אפיון מולקולה חד-מולקולות באמצעות זרימת הטיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית

כימות השינויים הקונפורמיים במולקולות ביולוגיות בודדות תחת זרימת הגזיר שימושי להבנת התפקוד והביופיזיקה של מקרומולקולות כמו חלבון ו- DNA. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר הדמיה בזמן אמת של מולקולות בודדות בסביבות זרימה פיזיולוגיות ברזולוציה זמנית ומזרית גבוהה. זה ללא תחרות על ידי טכניקות אחרות כמו AFM.

על ידי אפיון כוח ההטיה שתחתיו חלבונים ה-DNA שלנו יש שינויים קונפורמיים גלובליים, אפשר לעצב טוב יותר תרופות המחקות תכונות ביופיזיות אלה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן נרחב כדי ללמוד את ההתנהגות או פולימרים אחרים, במיוחד פולימרים ביולוגיים, בתנאי זרימה משתנים ולחקור את הריאולוגיה של נוזלים מורכבים. עיתוי הצעדים הוא קריטי להצלחה.

אנו ממליצים לתרגל את הטיפול משטח המכשיר microfluidic ומיקרוסקופיה פלואורסצנטי צעדים פעמים רבות כדי לבצע אותם בצורה יעילה. לכידת שינויים קונפורמיים בביומולקולים היא תופעה ויזואלית ודינמית התבהר בצורה הטובה ביותר על הסרט. מדענים יבינו טוב יותר שיטה זו לאחר שראו את החלבון בזמן אמת ומיקרוסקופיה DNA המוצגים בסרטון זה.

כדי להכין את המכשיר microfluidic, להוסיף חמישה חלקים של בסיס אלסטומר סיליקון לחלק אחד ריפוי סוכן בסירת שקילה. ומערבבים את התוכן ביסודיות במשך דקה אחת כדי ליצור פתרון PDMS נרפא מראש. מניחים את רקיק הסיליקון הראשי בצלחת פטרי מפלסטיק ויוצקים את תטגם PDMS על הוופל כדי ליצור שכבה של חמישה מילימטרים.

מכסים את המנה ומשאירים אותה בשובע תחת ואקום למשך שעה כדי להסיר בועות אוויר. ואז להדק את צלחת פטרי מכוסה ב 60 מעלות צלזיוס לילה כדי לרפא את PDMS לתוך מוצק גמיש, אשר יגרום ערוצים microfluidic להיות מעוצב לתוך PDMS בממשק רקיק PDMS. ביום שלמחרת, השתמש בתער כדי לחתוך 20 על ידי 10 מלבנים מילימטר סביב כל ערוץ microfluidic ב PDMS ולהסיר את בלוקים מלבניים עם פינצטה.

השתמש מחט קצה קהה 25-מד עם קצוות מחודדים כדי לחבוט חור בקוטר 0.5 מילימטר בקצה אחד של התעלה, לוודא כי החור עובר לחלוטין דרך בלוק PDMS. השתמש במחט דקה כדי לחבוט PDMS מתוך החור ולחזור על התהליך בקצה השני של הערוץ. מניחים את בלוק PDMS עם צד הערוץ למעלה ואת כיסוי לתוך התא של מכונת מליטה פלזמה ולהתחיל את הטיפול.

לאחר השלמת הטיפול, מקם במהירות את בלוק ה- PDMS על קו כיסוי כך שהתעלה נמצאת במגע עם הפתק. החל לחץ על הקצוות של הבלוק, ולאחר מכן למקם את הרכבה PDMS coverslip על צלחת חמה ב 115 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לחזק את הקשר הקבוע. לבסוף, הכנס אורך של 10 ס"מ.

צינור בקוטר פנימי של 0.25 מילימטר לתוך חור השקע בחלק העליון של בלוק PDMS כדי לאפשר לנוזל לזרום בקלות מהתעלה. עבור גורם פון וילברנד או ניסויים VWF להזריק עד 10 microliters של 10 מיקרוגרם למיליליטר BSA-ביוטין מומס PBS סטרילי 1X לתוך התוך של המכשיר microfluidic. לעכב כמה microliters של BSA-ביוטין בקצה פיפטה לאחר ההזרקה ולאפשר את הקצה להישאר מוטבע במבונית.

אפשר BSA-ביוטין דגירה במכשיר במשך שעתיים אשר יגרום BSA לא מחייב במיוחד על פני השטח coverslip. לאחר מכן להסיר את קצה פיפטה ולהזריק עד 10 microliters של פתרון חסימת קסטין לתוך הערוץ. אפשר לפתרון קסטין דגירה במשך 30 דקות, כך שהוא יכול לחסום את כל האתרים בחינם ולהפחית מחייב לא ספציפי של biomolecules על פני השטח.

הסר את הקצה ולהזריק עד 10 microliters של סטרפטבידין PBS סטרילי לתוך הערוץ, אשר ייקשר לקבוצות ביוטין של BSA-ביוטין. לאחר מכן, להזריק עד 10 microliters של פתרון דטרגנט לשטוף את סטרפטבידין עודף. הסר את הקצה ולהזריק גם VWF בתספורת קסטין או DNA lambda.

דגירה VWF במשך שלוש דקות או DNA lambda במשך 45 דקות. ואז להזריק חמישה ביוטין חינם מילימולר כדי לחסום את אתרי קשירה סטרפטבידין עודף. לטעון מיליליטר אחד של פתרון חסימת קמין לתוך מזרק ולאבטח אותו במשאבת מזרק.

לאחר מכן לצרף קצה אחד של צינורות המחט מזרק לזרום בתסרון כדי להסיר בועות אוויר. כשלוש דקות לאחר הזרקת ביוטין חינם לחבר את הקצה השני של הצינור לתוך ההתקן microfluidic. בחר את מטרת ההגדלה הגבוהה ביותר של המיקרוסקופ TIRF או הפלואורסצנטיות הקונפוקנטית.

במידת הצורך, מוסיפים טיפת שמן טבילה על המטרה. מניחים את המכשיר microfluidic על שלב המיקרוסקופ, כך coverslip הוא סומק עם המטרה. התחל מיקרוסקופיה של שדה בהיר והתאם את המוקד כך שתכונות כגון פסולת ובועות יהיו גלויות.

לאחר מכן התאימו את הבמה בכיווני X ו-Y עד שקצה הערוץ המיקרופלואידי יהיה גלוי וחצה את המסגרת. עברו לערוץ FITC והתאימו את רמת Z ואת זווית TIRF לפי הצורך עד שניתן יהיה להבדיל בין המולקולות הירוקות הבודדות. התאימו את עוצמת הלייזר ואת זמן החשיפה כדי לדמיין מולקולות פלואורסצנטיות מבלי לצלם אותן מהר מדי.

ואז להתאים את הניגוד כדי לדמיין טוב יותר את המולקולות. בדיוק חמש דקות לאחר הזרקת ביוטין חינם להתחיל לעצור את הזרימה ממשאבת המזרק כדי לבחון את השינויים קונפורמציה מולקולרית באמצעות שיעורי זרימה בין 5000 ו 30, 000 microliters לשעה. עם VWF זה קריטי ליישם לפחות כמות קטנה של זרימה, כגון 30 שניות של 10, 000 מיקרוליטר לשעה לזרום בדיוק חמש דקות לאחר הזרקת ביוטין חינם.

חזור על זה לאורך אזורים שונים של המכשיר microfluidic ולאתר מולקולות שיכולות להרחיב ולהירגע על מחזורים מרובים של התחלה ועצירת זרימה. שים לב כמה זמן לוקח למולקולות להגיע להארכה מקסימלית ולהשלים הרפיה ולהקליט קטעי וידאו של התנהגות רציפה של מולקולות תחת זרימת הגזלה. הגמישות של מולקולה לשנות אישור מוכחת לעתים קרובות על ידי יכולתו להתארך ככל ששיעורי הטיה גבוהים יותר מוחלים עקב זרימה גוברת.

ההרחבה לעומת עקומת קצב ההטיה של מולקולת גורם פון וילברנד שימושית לאפיון המאפיינים הביומכניים של החלבון. תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות של דנ"א למדה מראות גם הארכה מוגברת בשיעורי גימה גבוהים יותר ב-30 שניות ורגיעה הדרגתית במשך שתי דקות לאחר שהזרימה נעצרת. כאשר עובדים עם VWF, זכור להחגירה זה רק במשך שלוש דקות ביוטין חינם במשך חמש דקות לפני תחילת הזרימה.

זה קריטי לצורת המספר האופטימלי או הקישורים ביוטין סטרפטוודין הדרושים לחשיפה הפיכה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לדמיין אינטראקציות בזמן אמת בין ביומולקולים מרובים ולאפיין את הפונקציות שלהם. לדוגמה, אפשר להבין טוב יותר היווצרות תקע טסיות דם על ידי הדמיה VWF נפרם תחת גזיר גבוה ואת הכריכה שלה עם מולקולת הידבקות טסיות GPIb-אלפא בשיטה זו.