גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל

באמצעות מיקרוסקופ תוך-ויטמינים, פרוטוקול זה מאפשר הדמיה בזמן אמת של רקמת המעי עד לרזולוציה של תא יחיד וחקר תהליכים דינמיים ביותר כגון שפיכת תאים. בשילוב עם ניסויי מעקב סטנדרטיים, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של הפרעות חדרות מעיים ב vivo ואת ההבחנה בין פרה וחדרות transcellular. פרוטוקול זה יכול לשמש כבסיס לפיתוח גישות מיקרוסקופיות תוך-ויטמינים נוספות להדמיית תהליכים תאיים דינמיים אחרים של תחומי עניין ברקמות שונות.

הדגמה חזותית של שיטה זו חיונית להבנת שלבי ההכנה הכירורגית ולמיקום החיה החיה באופן המאפשר רכישת תמונה על פני הריר במעיים. לפני תחילת ההליך, הפעל את הבסיס ואת תיבת הסורק של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל ולחץ להתחיל להפעיל את המחשב. הפעל את התוכנה לרכישת תמונה ובחר את התצורה המתאימה.

כדי להגדיר את רזולוציית התמונה המתאימה, בחר תצורה, חומרה, רזולוציה, עומק סיביות ו- 12. תחת תפריט הרכישה, בחר XYZT עבור מצב רכישת התמונה והגדר את המטרה לפי 20 או 40. כדי להגדיר את הגדרת הרכישה הרציף, לחץ על חפש והוסף ובחר בין מסגרות.

כדי לקבוע את התצורה של רצף 1, הפעל את תיבת הלייזר הגלויה. הגדר צינור photomultiplier אחד על ולהגדיר את אורך גל הפליטה. כדי לקבוע את התצורה של רצף 2, הפעל את תיבת הלייזר הגלויה.

הגדר את צינור photomultiplier 2 כדי להגדיר את אורך גל הפליטה. לאחר מכן הפעל את הלייזרים המתאימים. לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ הבוהן, להשתמש ניצן כותנה להחיל משחה על העיניים של העכבר הרדמה ולעשות חתך סנטימטר אחד באזור החדר השמאלי של הבטן.

השתמש במקלפים כדי לחלק חיצוני קטע של שלושה עד חמישה סנטימטרים של המעי. בצע שני חתכים קטנים בחלק העליון והתחתון של קטע המעיים ולהכניס micropipette זכוכית לתוך לומן המעי. לאחר מכן השתמש אלקטרוקוטריזציה כדי לפתוח את קטע המעי החיצוני אורך לאורך הצד האנטי-mesenteric ולחשוף את רירית.

לשטוף את הרקמה בקצרה עם תמיסת מלח כדי להסיר את התוכן צואה. להכתמת משטח רירית המעי, יש למרוח 100 מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר של תווי אקריפלבין בטיפות על פני הריר החשופים ולאפשר לכתם להתפתח במשך שלוש דקות לפני שטיפת הפתרון הנותר עם PBS. לאחר מכן, להחיל 100 microliters של שתי מיליגרם לכל פתרון מיליליטר רודמין דקסטרן טיפות לריר עבור דגירה של שלוש דקות לפני שטיפה עם PBS.

לאחר מכן מניחים את העכבר הרדמה על שקופית כיסוי רכוב על התא שטוף עם 37 מעלות צלזיוס מלוחים, התאמת המיקום במידת הצורך, ולהמקם את ההכנה על שלב מיקרוסקופ הפוך. מיד לאחר הנחת העכבר על הבמה, הפעל את מקור האור והתאם את מיקום ה- XY עד שציר התאורה יתמקד בהכנת הרקמה. כדי לבחור את שדה הראייה, בחר את קוביית המסנן המתאימה.

פתח את התריס ולהשתמש במאקרו וגלגלי מיקרו להתמקד על פני השטח של רירית המעי. התאימו את מיקום ה-XY כדי לאתר אזור שבו ניתן לדמיין מספר villi בשדה הראייה ולשנות את קוביית המסנן כדי לוודא שהכתמת הרודמין דקסטרן גלויה גם באזור זה. כאשר זוהה אזור עניין, התחל את רכישת התמונה ובחר רצף אחד כדי להתאים את עוצמת הלייזר, הרווח וההיסט עבור רצף ראשון.

לאחר מכן בחרו רצף 2 והתאיימו את עוצמת הלייזר, הרווח והיסט לרצף 2. להגדרת טווח מחסנית Z, פתחו את התפריט הנפתח 'מחסנית Z'. השתמש בפקד Z-Access כדי להתמקד על פני השטח של רירית ולחץ להתחיל.

התמקד בגבול התחתון של המקום שבו האות עדיין ניתן לזיהוי ולחץ על סיום. הגדר את המספרים של ערימות Z, הימנעות מכשלי זמן ארוכים משתי דקות עבור שתי נקודות זמן רצופות ופתיח את תפריט הזמן כדי לבחור למזער ולרכוש עד עצירה. כדי להגדיר את ממוצע הקו, בחר באפשרות חפש ממוצע אחד, ממוצע שורה 2, חפש שניים וממוצע שורה 2.

לאחר מכן, כדי לרכוש תמונות, הגדר את התבנית ל- 1024 x 1024 פיקסלים ואת המהירות ל- 400 ולחץ על התחל. עכברים מותנים GGTase ספציפיים לתאי מעיים פיתחו פתולוגיה מעיים חמורה כפי שהוכח על ידי עלייה בציון הנזק ההיסטולוגי של המעי הדק וחדירות אפיתל מעיים מוגברת ניתן לזהות גם באמצעות מעקב בניסויים in-vivo באמצעות FITC-dextran מנוהל דרך הפה. ניתן לזהות אירועי שפיכת תאים כתאים הנעים מתוך המונולר האפיתל לתוך הלומן, מה שמוביל לפערים זמניים בתקרת האפיתל שנסגרים לבסוף על ידי המגע בין התאים השכנים, מה שמכונה אפקט רוכסן.

פערים אלה נצפים הן בעכברים שולטים והן בעכברים לקויים של GGTase, אם כי התדירות של תופעה זו גבוהה יותר אצל האחרונים. מעניין, תאים אחרים מופיעים גם ספיגת dextran. אירועי תא חדירים אלה מתרחשים גם בעיקר בעכברי נוקאאוט מותנים.

ניתן לבצע את הכשל החיסוני של חלבוני צומת הקשורים לציטוסקלטון ולהדוק כדי לזהות מטרות ספציפיות התורמות להפרעות חסכנות אפיתל פוטנציאליות שנקבעו באמצעות מיקרוסקופיה תוך-בלתי נמנעת. שיטה זו יכולה לשמש לניתוח של תופעות אחרות על פני השטח של רירית המעי, כגון דליפה אנדותל או תקשורת אפיתל החיסון בהקשר של זיהום מעיים.