברות הפתוחה של הערוץ MET.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2 h עם טלטול עדין (25 סל ד) באמצעות שייקר תלת מימדי עם זווית מוטה של 25 °. הערה: תוספי המסומן בתווית להיות מוגן מפני אור כאשר הדבר אפשרי. כדי להגן על תוספי במהלך הדגירה 2 h, למקם את 9-היטב צלחת זכוכית בתוך התרבות תא P150 תבשיל עטוף רדיד אלומיניום.</li>
</ol>4. הכנה לדוגמא להדמיה
<ol><li>לאחר הדגירה עם dextran, לשטוף את הרקמה עבור 2 דקות פעמיים עם מדיה ופעם עם HBSS.</li>
	<li>מודטת הרקמה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות עם 4% פאראפורמלדהיד בתמיסה מאוזנת מלח הנקס (HBSS). התראה: חשיפה פורמלדהיד יכול להיות מרגיז את העיניים, האף, ואת מערכת הנשימה העליונה. אצל אנשים מסוימים, חשיפה לעור חוזר פורמלדהיד יכול לגרום לרגישות שעלולה לגרום לדלקת עור אלרגית. פורמלדהיד הוא מסרטן אנושי ידוע והוא חשוד בסכנת הרבייה.</li>
	<li>במהירות ובעדינות לשטוף את רקמת קבוע פעמיים עם HBSS כדי להסיר את הפאראמפורמלדהיד. הערה: הסרת העצמות הטמפורלית אינה נחוצה בשלב ההתפתחותי זה של שבלול.</li>
	<li>הסר את הרצועה ספירלה ואת קרום tectorial עם מלקחיים תשר עדין כדי לנתח את האיבר של Corti (איור 2G).</li>
	<li>להסיר את כל חתיכות קטנות של רקמות ולשטוף את הרקמה עם HBSS.</li>
	<li>המחלחל את הרקמה ב 0.5% טריטון X-100 ב PBS המכיל phalloidin התווית באופן מבוקר (מצומדת ירוק או אדום בעת בדיקת ספיגת של TR-או fitc התווית dextran, בהתאמה) ב 1:200 דילול עבור 30 דקות תווית F-actin ולדמיין את ה סטריאוציליה מבוססת-actin.</li>
	<li>לשטוף את הרקמה 2 – 3 פעמים עבור 2 דקות בכל פעם עם מאגר HBSS כדי להסיר את עודפי טריטון ו phalloidin, ופעם עם PBS כדי להסיר את המלחים.</li>
	<li>הר האיבר של רקמות Corti על שקופית מיקרוסקופ ולכסות אותו עם הרכבה מדיה. הערה: כאשר אתה מבצע את הרקמה, ודא שהצד של הרקמה המכילה את תא השיער סטריאוסיליה פונה לתוך הכיסויים.</li>
	<li>הסר כל בועות פוטנציאליות שנוצרו במהלך התוספת של המדיה ההרכבה ולמנוע את הדור של בועות חדשות במהלך הצבת שמיכות. הערה: מנושף בעזרת פיפטה כל בועה שנוצרת בתוספת המדיה הכוללת. כדי למנוע בועות אוויר מלהיות לכוד תחת coverslip, במקום קצה של coverslip קרוב למדגם בזהירות ובאיטיות להקטין את הכיסויים על הרקמה באמצעות מלקחיים או מפית.</li>
	<li>כסו את הרקמה במדיה הכוללת שמיכות זכוכית (איור 2H). הערה: יעדים עם צמצם מספרי מעל 0.4 מיועדים להשתמש #1 שמיכות 0.5 (עובי 0.17 מ"מ). שימוש בcoverslip לא נכון יכול להיות השלכות חמורות על העוצמה והאיכות של התמונות.</li>
	<li>מודטת את הרקמה הטעונה לילה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר למדיה לעלות להתייבש ולאחסן את השקופיות ב -4 ° צ' עד להדמיה.</li>
</ol>5. רכישת תמונה ועיבוד תמונה
הערה: התמונות קונפוקלית וקד נלקחו עם lsm 880 מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד בגלאי airyscan ערוץ 32 ברזולוציה סופר (SR) מצב43 ו-63 x המטרה.
<ol><li>להוסיף טיפה קטנה של שמן טבילה על המטרה.</li>
	<li>הניחו את שקופית המיקרוסקופ המכילה את דגימת הרקמה שנטענה בשלב המיקרוסקופ עם שמיכות זכוכית מול שמן טבילה.</li>
	<li>התמקד במדגם והגדר את פרמטרי ההדמיה באמצעות תוכנת רכישת התמונות.</li>
	<li>השתמש בקביעות רכישה זהות ובפרמטרים אופטימליים עבור רזולוציית x, y ו-z עבור כל ניסוי עצמאי. מערכת המוקד piezo מונחה נדרש כדי במהירות ובדיוק להעביר את המטרה בעת רכישת z-ערימת תמונות. הערה: כדי לדמות את כל האזור הרשמי של תאי השיער, לאסוף z-מחסנית של תמונות מתוך stereocilia לחצי הרשמי של גוף השיער באמצעות ההגדרות האופטימליות. חשוב לאסוף z מחסנית גדולה לאורך התא השיער כדי להבטיח את ההדמיה של חלקיקים כמו שלפוחית התינוק.</li>
	<li>השתמש בתוכנה לרכישת תמונות כדי לעבד את תמונות מיקוד raw באמצעות האלגוריתם השחזור התלת-ממדי של Airyscan עם הגדרות ברירת המחדל של המסנן האוטומטי.</li>
	<li>פתחו את התמונות הקונמיות בתוכנה לעיבוד תמונות כדי לכוונן את הבהירות והניגודיות, הוסיפו את סרגל הקנה מידה ומייצאים את התמונות לדמויות הסופיות.</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניסויים ספיגה באיבר murine של האקסוצמחים corti עם 3 kda תוספי טקסס אדום. המטרה של שיטה זו היא לבדוק אם מולקולות גדולות יותר מאשר אחרים שנבדקו בעבר היו גם מסוגלים לתייג במפורש תאים שיער שמיעתי והחדיר דרך ערוץ MET. פרוטוקולים ניסיוניים דומים שימשו בעבר כדי להעריך את החדירות של תאי השיער לצבעי פלורסנט אחרים כגון FM1-43 (0.56 kda)12,19,20 ו-טקסס בעלת תווית של האדום עמינח (1.29 – 1.43 kda)...

תאי השיער של האוזן הפנימית הם תאי החישה המזהים קול וסמויה את הגירוי המוכני באותות חשמליים, אשר מפורשים בסופו של דבר על ידי המוח שלנו. תאים אלה יש צרור בצורת גרם מדרגות של שלוש שורות של filaments מבוססי חוטים, המכונה stereocilia, אשר בולטות מאזור פסגה שלהם1,2. הגירוי המכני מהסיט את החוטים הסטריאוציאניים לעבר השורה הארוכה ביותר ומפעיל את פתיחת ערוצי המכונה3. פתיחת ערוצי ה-MET מובילה לזרם של הקטיונים המפתלים את התא וכתוצאה מכך מאותת על שחרורו של סינפסה באזור הבסיס של תא השיער.
המאפיינים הביופיזיים של ערוץ MET חיוני לשמיעה התאפיין בהרחבה. בין היתר, הערוצים הללו הם בררניים ובעלי מוליכות גדולה יחסית (150 – 300 pS ב-Ca+ 2 +)4,5,6,7,8,9,10. באופן מדהים, מולקולות פלורסנט גדול כגון FM1-43 ו-טקסס בעלת תווית של האדום מתויג של הערוץ ה, הנובע הצטברות שלהם בגוף תא השיער שניתן לדמיין באמצעות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית11,12,13,14. לעומת זאת, הזהות המולקולרית ומבנה ערוץ ה-MET ומסלול החדירות שלו נותרו חמקמקים. הגדלת הראיות הנסיוניות מצביעה על כך שחלבון הערוץ ה-transרפידה (TMC1) הוא רכיב של ערוץ ה-MET בתאי שיער בוגרים15,16,17,18,19. מוטציות בערוץ מדומה (TMC1) לשנות את מאפייני ערוץ MET19,20,21,22 ולגרום חירשות. בנוסף, TMC1 לאתר את ערוץ met18,23 ואינטראקציה עם הקישור טיפ אחראי על שידור הכוח המכני לערוץ MET24,25. יתר על כן, ניתוח ביואינפורמטיקה האחרונים זיהה את החלבונים tmc כמו האבולוציה הקשורים לערוצים מכנימתי TMEM63/osca חלבונים וחלבונים TMEM16, משפחה של ערוצי כלוריד סידן מופעל ו ליפידים26,27,28. מודל מבנית של TMC1 מבוסס על הקשר בין חלבונים אלה חשף נוכחות של חלל גדול בממשק חלבון-שומנים ממשק27. זה חלל הנמלים שתי מוטציות TMC1 שגורמות לאובדן שמיעה אוטוזומלית דומיננטי (DFNA36)27,29,30,31,32, ושינוי סלקטיבי של מוטציות ציסטאין עבור שאריות בחלל לשנות את המאפיינים של הערוץ28, המציין כי זה יכול לתפקד כנתיב חדירות של ערוץ MET. הגודל הגדול של חלל זה ניבא בחלבונים TMC יכול להסביר את היכולת של מולקולות גדולות לחלחל ערוץ MET. כדי לבדוק את החיזוי כי הערוץ MET מכיל מסלול חדירות גדול במיוחד כדי לדחוף את המגבלות של גודל החלל נצפתה ב TMC1, פיתחנו פרוטוקול לבצע ניסויים ספיגה באיבר של האקסון corti עם מולקולה גדולה יותר, 3 הודה תוספי באופן שכותרתו עם טקסס אדום.
Dextran הוא רב-סוכר מורכב בענף מורכב של מולקולות D-גלוקוז רבות כרוך על ידי alpha-1, 6 הקשרים הגליצידית. שלה מסיסות גבוהה במים, רעילות תא נמוכה, ו bioinertity להפוך אותו כלי רב-תכליתי ללמוד מספר תהליכים סלולריים. בנוסף, תוספי זמין במגוון רחב של גדלים ובעלי תווית fluorophores של מספר צבעים. בדרך כלל, משתמשים ב-dextrans באמצעות מחקר של תאים וחדירות רקמות33,34, כדי ללמוד אנדוקציטוזה במערכות סלולריות מרובות35,36, ועבור מעקב עצבי37,38. בשדה השמיעה, מולקולות תוספי גם נעשה שימוש כדי להעריך את ההפרעה של הצומת תא תא ואובדן של שלמות האפיתל חושי השמיעה לאחר החשיפה לרעש אינטנסיבי בעוגב צ'ינצ'ילה של corti39,40.
בעבודה זו, אנו לנצל את המאפיינים של חלק קטן (3 ו-10 kDa) הפלורסנט כדי לבצע ניסויים ספיגה בתאי שיער פנימי murine ולחקור את הגודל של הנתיב חדירות של תא האוזן הפנימית שיער פוגש ערוץ. בנוסף, השתמשנו מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בדיקת לייזר (lsm) 880 מצויד בגלאי airyscan כדי להמחיש ולהתאים את תוספי פלורסנט ב stereocilia ואת גוף התא של תאים שיער שמיעתי.

<table><tbody><tr><td>#1.5 כיסויי זכוכית 18 מ"מ</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>64-0714</td><td></td></tr><tr><td>אלקסה פלואור 488 פלואידין</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>אלקסה פלואור 594 פלואידין</td><td>תרמו-פישר</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>אלפא פלאן-אפוכרומט 63X/1.4 שמן קור M27 אובייקטיבי</td><td>קארל זייס</td><td>420780-9970-000</td><td></td></tr><tr><td>אמילוריד הידרוכלוריד</td><td>EMD MILLIPORE</td><td></td><td></td>129876</tr><tr><td>Benchwaver 3-D Rocker</td><td>Benchmarks מדעי</td><td>B3D5000</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J זן עכברים מסוג בר</td><td>000664</td><td>תא המעבדה</td><td></td>של ג'קסון</tr><tr><td>אימפרפירושן BAPTA טטרה-אשלגן</td><td>מלח ThermoFisher</td><td>B1204</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, פלואורסצאין, 10,000 MW, אניוני, ליזין לתיקון</td><td>ThermoFisher</td><td>D1820</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, טקסס אדום, 10,000 מגה-וואט, ליזין</td><td>ThermoFisher</td><td>קבוע D1863</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, טקסס אדום, 3000 MW, ליזין Fixable</td><td>ThermoFisher</td><td>D3328</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד תמיסה מימית EM Grade Electron</td><td>Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, סידן, מגנזיום, ללא פנול אדום</td><td>ThermoFisher</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום</td><td>ThermoFisher</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>Image J או FIJI</td><td>NIH</td><<td>a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F אמצעי טבילה בשמן</td><td>Carl Zeiss</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium של לייבוביץ, תוסף GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>ניאומיצין טריסולפט מלח הידרט</td><td>סיגמא</td><td>N6386</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-CF405M</td><td>ביוטיום</td><td>00034</td><td></td></tr><tr><td>ProLong יהלום אנטי דהייה מדיה הרכבה</td><td>ThermoFisher</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ שקופית</td><td>פישרברנד</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Zen Black 2.3 SP1</td><td>Carl Zeiss</td><td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td><td></td></tr></tbody></table>

תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

בערוץ המכונה (MET) מפעיל השער ממלא תפקיד חשוב בשמיעה. עם זאת, הזהות המולקולרית והמידע המבני של MET אינם ידועים. המחקרים האלקטרופיסיולוגיים של תאי השיער גילו שלערוץ MET יש היקף מוליכות גדול והוא חדיר למולקולות פלורסנט גדולות יחסית, כולל מספר צבעים בצבעי styryl ואנטיביוטיקה בצבע אדום עם התווית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה להמחיש ולהעריך את ספיגת דטרנס פלורסנט בתאי השיער של האיבר של האקריות Corti שניתן להשתמש בו כדי לטפל עבור הערוצים הפונקציונליים MET. מצאנו כי 3 kda טקסס אדום תווית תוספי במיוחד תוויות שיער שמיעתי פונקציונלי לאחר 1 – 2 h הדגירה. בפרט, 3 kda תוספי תוויות שתי שורות stereocilia קצר מצטבר בגוף התא בתבנית מפוזר כאשר ערוצי MET פונקציונלי נוכחים. דפוס נוסף שלפוחית העין של תיוג נצפתה בגוף התא של תאי השיער והתאים התומכים המקיפים. הנתונים שלנו מראים כי 3 kda טקסס-אדום תוספי ניתן להשתמש כדי להמחיש וללמוד שני מסלולים עבור ספיגת צבע הסלולר; מסלול כניסה ספציפי לתא שיער באמצעות ערוצי MET פונקציונלי והאנדוציטוזה, דפוס זמין גם dextran גדול.

הבחנו חזק וספציפי תיוג של תאי שיער לאחר הדגירה של 2h של האיבר של corti explants מסוג פראי לנטאל-יום 6 (P6) עכברים עם 3התווית של שלושהכאשר מסומן בדגל עם טקסס אדום (תוספי-TR) (איור 2א-ב). תיוג dextran נצפתה הן בתאי השיער הפנימיים והחיצוניים (IHC ו-OHC) באזורים הבזליים, האמצעיים והאפותיים של האיבר של Corti (איור 2ב).
התווית של phalloidin מתויג באופן שימוש כדי לזהות את הכתמים על הכתם (F-אקטין) ולהמחיש את ...

כאן, אנו מציגים שיטה להמחיש את ספיגת 3 kda טקסס אדום התווית תוספי בתאי שיער שמיעתי עם ערוצי מכניזציה תפקודית. בנוסף, דקסטר של 3 – 10 kDa ניתן להשתמש כדי ללמוד endocyציטוזה בתוך השיער והתאים התומכים של האיבר של Corti.

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ללמוד את ספיגת רגיל dextran פלואורסצנטי שכותרתו עם טקסס אדום בתאי שיער חיים עם ערוצי mechanotransduction פונקציונלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי שלושה קילודלטון טקסס רד dextran יכול לשמש כדי להעריך את תפקוד ערוץ mechanotransduction בתאי שיער חיים. כדי לקצור את השבריריים, מניחים את גולגולתו של עכבר יום שישי לאחר הלידה בצלחת תרבות של 60 מילימטר המכילה את מדיום L-15 של ליבוביץ' ולהשתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך שטחי מהקצה האחורי לקצה האחורי של הגולגולת ולאורך תעלות השמיעה החיצוניות.מקפלים את העור לכיוון האף כדי לחשוף את הגולגולת ולעשות חתך מאחור לחזית הגולגולת ולאורך קו העין. מפרידים את הגולגולת לשני חצאים ולהשתמש מרית קטנה כדי להסיר את המוח. כאשר ניתן לראות את עצמות הזמן, השתמש במספריים קטנים כדי לחתוך סביב עצמות אלה כדי למלמל את הרקמה.להטביע את עצמות הזמן בצלחת 35 מילימטר המכילה טרי L-15 בינוני ומ מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו מצויד עין שדה רחב מקור אור הלוגן זרם לסירוגין חיצוני. השתמש במקלפים כדי להסיר את רקמת הכילאר שמסביב, תעלות מעגליות למחצה ואיברים שיוויוני. לאחר שה שבלול הדם נותח והונח בצלחת חדשה עם מדיה L-15 טרייה, השתמש במלקחיים כירורגיים כדי לגרום לפצע דקירה אחד בחלון העגול ולנקב אחד באזור שבלול האפייה.כאשר כל cochleae נקצרו, למקם את הרקמה לתוך באר של צלחת דיכאון זכוכית תשע באר המכיל 200 microliters של מדיום L-15 טרי. לתיוג דקסטרן של הרקמות המבודדות, החלף את המדיום מכל מדגם היטב עם 200 מיקרוליטרים של מדיום L-15 טרי בתוספת שני מיליגרם למיליליטר של הפלואורסצנטיות נדנוד דקסטרן של עניין. דגירה הדגימות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ו 25 סיבובים לדקה בשייקר תלת מימדי בזווית מוטה של 25 מעלות מוגן מפני אור.בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמות פעם אחת עם בינוני ופעם אחת עם HBSS במשך שתי דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, לתקן את הדגימות ב 4% paraformaldehyde במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו שתי שטיפות מהירות ועדינות HBSS. לאחר הכביסה השנייה, השתמש במטליות קצה עדין כדי להסיר את עצם העצם הקדמית, את הרצועה הספירלית ואת קרום tectorial ולשטוף את האיבר המבודד של קורטי ב HBSS.יש לדאוג במיוחד בעת הסרת קרום tectorial שקוף מאז הרקמה על תאי השיער יכול להיפגע בקלות במהלך שלב זה. כדי לתייג את ה-F-actin, חלחלו לדגימות ב-0.5% טריטון X-100 ב-PBS בתוספת 100 עד 200 דילול של פאלואין עם תווית פלואורסצנטית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמות פעמיים עד שלוש פעמים HBSS טרי לכל לשטוף כפי שהוכח ואחריו לשטוף אחד PBS.השתמש באמצעי הרכבה מתאים כדי להרכיב את האיבר של רקמות קורטי על מיקרוסקופ זכוכית מחליק צדדים סטריאוציליה שיער למעלה ותמונה הדגימות על מיקרוסקופ קונפוקל פלואורסצנטי באמצעות המטרה טבילת שמן 63X. לאחר דגירה של שעתיים עם שלושה קילודלטון dextran פלואורסצנטי חידה עם טקסס אדום, איבר של קורטי explant מן יום שלאחר לידה סוג פראי שישה עכברים להפגין תיוג חזק וסגול של תאי שיער פנימיים וחיצוניים. הדמיה של stereocilia תא השיער וגופי התא מגלה כי רק תאים אלה אשר שילבו שלושה קילודאלטון dextran טקסס אדום בגוף התא שלהם גם הפגינו תיוג פלואורסצנטי של stereocilia שלהם.חשוב לציין, אות פלואורסצנטי אחיד נצפה לאורך הסטריאוסיליה עם העשרה בסוף שורות stereocilia קצר שבו ערוץ mechanotransduction ממוקם. מבנים דמויי Vesicle בגוף התא של תאי השיער ואת התאים התומכים השכנים נצפו גם מציע כי דקסטרן טקסס אדום יכול גם להילקח על ידי אנדוציטוזיס. גדול יותר 10 dextrans קילודלטון גם הפיק דפוס דמוי זן בגוף התא של תאי שיער ותאים תומכים.יש לציין, נוכחות של כלטור סידן או חוסמי תעלת mechanotransduction מונע תיוג stereocilia ואת ספיגת של שלושה קילודלטון dextran טקסס אדום בתאי שיער. דפוס דמוי ווסקל עדיין נצפתה בנוכחות מצור ערוץ mechanotransduction, עם זאת, המציין כי דפוס זה של ספיגה אינו תלוי ערוצי MET פונקציונליים. חשוב מאוד לנתח את האיבר של רקמת קורטי בזהירות ולאשר את האוריינטציה הנכונה של תאי השיער לפני הרכבה הרקמה להדמיה.לאחר תיוג דקסטרן של תאי שיער חיים ופונקציונליים, ניתן לבצע כשל חיסוני של הרקמה הקבועה כדי לזהות סוגי תאים ספציפיים של חלבונים מעניינים.

dextran-labeling-uptake-live-functional-murine-cochlear-hair

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

סרטון זה מדגים את ההקלטה המשולבת של פלט afferent מגורה מכנית ותיוג מסוף עצבי בזקיקי השיער של פינת עכבר. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בגירוי מכני של קצות העצבים של זקיקי השערה לפני ואחרי חשיפה לצבע פלואורסצנטי של קרום השיער, רישום אלקטרופיזיולוגי של פוטנציאלי הפעולה שנוצרו, והדמיה של תיוג מסוף העצבים בזקיקי השיער.

הקלטה משולבת של תפוקת Afferent מגורה מכנית ותיוג מסוף עצבי בזקיקי שיער עכבר

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי.  אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

קיימות שיטות שונות להחדרת חומרים אוטוטוקסיים לשבלול של מודלים של בעלי חיים. מוצג פרוטוקול כירורגי להעברת חומרים אוטוטוקסיים לגומחת החלון העגול. ההליך אמין, יוצר נגעים תוך-שבלוליים ממוקדים ומונע נזק מכני למיקרו-ארכיטקטורה. ניתן לבחון תיקון/התחדשות עצמית של השבלול.

גישת העכבר עגול החלון לototoxic סוכן משלוח: מהיר וטכניקה אמינה גרימת ניוון תא שבלול

אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר הבוגר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס). אנחנו גם מדגימים הליך immunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently. יחד טכניקות אלה יאפשרו המחקר של תאי שיער, תאי תמיכה, וסוגי תאים אחרים הנמצא בשבלול.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

מוצגת טכניקה פשוטה וחדשנית לרישום פריקה אפרנטית עקב גירוי מכני של מסופי lanceolate של קצות ה-palisade המעצבבים את עור אוזן העכבר, זקיקי שיער.

הקלטה משולב של תוויות מסוף פלט ועצב מבחינה מכנית מאולצת מביא ב Endings עכבר זקיק השיער אזמלי

כאן אנו מתארים הכנה חדשה להדמיית מסופים חושיים חיים של קצות מעקה המעצבבים את זקיקי השיער של עור אוזן העכבר במהלך צביעה והימנעות בצבעי סטיריל פירידיניום.

ניטור אופטי של תיוג מסוף העצב חיים זקיק השיער אזמלי Endings של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עור אוזן עכבר

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הטכניקה יכולה להיות מנוצל כמו כלי בדיקה במבחנה במחקרי שמיעה.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

מאמר זה מציג משטח שונה הכנה שבלול שיטה הדורשת decalcification ושימוש של תא ודבק רקמה לדבוק פיסות של epithelia לכסות 10 מ"מ כיסוי עגול עבור אימונוהיסטוכימיה העכבר למבוגרים כנימת.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

הפרוטוקול הנוכחי מעדכן פרוטוקולים קודמים ומשלב גישות פשוטות יחסית לגידול צמחי שבלול באיכות גבוהה. זה מספק איסוף נתונים אמין והדמיה ברזולוציה גבוהה בתאים חיים וקבועים. פרוטוקול זה תומך במגמה המתמשכת של חקר תאי האוזן הפנימית.

צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיפוח תאי שערת שבלול ראשוניים מעכברים. בתחילה, האיבר של קורטי נותח מהיילוד (בגיל 3-5 ימים) שבלול מורין תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, התאים עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי וזוהו באמצעות אימונופלואורסנציה לאחר מספר ימים בתרבית.

בידוד ותרבית של תאי שיער שבלול ראשוניים מעכברי יילודים

למדו שיטה לתיוג דקסטרן בצבע Texas Red בתאי שיער שמיעתיים חיים עם תעלות מכנוטרנסדוקציה תפקודיות. טכניקה זו מאפשרת הערכת פעילות התעלות וחקר אנדוציטוזה באיבר קורטי.

תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי

גלה סרטונים נוספים