תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ללמוד את ספיגת רגיל dextran פלואורסצנטי שכותרתו עם טקסס אדום בתאי שיער חיים עם ערוצי mechanotransduction פונקציונלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי שלושה קילודלטון טקסס רד dextran יכול לשמש כדי להעריך את תפקוד ערוץ mechanotransduction בתאי שיער חיים. כדי לקצור את השבריריים, מניחים את גולגולתו של עכבר יום שישי לאחר הלידה בצלחת תרבות של 60 מילימטר המכילה את מדיום L-15 של ליבוביץ' ולהשתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך שטחי מהקצה האחורי לקצה האחורי של הגולגולת ולאורך תעלות השמיעה החיצוניות.

מקפלים את העור לכיוון האף כדי לחשוף את הגולגולת ולעשות חתך מאחור לחזית הגולגולת ולאורך קו העין. מפרידים את הגולגולת לשני חצאים ולהשתמש מרית קטנה כדי להסיר את המוח. כאשר ניתן לראות את עצמות הזמן, השתמש במספריים קטנים כדי לחתוך סביב עצמות אלה כדי למלמל את הרקמה.

להטביע את עצמות הזמן בצלחת 35 מילימטר המכילה טרי L-15 בינוני ומ מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו מצויד עין שדה רחב מקור אור הלוגן זרם לסירוגין חיצוני. השתמש במקלפים כדי להסיר את רקמת הכילאר שמסביב, תעלות מעגליות למחצה ואיברים שיוויוני. לאחר שה שבלול הדם נותח והונח בצלחת חדשה עם מדיה L-15 טרייה, השתמש במלקחיים כירורגיים כדי לגרום לפצע דקירה אחד בחלון העגול ולנקב אחד באזור שבלול האפייה.

כאשר כל cochleae נקצרו, למקם את הרקמה לתוך באר של צלחת דיכאון זכוכית תשע באר המכיל 200 microliters של מדיום L-15 טרי. לתיוג דקסטרן של הרקמות המבודדות, החלף את המדיום מכל מדגם היטב עם 200 מיקרוליטרים של מדיום L-15 טרי בתוספת שני מיליגרם למיליליטר של הפלואורסצנטיות נדנוד דקסטרן של עניין. דגירה הדגימות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ו 25 סיבובים לדקה בשייקר תלת מימדי בזווית מוטה של 25 מעלות מוגן מפני אור.

בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמות פעם אחת עם בינוני ופעם אחת עם HBSS במשך שתי דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, לתקן את הדגימות ב 4% paraformaldehyde במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו שתי שטיפות מהירות ועדינות HBSS. לאחר הכביסה השנייה, השתמש במטליות קצה עדין כדי להסיר את עצם העצם הקדמית, את הרצועה הספירלית ואת קרום tectorial ולשטוף את האיבר המבודד של קורטי ב HBSS.

יש לדאוג במיוחד בעת הסרת קרום tectorial שקוף מאז הרקמה על תאי השיער יכול להיפגע בקלות במהלך שלב זה. כדי לתייג את ה-F-actin, חלחלו לדגימות ב-0.5% טריטון X-100 ב-PBS בתוספת 100 עד 200 דילול של פאלואין עם תווית פלואורסצנטית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמות פעמיים עד שלוש פעמים HBSS טרי לכל לשטוף כפי שהוכח ואחריו לשטוף אחד PBS.

השתמש באמצעי הרכבה מתאים כדי להרכיב את האיבר של רקמות קורטי על מיקרוסקופ זכוכית מחליק צדדים סטריאוציליה שיער למעלה ותמונה הדגימות על מיקרוסקופ קונפוקל פלואורסצנטי באמצעות המטרה טבילת שמן 63X. לאחר דגירה של שעתיים עם שלושה קילודלטון dextran פלואורסצנטי חידה עם טקסס אדום, איבר של קורטי explant מן יום שלאחר לידה סוג פראי שישה עכברים להפגין תיוג חזק וסגול של תאי שיער פנימיים וחיצוניים. הדמיה של stereocilia תא השיער וגופי התא מגלה כי רק תאים אלה אשר שילבו שלושה קילודאלטון dextran טקסס אדום בגוף התא שלהם גם הפגינו תיוג פלואורסצנטי של stereocilia שלהם.

חשוב לציין, אות פלואורסצנטי אחיד נצפה לאורך הסטריאוסיליה עם העשרה בסוף שורות stereocilia קצר שבו ערוץ mechanotransduction ממוקם. מבנים דמויי Vesicle בגוף התא של תאי השיער ואת התאים התומכים השכנים נצפו גם מציע כי דקסטרן טקסס אדום יכול גם להילקח על ידי אנדוציטוזיס. גדול יותר 10 dextrans קילודלטון גם הפיק דפוס דמוי זן בגוף התא של תאי שיער ותאים תומכים.

יש לציין, נוכחות של כלטור סידן או חוסמי תעלת mechanotransduction מונע תיוג stereocilia ואת ספיגת של שלושה קילודלטון dextran טקסס אדום בתאי שיער. דפוס דמוי ווסקל עדיין נצפתה בנוכחות מצור ערוץ mechanotransduction, עם זאת, המציין כי דפוס זה של ספיגה אינו תלוי ערוצי MET פונקציונליים. חשוב מאוד לנתח את האיבר של רקמת קורטי בזהירות ולאשר את האוריינטציה הנכונה של תאי השיער לפני הרכבה הרקמה להדמיה.

לאחר תיוג דקסטרן של תאי שיער חיים ופונקציונליים, ניתן לבצע כשל חיסוני של הרקמה הקבועה כדי לזהות סוגי תאים ספציפיים של חלבונים מעניינים.