הדמיה וניתוח עורקי קשת והלוע באמצעות שחזור-הר אימונוהיסטוכימיה ותלת מימד

שיטה זו מאפשרת לכל קשת לוע להיות ממודרת. לאחר מכן ניתן לכמת מספרי תאים אנדותל בכל קשת כאמצעי לחקר התפתחות עורק הקשת הלוע. היתרונות העיקריים של גישה זו הם היכולת לדמיין את היחסים בין מבני כלי דם שונים ואת היכולת לקבוע כמותית כיצד המבנים השפיעו על המוטנטים.

עורקי קשת האאורטיק עוברים מוטציה נפוצה במחלות לב מולדות. השיטה שלנו מאפשרת לחקור כיצד מוטציות משנות את התהליך הפיזיולוגי של היווצרות כלי שיט ושיפוץ. למרות שאנו משתמשים בשיטה זו כדי לקבל תובנות לתוך המנגנונים של מחלת לב מולדת, זה יכול להיות מיושם על מערכות אחרות במיוחד עם הופעתו של מיקרוסקופיה גיליון אור.

התחל על ידי שימוש פיפטה זכוכית להעביר כל יום עוברי עכבר 9.5 או 10.5 עובר לתוך צינורות בודדים שני מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של PBS. לאחר קיבעון, להשתמש במקלות בסדר כדי לצבוט בזהירות את העובר ממש מעל hindlimb ולעשות חתך רוחבי כדי להסיר את החצי האחורי של העובר. כדי לחלחל לעוברים, החלף את ה- PBS ב- PBST והצב את העוברים בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה בן לילה.

למחרת, החלף את PBST עם 600 microliters של חיץ חסימה מבלי לגעת בעוברים עבור דגירה של 16 עד 18 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. למחרת בבוקר, החלף את חיץ החסימה עם 600 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי של עניין לצינור עבור דגירה של ארבעה עד חמישה ימים בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה. בסוף הדגירה, לשטוף את העוברים במיליליטר אחד של PBST במשך ארבע עד חמש שעות עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר שינוי PBS כל שעה, ואחריו דגירה לילה PBST טרי בארבע מעלות צלזיוס וארבע עד חמש שטיפות נוספות של שעה למחרת.

לאחר הכביסה האחרונה, החלף את ה- PBST בכל צינור ב- 600 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים המשני המתאים עבור דגירה של ארבעה עד חמישה ימים בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את העוברים במיליליטר אחד של PBST טרי לכל לשטוף כפי שהודגם רק ולהשתמש פיפטה זכוכית בעדינות להעביר כל עובר לתוך תבניות פרפין פלסטיק בודדים. הסר בזהירות כל PBST מסביב לכל עובר וכוון כל עובר בתאונה קשתית.

לאחר מכן מוסיפים במהירות כ-500 מיקרוליטרים של אגרוז חם לכל עובש עד שכל עובר מכוסה ומ מניחים את התבניות על קרח מכוסה בנייר אלומיניום עד שהאגרוז מתגבש. להתייבשות הדגימות העובריות, השתמשו באזמל נקי כדי לחתוך גוש אגרוז סביב כל עובר ולהשתמש במטלות כדי לתפוס את אגרוז להעברה לצינור שני מיליליטר שכותרתו המכיל מיליליטר אחד של 25% מתנול. לאחר דגירה של שעה עם תסיסה עדינה בחושך, החלף 25% מתנול עם מיליליטר אחד של 50% מתנול לצינור עבור דגירה נוספת של שעה בחושך.

לאחר סיום ההתייבשות, החליפו את המתנול ב-100% מתנול במיליליטר אחד של 50% BABB עבור דגירה של שעה עם תסיסה עדינה בחושך. בסוף הדגירה, החלף את BABB 50% עם מיליליטר אחד של 100% BABB לצינור עבור דגירה של שעה אחת עם תסיסה עדינה בחושך, ואחריו דגירה שנייה עם 100% BABB כפי שהודגם רק. כדי לעלות על העוברים להדמיה, להסיר את דבק מפגוש היטב מהיר ולהמקם את הפגוש על 24 על ידי שישה מיליליטר מספר 1.5 כיסויי זכוכית.

החל לחץ עדין על דבק כדי להסיר את כל בועות האוויר בין כיסוי הפגוש בזהירות להשליך את 100% BABB מכל צינור. לאחר מכן השתמש במקלות עדינים כדי להעביר בזהירות את העובר לתוך הבאר המהירה מבלי לגעת בעובר ולהחיל כיסוי שני על הפגוש. כדי לצוף אנדותל בכל קשת הלוע השלישית, לפתוח את התמונה של עניין בתוכנה ולחץ להוסיף משטח חדש.

לחץ פעמיים על משטח אחד ושנה את שם המשטח החדש לקשת הלוע השלישית. בחרו 'דלג על יצירה אוטומטית', ערכו ידנית והגדירו את כיוון הפנים למישור YZ. השתמש במיקום הפרוסה כדי למקם את מישור פני השטח השלישי של קשת הלוע למקום שבו PAA השלישי ו- dorsal aorta מתחברים.

סובב את התמונה כך שמישור פני השטח השלישי של קשת הלוע יהיה בתצוגה ויכבה את כלי הפריסה של אורתו. תחת מצב מתאר ציור, בחר את פונקציית מצב ציור המרחק והתאם את הגדרות הפרמטר לפי הצורך. לאחר שכל הפרמטרים נקבעו, הקש על מקש Escape ולחץ על צייר כדי לעקוב אחר ההיקף של קשת הלוע השלישית באמצעות סמן העכבר.

לאחר מכן השתמשו בתמרור הפרוסה כדי להזיז 10 עד 25 פרוסות ולעקוב אחר היקף קשת הלוע. לאחר מעקב אחר הקשת כולה, לחץ על צור משטח כדי ליצור את פני השטח של האזור שעקבו אחריה. למסיכה של המבנים שעל פני השטח, בתפריט העריכה, בחרו בחירת מסיכה עבור PAA ו- DAPI השלישי ולחצו על הלחצן 'אשר'. לאחר מכן שנה את שם הערוץ החדש כ- DAPI של PAA.

חזור על שלב זה עבור הערוצים הנותרים. כדי להמחיש את מקלעת ה- endothelial בנפרד מה- PAA, בחר בחירת מסיכה עבור ה- PAA השלישי ובחר DAPI. בטלו את הסימון של voxels נבחרים מחוץ למשטח ובדקו עד כדי כך את הווקסלים הנבחרים בפנים.

הגדר את הווקסלים הנבחרים בתוך פני השטח לאפס ולחץ על אישור. שנה את שם הערוץ החדש כ- DAPI שאינו PAA. חזור על שלב זה עבור הערוצים הנותרים. בחרו בחירת מסיכה עבור ה- PA השלישי ובחרו DAPI שאינו PAA ולחצו על הלחצן 'אשר'. שנה את שם הערוץ החדש כ- DAPI של מקלעת.

חזור על שלב זה עבור הערוצים הנותרים. לכימות תאי ה אנדותל בודדים בתוך כל מבנה מעניין, בחלונית 'התאמות תצוגה', כבו את כל הערוצים למעט ערוץ PAA ERG. תחת תפריט מאפיינים, לחץ על הוסף כתמים חדשים ולחץ כדי לשנות שם של נקודות מספר אחד הכולל של תאי אנדותל של PAA.

לחץ על החץ הכחול ובחר בערוץ PAA ERG עבור ערוץ המקור. התאימו את קוטר ה-XY המשוער לארבעה מיקרומטרים ולחצו על החץ הכחול כדי להמשיך לחלונית הבאה. השתמש בסולם ההזזה כדי להתאים את מספר הנקודות כדי להבטיח שכל גרעין תא אנדותל חיובי של ERG מיוצג על ידי נקודה אחת.

לאחר מכן, לחצו על החץ הכפול הירוק וכבו את ערוץ PAA ERG בחלונית 'התאמת תצוגה'. הפעל את ערוץ PAA VEGFR2 כדי להמחיש את אנדותל PAA ולחץ על עריכה והוספה/מחיקה כדי לבחור משטח של אובייקט. לאחר מכן הקישו Escape והחזיקו את מקש Shift לחוץ כדי למחוק נקודות אינן חיוביות VEGFR2 ולחצו על הכרטיסייה סטטיסטיקה כדי לקבוע את המספר הכולל של תאי אנדותל.

שפעת חיסונית של הר שלם מייצרת תוצאות ברורות ונקיות המאפשרות שחזור תלת-מימדי של אנדותל הקשת הלוע. בתמונה זו, הנוכחות של נקודות בהירות גדולות היא תוצאה של חלקיקים או הנוגדן או חסימת פתרונות חיץ. לאחר קשת הלוע וכתמי משטח PAA, השימוש בפונקציית המסכה מאפשר להפריד את האזורים שעל פני השטח ולנתח אותם באופן עצמאי.

מיסוך מאפשר גם ניתוח וכמות אינדיבידואליים של מספרי תאים אנדותל בתוך כל מבנה. לדוגמה, כאן נעשה שימוש בתכונת הספוט לכימות המספר הכולל של תאי אנדותל הן ב- PAA והן במקלה על-ידי הקצאת נקודה בודדת עבור כל גרעין המבטא ERG. בתמונה זו, נקודה שלילית VEGFR2 חיובי ERG שנוצר על ידי פונקציית ספוט ניתן לראות.

לכן, חיוני לוודא שכל נקודה המזוהה על-ידי התוכנה מייצגת למעשה תא אנדותל יחיד. כדי להשיג תמונות נקיות וברורות, זכרו לסובב את כל הפתרונות ולשטוף כראוי וביסודיות כל עובר לאחר דגירה של נוגדנים. חשוב לזכור כי BABB הוא מאכל ורעיל.

לטפל ולהשליך את הממס כראוי הקפד לאטום את העוברים מומס לחלוטין כדי למנוע דליפת BABB.