נוק-דאון מותנה משולב ואסא היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד גן הקשורים לגזע של תאי גזע נגזר סרטן הקיבה נגזר

תאי גזע סרטניים מעורבים גרורות סרטן relapsed על עמידות לתרופות. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לחקר הפונקציות של גנים מרכזיים בתאי גזע סרטניים. באמצעות מערכת נוקאאוט מותנית והתאמה מותאמת של היווצרות כדור, שיטה זו מותאמת בקלות לחקר פונקציות במבחנה וב-vivo על גנים הקשורים לגזע בסוגים שונים של תאי גזע סרטניים.

להדגים את ההליך, יהיו יואטינג לי ושיאנגיו טאן, עוזרי מחקר מהמעבדה שלי. כדי ליצור חלקיקי lentivirus, זרע ארבעה מיליון תאי אריזה lentiviral 293T לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר עם 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, לוודא כי התאים הם 50 עד 80% confluent ביום של transfection.

הביאו ירידה בטמפרטורת הסרום לטמפרטורת החדר והכינו צינורות A ו-B בהתאם לכיווני כתב היד. מוסיפים את תכולת הצינור A לצינור B.Mix היטב ומדגירה את הצינור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכין מתחמי שומנים בדנ"א. הסר חמישה מיליליטר של מדיום מן צלחת תרבות התא.

לאחר מכן מוסיפים חמישה מיליליטר של קומפלקס השומנים-DNA לתוך צלחת תרבות התא טיפה חכם בעדינות מערבל את המנה. הדגירה את צלחת התרבות במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, הסר בזהירות את מדיום ההמרה והחלף אותו ב-10 מיליליטר של DMEM מחומם מראש בתוספת 10%FBS.

דגירה התאים לעוד 24 שעות. כ 48 שעות לאחר transfection, לקצור 10 מיליליטר של lentivirus המכיל על טבעי ולסנן אותם עם מסנן 0.45 מיקרומטר לשפוך כדי להסיר פסולת הסלולר. כל כלי תרבות התא, טיפים, מסננים ומזרקים עשויים להכיל lentivirus ויש לטפל עם 10% אקונומיקה לפני סילוק.

מעבירים על-טבעי מובהר למיכל סטרילי. מוסיפים את רכז Lenti-X ומערבבים עם היפוך עדין. הדגירה את התערובת בארבע מעלות צלזיוס לילה.

ביום שלמחר, צנטריפוגה המדגם ב 1500 פעמים G במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את supernatant, דואג לא להפריע את גלולה בתחתית. בעדינות להשעות את גלולה במיליליטר אחד של DMEM בתוספת 10% FBS ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.

זרעים 6 מיליון תאי גזע סרטניים קיבה או GCSC של לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר עם 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS. תרבו את התאים במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. כאשר התאים מגיעים ל-70 עד 80%, שאפו את המדיום מהצלחת והוסיפו את החלקיקים המרוכזים המדוללים בארבעה מילימטרים של מדיום DMEM שלם, המכילים רגנט פוליברין.

מחזירים את התאים לאנקובטור למשך 18 שעות. פוליברין צריך להיבדק בתנאים שונים כדי לקבוע את הריכוז היעיל, אשר בדרך כלל בטווח של 2 עד 10 מיליגרם למיליליטר. לאחר 18 שעות, החלף את המדיום ב- 10 מיליליטר של DMEM ב- 10%FBS והחזר את התאים לאנקובטור למשך 24 שעות.

לאחר מכן, שאפו את העל-טבעי עם פסולת התאים והוסיפו DMEM טרי בתוספת 10%FBS ו-2.5 מיקרוגרם למיליליטר של פורומיצין. דגירה התאים לעוד 24 שעות. לאחר מכן, לשנות את המדיום שוב DMEM טרי בתוספת 10%FBS וחמישה מיקרוגרם למיליליטר Puromycin.

לאחר דגירה נוספת 24 שעות ביממה, לשטוף את GCSCs חסיד פעמיים עם חמישה מיליליטר של DPBS ללא סידן ומגנזיום. נתק את התאים עם מיליליטר אחד של פתרון ניתוב תאים מחומם מראש ותדגר אותם במשך שתיים עד שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של טרי מחומם מראש GCSC להשלים את מדיום התרבות כדי ההשעיה התא.

מחלקים שלושה מיליליטר של ההשעיה הזאת לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר להקפאה, ושלושת המיליליטרים האחרים לתוך צינור אחר לגיוס עם דוקסיציקלין. צנטריפוגה שני הצינורות ב 800 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר מכן, שאפו את העל-טבעי מצינור B והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות שלם GCSC מחומם מראש.

זרע מספר מתאים של תאים לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר חדש עם 10 מיליליטר של טרי מחומם מראש GCSC תרבות מלאה בינוני ו 2.5 מיקרוגרם לכל דוקסיציקלין מיליליטר. לאחר מכן, לה הדגירה את המנה במשך 48 שעות. השתמש ב מונה תאים אוטומטי כדי לקבוע את הצפיפות של דגימת תאים של 10 מיקרוליטר.

לאחר מכן, להתאים את עוצמת הקול עם אמצעי תרבות מלא GCSC מחומם מראש כדי לקבל ריכוז של 20, 000 תאים קיימא למיליליטר. לוותר על 100 microliters של ההשעיה התא לתוך כל באר של חדש, חיבור נמוך במיוחד 96 צלחת תרבות היטב. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

היווצרות כדור צריכה להתרחש בתוך שלושה עד עשרה ימים. תדמיין את היווצרות כדור הגידול כל יומיים. סרטן קיבה תאי גזע מן אדנוקרצינומה קיבה אנושית ראשונית היו מתורבתים במדיום תרבות ללא סרום.

לאחר שישה ימים, התאים התרחבו מתא יחיד כמו פנוטיפ לכדורים גדולים. כדי להעריך את הפונקציה של clusterin GCSCs, רצפי RNA סיכת ראש קצרים נגד clusterin היו משובט לתוך וקטור Tet-GV307-RFP-Puro. תאים שעברו חילוף בווקטור הביטוי טופלו ב דוקסיציקלין במשך 48 שעות.

לאחר מכן, ביטוי האשכולות אומת על ידי כתם מערבי וכמת על ידי צפיפות. הנוכחות של דוקסיציקלין ונוקאאוט של clusterin ב GCSCs עיכב היווצרות כדור הגידול. בעוד שום עיכוב של היווצרות כדור הגידול נצפתה בתאים שהתומרו עם פקדי shRNA מקושקשות, המציין כי דוקסיציקלין לבד לא לעכב היווצרות כדור הגידול.

תוצאות אלה מצביעות על כך שלאחר השתחת clusterin, GCSCs לגדול לאט ולא יכול ליצור כדורי גידול. בהתבסס על נתונים אלה, clusterin ממלא תפקיד קריטי בקידום פעילות התחדשות עצמית של GCSCs, המציין כי זה יכול להיות יעד תרופה מבטיחה לדיכוי תאי גזע סרטניים בחולים בסרטן קיבה. כדורי הגידול צריכים להיות מבנים עגולים מוצקים על תאים בודדים או מצטברים, לא צריך להיחשב כדורי גידול.

עם זאת, כמה תאי גזע סרטניים לא יכול ליצור מבנים טיפוסיים כדור הגידול. הליך זה ניתן לבצע עם שיטות אחרות כדי לבחון תא גזע סרטן עבור פוטנציאל מתחדש במבחנה. לדוגמה, ניתן ללמוד את הביטוי של סמנים הקשורים לגזע.

ניתן להאריך את הפרוטוקול כדי לחקור את הפונקציות של הגנים הקריטיים בתאי גזע סרטניים כגון גזע על הישרדות.