פיתוח מודל לזיהום של זחל בדג במשך שינוי קושי

שיטה זו יכולה לענות על שאלת המפתח על התפקיד של מערכת החיסון המולדת בזיהום Clostridium, כמו אם וכיצד מקרופאגים לזהות או phagocytose פתוגן זה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שזה יכול להיות מיושם על חיידקים אנאירוביים רבים ושונים, כי זמן הזיהום יכול להיות מניפולציה, כי הממשל אוראלי מייצג את הזיהום האנושי נורמלי הרבה יותר קרוב. לאחר culturing, להעביר מיליליטר אחד של התרבות לתוך cuvette ספקטרופוטומטר, ולמדוד את OD600.

העבר את הסכום הנדרש לתוך צינור טרי 1.5 מיליליטר על מנת להגיע OD הסופי של אחד ל 1.2 במיליליטר אחד של נפח סופי. לשטוף פעם אחת עם מיליליטר אחד של 1X PBS, וצנטריפוגה ב 5, 000 פעמים גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. תן שימוש חוזר במיליליטר אחד של 1X PBS.

הוסף שלושה microliters של פתרון עבודה של צבע פלואורסצנטי מוכן לתוך ההשעיה חיידקית מיליליטר אחד. הדגירה את המדגם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, לשטוף את Clostridioides מוכתם difficile פעם אחת עם 1X PBS כדי להסיר צבע שיורית, ולתלות במיליליטר אחד של 1X PBS כדי להשיג OD600 של 1.0.

ראשית, מניחים ירידה של 0.8% בהמסה נמוכה על הזחלים של דגי הזברה בצלחת פטרי לכיסוי. כוונן בעדינות את הזחלים למיקום אוריגלי. מניחים את צלחת פטרי על קרח במשך 30 עד 60 שניות כדי לאפשר אגרוז נמס נמוך להתגבש.

הוסיפו 30%-30% מהמדיום של דניאו המכיל 0.02%-0.04% טריקאין לכיסוי ההתעוררות. להכנת פתרון הזרקה, הוסיפו מיקרוליטר אחד של 0.5% פנול אדום בתתכונת PBS לתשעה מיקרוליטרים של קולוקולום קלוסטרידיואידים מוכתמים בצבע. לטעון מחט microinjection מכויל עם פתרון ההזרקה באמצעות Microloader.

הר את המחט הטעונה לתוך מיקרומניפולטור, והצב אותה תחת מיקרוסקופ סטריאו. התאימו את לחץ ההזרקה בין 600 ל-900 hectopascals. קבע את זמן ההזרקה ל-0.1 עד 0.3 שניות כדי להשיג 0.5 עד 1.0 ננוליטר.

מניחים את המחט במיקרומניפולטור בזווית של כ-45 מעלות, ומצביעים לכיוון הזחלים המוטבעים. מניחים את קצה המחט מעל מערכת העיכול, קרוב לנקבובית urogenital. פירס דרך התעוררות, אז השריר עם קצה המחט.

ואז להכניס אותו לתוך לומן המעי, ולהזריק 0.5 כדי 1.0 nanoliters של Clostridioides difficile. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח על הזחלים המוזרקים, ולהשתמש בקצה Microloader גמיש כדי לקלוט את הזחלים מוזרק כראוי עבור הדמיה קונפוקל. בצלחת אגרוז 1.5% עם חריצים, מניחים ירידה של 0.8% בהמסה נמוכה על זחלי הזברה כדי לכסות.

כוונן בעדינות את הזחלים עם ראשים הפונים זקוף בזוויות של 45 מעלות החריץ והזנבות על קיר החריץ. בעדינות להפעיל את המחט דרך האגרוז, ולאחר מכן לתוך הפה של זחלים זברה, דרך הוושט. לאחר קצה המחט הוא בתוך הנורה במעיים לפני, לחץ על דוושת ההזרקה כדי לשחרר 0.5 כדי nanoliters אחד של תרבות החיידקים.

מלא את לומן המעי. אל תיתן לו לגלוש מן הוושט או cloaca. מוציאים בעדינות את המחט מפי דג הזברה.

לאחר gavage, להציל את הזחלים הזברה נגוע מן agarose עם קצה Microloader גמיש על ידי תחילה חיתוך אגרוז משם, ולאחר מכן על ידי הרמת הזחלים. מעבירים את הזחלים האלה למדיום סטרילי של דניו 30%, ושטיפת פעמיים. לאחר הרדמה של זחלי הזברה, הוסיפו 200 עד 300 מיקרוליטרים של אגרוז נמס נמוך של 1% כדי לכסות את הזחלים שעברו הרדמה.

מניחים את האזור הנגוע של הזחלים על מגלשת זכוכית קרוב ככל האפשר. תן לתעורר להתגבש על קרח למשך 30 עד 60 שניות. טביעה עלתה למדיום של דניו עם 0.02%-0.04%.

המשך לדמיין את הזחלים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל. לאחר המתת זחלי הזברה הנגועים, הכנס מחט לתא המטען הגבי של זחלי זברה קרוב לראש כדי לשתק את דג הזברה. הסר את הראש מאחורי הזימים עם רומח.

הכנס מחט שנייה לאמצע תא המטען הגבי. הכנס מחט שלישית לתוך הבטן של דג הזברה, ולמשוך את המעי מתוך חלל הגוף. השתמש מחט microinjection להעביר 10 עד 15 מעיים לתוך צינור 1.5 מיליליטר המכיל 200 microliters של PBS 1X סטרילי.

הומוגניזציה של המעיים עם עלה כדי לשבש את הרקמה ולהכין הומוגניטים. ודא העלי מגיע לתחתית הצינור כדי לשבש את כל המעיים לחלוטין. לתוך homogenates, להוסיף Clostridioides דיפיסיל גידול בינוני המכיל D-ציקלוזרין ו cefoxitin, עם או בלי taurocholate, ודגירה בתא אנאירובי.

במחקר זה, הן נויטרופילים והן מקרופאגים מגיעים לאתרי ההדבקה. הדוגמה של מקרופאג פעיל phagocytizing שני חיידקים מראה את ניקוי על ידי phagocytosis ועיכול של קלוסטרידיואידים שכותרתו difficile. המיקרו-גוויאז' כדי לספק Clostridioides שכותרתו פלואורסצנטיות difficile לתוך לומן המעי של שורות כתב מקרופאג ונויטרופילים בחמישה ימים לאחר ההפריה מחקה את הנתיב הטבעי של זיהום Difficile Clostridioides.

עם זאת, נויטרופילים ומאקרופאגים לא הראה הגירה ברורה למערכת העיכול עד 12 שעות לאחר microgavage. בינתיים, פלואורסצנטיות של Difficile Clostridioides שכותרתו נעלם לאחר כחמש שעות לאחר microgavage. דגימות מעיים 24 שעות לאחר ההדבקה נותפו והראו צמיחה חיידקית.

לא גדלו חיידקים בקבוצת הביקורת. בנקודות זמן מאוחרות יותר, דגימות דגירה רק גדל במדיום המכיל TCA, מה שמרמז כי סך Clostridioides difficile במעיים יצרו נבגים. 16S rDNA PCR זיהה את החיידק גדל כמו Clostridioides difficile, אשר מייצרים אמפיקנים PCR ספציפי בגודל צפוי סביב 800 זוגות בסיס.

תרבות חיידקים שגדלו על צלחת כרומיד הופיעו כמושבות שחורות טיפוסיות, מה שהצביע עוד יותר על כך שחיידקים ממעי הזברה היו קלוסטרואידים שונים. עבודה עם חיידקים אנאירוביים דורשת כי הצעדים האירוביים נשמרים קצרים כי זה משפיע על הביולוגיה של החיידקים כמובן. תא חיסוני המולד בזברה-דג יכול להיות מניפולציה.

לדוגמה, הם יכולים לפענח את המנגנון של תגובות תאי החיסון המולדים לזיהום. השיטה שלנו הצביעה על כך שזברה-דג יכול להיות כלי לחקר פתוגן אנאירובי ממעי האדם. עבודה עם פתוגנים עמידים רב דורשת שננקטים אמצעי בטיחות מתאימים.