Name: זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: למדו זיהוי אינטראקציות קולטן-ליגנד בשטח התא באמצעות מסכים גנטיים בקנה מידה גנומי CRISPR/Cas9. שיטה זו מאפשרת גילוי ללא הטיות של אינטראקציות תאיות ליישומים תרפויטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק ברוכים המספרים מספר 206194 הוענק GJW. אנו מודים למרכז Cy, Try Core: דבורה לינג Ng, ג'ניפר גרהם, סם תומפסון, וכריסטופר הול לעזרה עם FACS.

<ol><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+biological+systems%3A+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li>
<li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+intercellular+adhesion%3A+the+importance+of+weak+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transient intercellular adhesion: the importance of weak protein-protein interactions.</a> Trends in Biochemical Sciences. 19 (9), 354-358 (1994).</li>
<li>Wood, L., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+identify+extracellular+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to identify extracellular receptor-ligand interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 56, 28-36 (2019).</li>
<li>Bushell, K. M., Söllner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li>
<li>Visser, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+biochemical+screen+reveals+that+FLRTs+and+Unc5s+mediate+neuronal+subtype+recognition+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina.</a> eLife. 4, e08149(2015).</li>
<li>Özkan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+interactome+of+immunoglobulin+and+LRR+proteins+reveals+receptor-ligand+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks.</a> Cell. 154 (1), 228-239 (2013).</li>
<li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Screen+for+Human+Cytomegalovirus+Identifies+Neuropilin-2+as+a+Central+Viral+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor.</a> Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).</li>
<li>Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juno+is+the+egg+Izumo+receptor+and+is+essential+for+mammalian+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization.</a> Nature. 508 (7497), 483-487 (2014).</li>
<li>Mullican, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFRAL+is+the+receptor+for+GDF15+and+the+ligand+promotes+weight+loss+in+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">GFRAL is the receptor for GDF15 and the ligand promotes weight loss in mice and nonhuman primates.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1150-1157 (2017).</li>
<li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+malaria+is+associated+with+parasite+binding+to+endothelial+protein+C+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Severe malaria is associated with parasite binding to endothelial protein C receptor.</a> Nature. 498 (7455), 502-505 (2013).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+identification+of+ligand-receptor+interactions+on+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct identification of ligand-receptor interactions on living cells and tissues.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 997-1001 (2012).</li>
<li>Sobotzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HATRIC-based+identification+of+receptors+for+orphan+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HATRIC-based identification of receptors for orphan ligands.</a> Nature Communications. 9 (1), 1519(2018).</li>
<li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Gebre, M., Nomburg, J. L., Gewurz, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Genetic+Analysis+of+Virus-Host+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li>
<li>Zotova, A., Zotov, I., Filatov, A., Mazurov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+antigen+specificity+of+a+monoclonal+antibody+using+genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determining antigen specificity of a monoclonal antibody using genome-scale CRISPR-Cas9 knockout library.</a> Journal of Immunological Methods. 439, 8-14 (2016).</li>
<li>Puschnik, A. S., Majzoub, K., Ooi, Y. S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+toolbox+to+study+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR toolbox to study virus-host interactions.</a> Nature Reviews. Microbiology. 15 (6), 351-364 (2017).</li>
<li>Kerr, J. S., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidity-based+extracellular+interaction+screening+%28AVEXIS%29+for+the+scalable+detection+of+low-affinity+extracellular+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Avidity-based extracellular interaction screening (AVEXIS) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3881(2012).</li>
<li>Tzelepis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+Dropout+Screen+Identifies+Genetic+Vulnerabilities+and+Therapeutic+Targets+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia.</a> Cell Reports. 17 (4), 1193-1205 (2016).</li>
<li>Sharma, S., Bartholdson, S. J., Couch, A. C. M., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+cellular+pathways+required+for+cell+surface+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of cellular pathways required for cell surface recognition.</a> Genome Research. 28 (9), 1372-1382 (2018).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+pooled+CRISPR+genetic+screens+using+MAGeCKFlute%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute.</a> Nature Protocols. 14 (3), 756-780 (2019).</li>
<li>R Core team. A language and environment for statistical computing. , http://www.R-project.org (2013).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knockout+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens.</a> G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li>
<li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichr%3A+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W90-W97 (2016).</li>
<li>Crosnier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480 (7378), 534-537 (2011).</li>
<li>Kirk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+is+tightly+associated+with+lactate+transporters+MCT1+and+MCT4+and+facilitates+their+cell+surface+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression.</a> The EMBO Journal. 19 (15), 3896-3904 (2000).</li>
<li>Chong, Z. S., Ohnishi, S., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled+extracellular+receptor-ligand+interaction+screening+using+CRISPR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation.</a> Genome Biology. 19 (1), 205(2018).</li>
<li>van der Meer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Model+Passports-a+hub+for+clinical%2C+genetic+and+functional+datasets+of+preclinical+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell Model Passports-a hub for clinical, genetic and functional datasets of preclinical cancer models.</a> Nucleic Acids Research. 47 (D1), D923-D929 (2019).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric-derived+cell+surface+protein+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.</a> PloS One. 10 (3), e0121314(2015).</li>
<li>Behan, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prioritization+of+cancer+therapeutic+targets+using+CRISPR-Cas9+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens.</a> Nature. 568 (7753), 511-516 (2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

אסטרטגיית הקרנה מבוססת CRISPR כדי לזהות גנים הקידוד רכיבים סלולריים המעורבים זיהוי תאי מתואר. גישה דומה באמצעות הפעלת CRISPR גם מספק חלופה גנטית לזהות קולטני אינטראקציה ישירה של חלבונים רקומביננטי ללא צורך לייצר ספריות חלבון גדול26. עם זאת, אחד היתרונות העיקריים של גישה זו היא שהיא ישימה אינטראקציות התיווך על ידי מולקולות פני השטח המוצגות באופן מקורי על התא ואינו תלוי בביטוי יתר של קולטנים, אשר יכולים להשפיע על האיגוד המחייב של הקולטן. שלא כמו שיטות אחרות, לכן, טכניקה זו אינה מהווה הנחות לגבי הטבע הביוכימי או ביולוגיה התא של הקולטנים ומספקת הזדמנות ללמוד אינטראקציות בתיווך על ידי חלבונים המתקשים בדרך כלל ללמוד באמצעות גישות ביוכימיות, כגון חלבונים גדולים מאוד, או כאלה החוצה את הקרום פעמים רבות או מכלולי טפסים עם חלבונים אחרים, ומולקולות מלבד חלבונים לאור הגנום בקנה מידה של השיטה, גישה זו גם יש את היתרון של לא רק זיהוי הקולטן אלא גם רכיבים סלולריים נוספים הדרושים עבור האירוע מחייב, ובכך לספק תובנות לתוך הביולוגיה התא של הקולטן.
אחת המגבלות העיקריות של שיטה זו בעת השימוש בו כדי לזהות את הקולטן של חלבון יתום היא הדרישה הראשונית לזהות תחילה קו תא הנקשר לחלבון. זה לא תמיד קל לזהות קו תא המציג פנוטיפ כריכה כי הוא גם מתירני למסכים גנטיים יכול להיות צעד מגביל זמן לפריסת הרשת. קווי תאים מסוימים נוטים לאגד ליותר חלבונים מאחרים. הדבר רלוונטי במיוחד לחלבונים שתאגד HS, מכיוון שחלבונים אלה נוטים לאגד כל קו תאים המציג רשתות מובילות של HS, ללא קשר להקשר הכריכה המקורי. בנוסף, הבחנו כי upregulation של syndecans (כלומר, פרוטאוגליקנים המכילים HS) בקווי תאים מוביל לכריכה מוגברת של חלבונים מבוססי-HS26. זה יכול להיות גורם לקחת בחשבון בעת בחירת קו התא להקרנה. עם זאת, חשוב גם לציין כי הכריכה התוסף של HS אינה מפריעה לכריכה לקולטן מסוימת. משמעות הדבר היא שאם הכריכה נצפתה, ייתכן שהוא מתווך אך ורק על-ידי ה-HS משום שהכריכה מתווכת על-ידי HS בתוך שיטת הפעולה הזאת היא תוסף במקום19בלתי תלוי. בתרחיש כזה, הגישה לחסימת הפארין מתוארת יכולה לזהות התנהגויות כאלה מבלי שיהיה צורך לבצע מסך גנטי מלא.
משאב שימושי לבחירת קווי התא הוא תא דגם Passport, אשר מכיל גנומיקה, transcript, ומידע על תנאי התרבות עבור ~ 1,000 סרטן שורות התאים27. בהתאם להקשר הביולוגי, ניתן לבחור תאים בהתבסס על פרופילי הביטוי שלהם. כדי לסייע לבחירה של קווי התא, אנו מקובצים באשכולות ~ 1,000 שורות התא בדרכון תא מודל בהתאם לביטוי של ~ 1,500 מתחת לפני השטח של תא האדם גליקורופטינס28 (איור משלים 2; מידע אשכול עבור כל קו תא יחד עם תנאי גדילה מסופקים בטבלה השלמה 2). כאשר אתה בוחן את הכריכה של חלבון עם פונקציה לא ידועה, הוא שימושי לבחור פאנל של קווי התאים הנציג מכל אשכול כדי להגדיל את הסיכוי לכסות מגוון רחב של קולטנים. בהינתן בחירה, מומלץ לבחור קווי תאים קלים לתרבות וקל לשנות את האפשרויות. כמו קווי תא אלה ישמשו בהקרנה בקנה מידה הגנום, עדיף שהם יכולים להיות מגודלים בקלות בכמויות גדולות הם מתירני כדי לשנות את התמרה, כי היא השיטה הנפוצה ביותר למסירה של sgRNA עבור CRISPR מבוססי ההקרנה גנטית בשלבים מאוחרים יותר.
באופן כללי, בחירת הפנוטיפים מבוצעת במיון אחד. עם זאת, זה נקבע על ידי בהירות של אוכלוסיית התאים המוכתמת לעומת השליטה. סיבובים איטרטיביים של בחירות יכולים להיות מאומצים עבור תרחישים בהם יחס אות לרעש של הפנוטיפ הרצוי נמוך, או כאשר מטרת המסך היא לזהות מוטציות בעלי פנוטיפים חזקים. בעת שימוש בגישת בחירה איטראטיבית למסכים מבוססי FACS, חשוב לשקול שתהליך המיון עלול לגרום למוות בתאים, בעיקר בשל הכוח המוחלט של הסדרן. כך, לא כל התאים שנאספו יוצג בסיבוב הבא של מיון.
מורכבות הספרייה היא גורם חשוב מאוד בביצוע מסכים גנטיים מוצלחים, במיוחד עבור מסכי בחירה שלילית, מכיוון שהיקף המחסור באלה יכול להיקבע רק על ידי השוואת התוצאות למה שהיה קיים בספריית ההתחלה. עבור מסכי בחירה שליליים, מקובל לשמור על ספריות במורכבות של 500-1000 x. מסכי בחירה חיוביים, עם זאת, חזקים יותר לגדלי הספרייה, כי במסכים כאלה רק מספר קטן של מוטציות צפויים להיבחר פנוטיפים מסוימים. לכן, במסך הבחירה החיובית המתוארת כאן, ניתן להקטין את גודל הספרייה למורכבות של 50-100x מבלי להתפשר על איכות המסך. בנוסף, במסכים אלה ניתן גם להשתמש בספריית בקרה עבור קו תא נתון ביום נתון כ"פקד כללי" עבור כל הדגימות הממוינים ביום עבור קו הטלפון הנתון. פעולה זו תקטין את מספר ספריות הבקרה שיש להפיק ולסדר את הרצף.
שיקול חשוב נוסף לשימוש בגישה זו הוא המגבלות של מסכי אובדן התפקוד בזיהוי גנים החיוניים לצמיחת תאי מבחנה. העיתוי של המסכים הוא חיוני בהקשר זה, ככל שתאי מוטציה נשמרים בתרבות, גבוה יותר את הסבירות כי תאים עם מוטציות בגנים חיוניים להפוך לא קיימא ואינם מיוצגים עוד בספריית המוטציות. המסכים הגנטיים האחרונים שבוצעו כחלק מיוזמת הניקוד של הפרויקט ביותר מ-300 קווי התאים מראים כי גנים מרובים בפרשת החלבון KEGG-מוערת ומסלול N-גליליציה מזוהים לעתים קרובות כחיוניים למספר קווי תאים (איור 3)29. זה יכול להילקח בחשבון כאשר לעצב מסכי אם ההשפעה של גנים הדרושים התפשטות הכדאיות היא להיחקר בהקשר של תהליך זיהוי תאי. במקרה זה, ביצוע מסכי בנקודת זמן מוקדמת (לדוגמה, יום 9 התמרה) יהיה מתאים בדרך כלל. עם זאת, אם הגישה משמשת כדי לזהות מטרות מסוימות עם אפקטים בגודל חזק ולא מסלולים סלולריים כללי, זה עשוי להיות מתאים לבצע מסכי בשלב מאוחר יותר (למשל, יום 15-16 התמרה).
התוצאות מההקרנה חזקות מאוד; בשמונה רקומביננטי חלבון מסכי כריכה שבוצעו בעבר, קולטן פני השטח היה הלהיט העליון בכל מקרה19. כאשר משתמשים בגישה זו כדי לזהות את השותף לאינטראקציה, יש לצפות לפיכך לקולטן ולגורמים התורמים להצגתו על פני השטח להיות מזוהים עם ביטחון סטטיסטי גבוה. לאחר המסך מבוצע, להיט מאומת באמצעות הסתרה gRNA יחיד, מעקב אחר קופצים ניתן לבצע באמצעות שיטות הביוכימיות הקיימות כגון AVEXIS4 וכריכה ישירה מדומה של חלבונים מטוהרים באמצעות התהודה משטח הפלזמה. הגישה המתוארת כאן היא ישימה עבור כל החלבונים שעבורם ניתן ליצור בדיקה רקומביננטי מסיס מחייב.
לסיכום, זהו מרחב הגנום CRISPR הגישה הסתרה כדי לזהות אינטראקציות מתווכת על ידי משטח תאים חלבונים. שיטה זו ישימה בדרך כלל כדי לזהות מסלולים סלולריים הנדרשים לזיהוי שטח התא במגוון רחב של הקשרים ביולוגיים שונים, כולל בין תאים משלו של האורגניזם (למשל, הכרה עצבית ואימונולוגיים), כמו גם בין תאים מארחים וחלבונים הפתוגן. שיטה זו מספקת חלופה גנטית לגישות ביוכימיות שנועדו לזיהוי הקולטן, ומכיוון שהיא אינה דורשת שום הנחות קודמות לגבי הטבע הביוכימי או ביולוגיה התא של הקולטנים יש לו פוטנציאל גדול לעשות תגליות בלתי צפויות לחלוטין.

אינטראקציות של מסחטות על ידי קולטן פני השטח תאים חלבונים ישיר תהליכים ביולוגיים חשובים כגון ארגון רקמות, מארח-זיהוי פתוגן, ורגולציה החיסונית. חקירת אינטראקציות אלה מעניינת את הקהילה הביו-רפואית הרחבה יותר, משום שקולטני ממברנה הם מטרות שנועדו לtherapeutics באופן שיטתי כגון נוגדנים חד-שבטיים. למרות החשיבות שלהם, לימוד האינטראקציות האלה נשאר מאתגר מבחינה טכנית. הסיבה לכך היא בעיקר מכיוון שקולטנים מוטבעים הממברנה הם אמפיפתיים, מה שמקשה על בידוד מקרומים ביולוגיים לטיפול ביולוגי, והאינטראקציות שלהם מתוערכות על-ידי הקשרים החלשים באינטראקציה (KDs בטווח μm-mM)1. כתוצאה מכך, הרבה שיטות נפוצות אינן מתאימים לזיהוי מחלקה זו של אינטראקציות חלבונים1,2.
מגוון של שיטות פותחו במיוחד כדי לחקור באופן ספציפי קולטן ואינטראקציות ליגיוטיים לקחת את המאפיינים הביוכימיים הייחודיים שלהם לתוך התחשבות3. מספר גישות אלה כרוכות בהבעת ectodomain כולה של קולטן כחלבון רקומביננטי מסיס במערכות מבוססות היונקים או תא חרקים כדי להבטיח כי חלבונים אלה מכילים שינויים מבחינה מבנית החשובים באופן מרכזי, כגון גליקנים ואיגרות חוב דיסולניות. כדי להתגבר על הקשירה החלשה, הפקונים לעתים קרובות oligomerized כדי להגדיל את האוויקות שלהם מחייב. חלבון Avid ectodomains השתמשו בהצלחה כאיגוד הבדיקות כדי לזהות שותפים אינטראקציה ישירה רקומביננטי חלבון-חלבון אינטראקציה מסכי4,5,6,7. בעוד שיטות מוצלחות ומבוססות חלבון מרקומביננטי מחייבות את הפקדומיין של קולטן ממברנה כחלבון מסיס. לכן, זה חל רק בדרך כלל על חלבונים המכילים אזור מגלואי רציף (למשל, מעבר יחיד סוג I, סוג II, או GPI-מעוגן) והוא לא מתאים בדרך כלל עבור מתחמי קולטן חלבונים ממברנה לאורך הקרום פעמים מרובות.
ביטוי טכניקות שכפול שבו ספריה של DNAs משלימים (cDNAs) הוא מנוכר לתוך תאים ונבדק לקבלת פנוטיפ של מחייב יש גם שימשו כדי לזהות אינטראקציות חלבונים-חלבון מושג8. הזמינות של אוספים גדולים של ביטוי cdna משוכפל ורציף בשנים האחרונות יש הנחה שיטות שבהן קווי התאים המביעים מחדש את קולטני משטח הקידוד של cdnas מוקרן עבור איגוד של רקומביננטי חלבונים כדי לזהות אינטראקציות9,10. מבוססי cDNA גישות מבוססות, שלא כמו רקומביננטי חלבון שיטות, להרשות לעצמם את האפשרות לזהות אינטראקציות בהקשר של קרום הפלזמה. עם זאת, ההצלחה של שימוש במבנים ביטוי cDNA תלוי ביכולת של התאים כדי לבטא את החלבון בצורה נכונה מקופל, אבל זה דורש לעתים קרובות גורמי עזר סלולריים כגון מובילים, מלווים, והרכבה הנכון oligomeric. העברה של cDNA בודד עשויה לפיכך לא להיות מספיק כדי להשיג את הביטוי פני השטח התא.
טכניקות הקרנה באמצעות cDNA בנייה או בדיקות חלבון רקומביננטי הם עתירי משאבים דורשים אוספים גדולים של cDNA או רקומביננטי ספריות חלבון. מתוכנן במיוחד שיטות מבוססות-ספקטרומטר מסה מנוצלים לאחרונה כדי לזהות אינטראקציות של מסחטות שאינן דורשות הרכבה של ספריות גדולות. עם זאת, טכניקות אלה דורשות מניפולציה כימית של משטח התא, אשר יכול לשנות את הטבע הביוכימי של המולקולות הקיימות על פני השטח של התאים והם כרגע חלים רק על אינטראקציות בתיווך על ידי חלבונים גליסיתיים11,12. רוב השיטות הזמינות כרגע גם להתמקד בכבדות על האינטראקציות בין חלבונים תוך התעלמות מרובה מתוך מיקרואקולוגיה קרום, כולל מולקולות כגון גליקנים, שומנים וכולסטרול.
הפיתוח האחרון של פילוח bialleleic יעיל מאוד באמצעות הגישות מבוססי crispr אפשרה הגנום בקנה מידה ספריות של תאים חסר גנים מוגדרים בבריכה אחת שניתן לוקרן בדרך סיסטמטית ולא משוחדת לזהות רכיבים סלולריים המעורבים ההקשרים שונים, כולל ניתוח של תהליכי איתות סלולריים, זיהוי של רטבאליות המקנים עמידות לסמים, רעלים ופתוגנים, וקביעת ספציפיות של נוגדנים13,14,15,16. כאן, אנו מתארים הגנום בקנה מידה CRISPR מבוססי הסתרה תא הקרנה הסריקה המספקת חלופה הגישה הביוכימית הנוכחית כדי לזהות קולטן החילוץ-ליגונות ואינטראקציות. גישה זו של זיהוי אינטראקציות מתווכת על ידי קולטני ממברנה על ידי מסכים גנטיים מתאימה במיוחד עבור חוקרים שיש להם עניין ממוקד על ליגניות בודדים משום שהוא מונע את הצורך לקמפל ספריות גדולות של cDNAs או חלבונים רקומביננטי.
שיטת הפעולה מורכבת משלושה שלבים עיקריים: 1) מאוד נלהב רקומביננטי חלבון מחייב בדיקה המורכבת של אזורים מסחטות של קולטן של עניין מיוצרים ומשמשים בזרימה מבוססת-פלואורסצנטית מבוססי כריכה המבוססת על הכריכה. 2) הכריכה משמשת לזיהוי קו תא המבטא את שותף האינטראקציה של בדיקת החלבון הרקומביננטי; 3) גירסת Cas9 המבטאת את קו התא היוצר אינטראקציה עם חלבון הריבית מופקת ומבוצע באמצעות מסך הסתרה מבוסס-הגנום CRISPR/Cas9 המבוסס על מבצע (איור 1). במסך זה גנטי, קשירה של חלבון רקומביננטי לקווי התאים משמש כפנוטיפ למדידה שבה תאים בתוך ספריית ההסתרה כי איבדו את היכולת לאגד את החללית ממוינים באמצעות מיון מבוסס-פלואורסצנטית תא המופעל (FACS) ואת הגנים שגרמו לאובדן של האיגוד המחייב מזוהה על ידי רצף. בעיקרון, הגנים לקודד את הקולטן האחראי קשירה לבדוק נלהב ואת אלה הדרושים לתצוגה משטח התא שלה מזוהים.
השלב הראשון של פרוטוקול זה כרוך בייצור של מושבע רקומביננטי בדיקה חלבונים המייצגים ectodomain של קולטני מאוגד קרום. קולטנים אלה ידועים לעתים קרובות לשמור על שלהם פונקציות כריכת כריכה כאשר ectodomains שלהם מבוטא רקומביננטי מסיסים חלבון1. עבור חלבון של עניין, חלבונים מסיסים רקומביננטי יכול להיות מיוצר בכל מערכת חלבון איקריוטית מתאים בפורמט כלשהו בתנאי שהוא יכול להיות oligomerized עבור avidity מוגברת הכריכה, והוא מכיל תגים שניתן להשתמש בזרימה מבוססי-פלואורסצנטית מבוססי cy, מבוסס האיגוד המבוסס (g., דגל פרוטוקולים מפורטים לייצור ectodomains מסיסים של קולטני קרום באמצעות מערכת ביטוי חלבון HEK293, כמו גם טכניקות שונות של multimerization וביטוי חלבון בונה לייצור של שני חלבונים pentameric ו-monomeric חלבונים תוארו בעבר1,17. הפרוטוקול כאן יתאר את השלבים ליצירת בדיקות מושבע פלורסנט מן החלבונים biotinylated מונאואריק על ידי מעלה אותם streptavidin מצועם ל fluorochrome (למשל, phyco, או PE), אשר ניתן להשתמש ישירות בתוך תא מבוסס הכריכה מבוססת ויש לו את היתרון של לא צורך נוגדן משני לאיתור. פרוטוקולים כלליים לביצוע מסכי הגנום בקנה מידה כבר תיאר20,21, ולכן הפרוטוקול בעיקר להתמקד הפרטים של ביצוע הזרמת cy, מבוססי חלבון רקומביננטי מסכי המערכת באמצעות ההקרנה crispr/Cas9 הסתרה באמצעות האדם V1 ("yusa") הספרייה18.

<table><tbody><tr><td>פוספטאז אלקליין נגד עכבר</td><td>Sigma</td><td>A4656</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Chem-Cruz</td><td>SC-204655</td><td></td></tr><tr><td>דם & תרבית תאים DNA Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>13362</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Diethanolamine</td><td>Sigma</td><td>398179</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>ערכת דם ורקמות Dneasy</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 מגנט צד</td><td>Invitrogen</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T אריזה תאים</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX עם מגיב PLUS</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP סדרן תאים</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni2 + -NTA חרוזי אגרוז</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-501-25</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>OX-68 נוגדן</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>p-nitrophenyl phosphate</td><td>Sigma</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 עמודי התפלה</td><td>GE healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליפרופילן עם נפח מיטה של 5 מ"ל</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K, רקומביננטי, רוש בדרגת PCR</td><td></td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Q5 התחלה חמה נאמנות גבוהה 2& פעמים; מאסטר מיקס</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>QIAערכת טיהור PCR מהירה</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>מסנן SCFA</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Sony Cell sorter</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI חרוזים (חרוזי Agencourt AMPure XP)</td><td>בקמן</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>צלחות מיקרוטיטר מצופות סטרפטווידין</td><td>Nalgene</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>Biolegend</td><td>405204</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה crispr/cas9 מסכים גנטיים

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

תקשורת בין-תאית מתווכת על ידי אינטראקציות ישיר בין קולטני מוטבע משטח התא קולטנים הוא חיוני לפיתוח נורמלי ותפקוד של אורגניזמים רב-תאיים. עם זאת, מזהה האינטראקציות האלה נשאר מאתגר מבחינה טכנית. כתב יד זה מתאר מיקוד שיטתי הגנום CRISPR/Cas9 הסתרה גישה גנטית המתאר מסלולים סלולריים הדרושים לאירועי זיהוי משטח התא ספציפיים. שיטה זו מנצלת חלבונים רקומביננטי המיוצרים במערכת ביטוי חלבון היונקים כמו בדיקה מחייבת מושבע כדי לזהות שותפים אינטראקציה במסך גנטי מבוסס תא. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות את הגנים הנחוצים לאינטראקציות משטח התא שזוהו על ידי רקומביננטי מחייב בבדיקות המתאימות לתחומי ectodomains של קולטנים מוטבעים ממברנה. חשוב מכך, בהתחשב הטבע בקנה מידה הגנום של גישה זו, יש לו גם את היתרון של לא רק לזהות את הקולטן ישיר אלא גם את הרכיבים הסלולריים הדרושים עבור המצגת של הקולטן על פני השטח התא, ובכך לספק תובנות יקרות לתוך הביולוגיה של הקולטן.

כתב יד זה מתאר גישה מבוססת הגנום בקנה מידה מבוססי לזהות קולטן מסחטות-ליגניות ואינטראקציות.

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

זיהוי אינטראקציות פני השטח של התאים באמצעות גישות ביוכימיות הזמינות כיום עדיין מציב אתגרים טכניים. פרוטוקול זה מספק חלופה גנטית באמצעות גישת סינון התאים בסולם הגנום כדי לזהות את אינטראקציות ליגנד הקולטן על פני השטח של התא. שלא כמו רוב השיטות הקיימות האחרות, שיטה זו אינה מניחה הנחות לגבי הביולוגיה של הקולטנים.הוא מספק הזדמנויות לזהות את האינטראקציות התיווך על ידי מגוון רחב של מולקולות פני השטח של התא. מולקולות פני השטח של התא נגישות ישירות לתרופות כגון נוגדנים חד שבטיים. לכן, לזיהוי אינטראקציות התיווך על ידי מולקולות אלה יכולות להיות השלכות טיפוליות חשובות.שיטה זו חלה בדרך כלל על חוקרים המעוניינים לחקור את תהליכי האיתות והזיהוי התאיים במגוון רחב של הקשרים ביולוגיים, כולל אינטראקציות עצביות ואימונולוגיות, כמו גם אינטראקציות פתוגן מארח. הפרוטוקול דורש מכונת מיון תאים בתפוקה גבוהה ומכונות רצף הדור הבא. ודא כי מתקנים אלה זמינים לפני הפעלת הפרוטוקול.התחל על ידי ביצוע שמונה דילולים סדרתיים של דגימות חלבון biotinylated בצלחת 96 באר להבטיח כי הנפח הסופי של כל דילול הוא לפחות 200 microliters ושבקרה תג בלבד כלול. הפוך צלחת כפולה של הדגימות על ידי הסרת 100 microliters מכל באר והעברתו לתוך צלחת חדשה 96 באר. כלול פקד חלבון תג בלבד שישמש כגשוש בקרה בכל החיבורים המחייבים.הוסף 100 microliters של 0.1 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטבידין-PE ל בארות באחת הצלחות, ו 100 microliters של חיץ דילול ל בארות של הלוח השני. הדגירה את הצלחת במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, לחסום את הבארים של צלחת קידוד סטרפטבידין עם חיץ דילול במשך 15 דקות.לאחר שטיפת הצלחת, יש לוודא שהיא יבשה. לאחר מכן להעביר את הנפח הכולל של המדגם משתי הצלחות ל בארות בודדות של צלחת מקודד סטרפטבידין ולהדגיר אותו במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 200 microliters של חיץ לשטוף.הוסף 100 microliters של עכבר נגד עכבר Cd4d3+4 IgG ולדגור את הצלחת במשך שעה נוספת. חזור על השטיפה. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של פוספטאז אלקליין נגד עכברים ומשאירים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה.לאחר מכן לשטוף את בארות שלוש פעמים עם חיץ לשטוף ופעם אחת עם חיץ דילול. הכן p-nitrophenyl פוספט במיליגרם אחד למיליליטר במאגר אתנולאמין צבע ולהוסיף 100 microliters לכל באר. לאחר דגירה של 15 דקות, למדוד את הספיגה יש כל באר ב 405 ננומטר.השתמש בדילול המינימלי שבו אין אות על הצלחת כגורם הדילול המתאים כדי ליצור tetramers. דגירה סטרפטבידין-PE ודילול החלבון הביוטינילציה המתאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לאחסן חלבונים מוגנים בצינור מוגן באור בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.לסובב את הצינורות חרוט עם דגימות מטופלים ושליטה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי והקפיא את אחד הצינורות במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. להשעות מחדש את גלולה בצינור השני ב 10 מיליליטר של PBS עם 1%BSA ולהניח בצד 100 microliters של תאים כפקד שלילי על צלחת 96 באר.לאחר מכן מוסיפים את החלבון הרקומביננטי הטרום-משותף לתליית התא בצינור חרוט ובצלחת 96 הבאר. בצע כתמי תאים במשך שעה אחת לפחות בארבע מעלות צלזיוס על רוטור ספסל עם סיבוב עדין. ואז גלולה את התאים ב 200 פעמים G במשך חמש דקות ולהסיר את supernatant.לאחר שטיפת התאים פעמיים, להשעות אותם מחדש בחמישה מיליליטר של PBS. מסננים את התאים דרך מסננת של 30 מיקרומטר כדי להסיר אשכולות תאים. ואז לנתח אותם עם זרימה סודור.השתמש בדגימה של פקד שלילי לשער עבור תאים שליליים חיוביים BFP ו PE. לאחר מכן למיין את המדגם ולאסוף 500, 000 כדי 1 מיליון BFP חיובי תאים שליליים PE לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. הכלוב הכואב יהיה תלוי בקשירת התאים לחלבון, אך בדרך כלל נאספים אחד עד 5% מהדגימות השליליות PE.עכשיו תן לתאים ממוינים על ידי צנטריפוגה במשך 500 פעמים G במשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר בזהירות את supernatant. גלולה ניתן לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שישה חודשים. השתמש בפונקציית הספירה של קסם כדי למפות רצפים מהאוכלוסייה הלא ממוינת והמיוינת לספריית הייחוס, שתניב קובץ ספירה גולמי.הפעל את פונקציית הבדיקה של קסם באמצעות ספירות גולמיות מדגם הבקרה הלא ממוין כפקד ואת הספירות מהדגימה ממוינת כטיפול. פתח את קובץ סיכום הגנים שנוצר ודרג את עמודת דירוג ההשהיה בסדר עולה. לאחר מכן זהה כניסות עם קצב גילוי כוזב של פחות מנקודה 0.05.הקולטן מדורג בדרך כלל לעתים קרובות מאוד בעמדה הראשונה. לבסוף להשתמש R או תוכנה שוות ערך כדי להתוות את הציון אלגוריתם דירוג חזק לבחירה חיובית. מסכי הפלה בסולם הגנום לזיהוי השותף המחייב של TNFSF9 ו- P falciparum האנושי או H5 של TNFSF9 ו- P falciparum Rh5 האנושיים בוצעו בתאי NCI-SNU-1 ו- HEC-293 בהתאמה.התנהגות מחייבת של Rh5 הושפע הן heparan סולפט וזה ידוע קולטן BSG ואילו TN-FRSF-9 לא לאבד קשירה לקולטן הידוע שלה TN-FSF-9. עם הדגירה מראש עם הפרין מסיס. הפצת GNA בספריית מוטנט הבקרה גילתה כי מורכבות הספרייה נשמרה לאורך כל הניסוי.האיכות הטכנית של המסכים הוערכה על ידי בחינת התפלגות שינויי הקיפול שנצפו של G-RNA המכוונים לקבוצה ייחוס של גנים לא חיוניים, בהשוואה להפצה עבור קבוצת ייחוס של גנים חיוניים. בנוסף, העשרה ברמת המסלול גילתה כי מסלולים חיוניים צפויים זוהו והועשרו באופן משמעותי באוכלוסיית הנשירה. בעת השוואת דוגמת הפקד לספריית הפלסמיד המקורית.אלגוריתם הדירוג החזק או ציון ה-RRA מספק מדד שבו G-RNA של מדורגים באופן עקבי גבוה מהצפוי. במסך עבור TNFRSF9, הלהיט העליון היה TNFSF9, שהוא שותף איגוד ידוע. בנוסף, זוהו גם מספר גנים הקשורים למסלול TP53.במקרה של RH5, בנוסף לקולטן הידוע, והגן הנדרש לייצור בדיחות זועפות, זוהה גם הגן SLC16A1. גישת ההקרנה היא בדרך כלל חזקה מאוד ואת הקולטן אינטראקציה ישירה צריך להיות מדורג מאוד ברשימת הגנים מועשר בסדר זה של האוכלוסייה. זה חיוני כדי לאמת את הלהיטים המתקבלים מהמסך.אם האינטראקציה מתווכית על ידי חלבונים, גישות ביוכימיות שנועדו לחקור אינטראקציות חלבון חלבון בינארי, למשל, יכול לשמש למחקרי אימות נוספים. בגלל האופי הלא משוחד של סולם הגנום של גישה זו, אנו צופים כי היא תסייע לחקור את האינטראקציות המתווכוות על ידי מולקולות תאים קשות לחקר כגון שומנים, חלבוני קרום multipass וגליקנים. זה עשוי גם לחשוף מסלולים חדשניים הנדרשים לסחר לקולטן וביולוגיה.

cell-surface-receptor-identification-using-genome-scale-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

טכניקת גנוטיפ המתוארת כאן, אשר זוגות תגובת השרשרת של פולימראז פלורסנט (PCR) כדי נימי ג'ל אלקטרופורזה, מאפשרת גנוטיפ תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. זה עוקף מגבלות בפני טכניקות גנוטיפ אחרות הוא יותר חסכוני מאשר שיטות סידור.

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי לתכנן ולבצע מיקוד מרובבת של משפרי עם החלבון פיוז'ן deactivating SID4X-dCas9-קראב, המכונה גם משפר הפרעה (משפר-i). פרוטוקול זה מאפשר זיהוי משפרי המווסתים ביטוי גנים ואסטמה ומקילה על ניתוח היחסים בין משפרי ויסות גנים מטרה משותפת.

דיסקציה של משפר תפקוד באמצעות הפרעות משפר מבוססי CRISPR מולטיפלקס בשורות תא

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למטב את CRISPR-Cas9 כדי להשיג הם ברמת פירוט גבוהה ללא אובדן פעילות--היעד. אנו משתמשים בגישה אבולוציה מכוונת נקרא צלף מסך כדי למצוא. את המוטציה Cas9 עם התכונות הרצויות. צלף-Cas9 היא תואמת RNAs יחיד-מדריך קטום ו משלוח בתבנית ribonucleoprotein, ידועים אסטרטגיות להשגת specificities גבוהה יותר.

באמצעות צלף-Cas9 כדי למזער את ההשפעות את המטרה של CRISPR-Cas9 ללא אובדן פעילות--היעד באמצעות אבולוציה מכוונת

ספרייה CRISPR/sgRNA הוחל כדי לחקור חלבונים. עם זאת, הכדאיות של ספרייה sgRNA לחשוף את הפונקציה של גבול CTCF ב הכונה נשאר נחקרו. כאן, אנו מתארים ספרייה ספציפית sgRNA לוקוסים HOX התירי את הפונקציה של גבולות CTCF HOX לוקוסים.

HOX לוקוסים Focused CRISPR/sgRNA ספריית הקרנת זיהוי קריטי CTCF גבולות

CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

מחסום משמעותי לטכנולוגיות כמו CRISPR הוא אירועים מחוץ למטרה שיכולים לשבש גנים חיוניים. 'סירקולריזציה לדיווח במבחנה על השפעות מחשוף על ידי ריצוף' (CIRCLE-seq) היא טכניקה שנועדה לזהות אתרי מחשוף לא מכוונים. שיטה זו ממפה את הפעילות הכלל-גנומית של CRISPR-Cas9 ברגישות גבוהה וללא משוא פנים.

CIRCLE-Seq לחקירת עריכת גנים מחוץ למטרה

המאמר מתאר פרוטוקול ליישום מודל in vitro לתשישות כדי להשלים מסך נוקאאוט CRISPR כלל גנומי בתאי T קולטן אנטיגן כימרי בריא מתורם.

ביצוע מסך CRISPR רחב גנום במבחנה בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיית CRISPR/Cas9 עם בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8) כדי לזהות גנים מועמדים החיוניים ליכולת ההתפשטות החריגה של תאי גזע ואב המטופויאטיים.

הערכה של גנים חריגים הקשורים לגדילה של תאי גזע ואב המטופויאטיים על ידי שילוב של טכנולוגיית CRISPR/Cas9 עם ספירת תאים

ניתנת גישה קפדנית ומובנית לבחירת גנים עמידים ורגישים לקרינה באמצעות יישום שיטת סקר CRISPR/Cas9 כלל-גנומית. לפרוטוקול זה יש גם פוטנציאל לשמש מסגרת רב-תכליתית למאמצי מחקר אחרים החוקרים את מנגנוני העמידות לתרופות כימיות הניתנות קלינית.

מסך CRISPR רחב גנום לחשיפת גנים רגישים לקרינה ועמידים לרדיו

פיתחנו פרוטוקול סקר CRISPR-Cas9 אופטימלי לתאי CAR T ראשוניים. על ידי הפחתת העברת ה-gDNA באמצעות עיכול אנזימטי ומשיכת קלטת sgRNA, גישה זו ממזערת ארטיפקטים של PCR, ומבטיחה זיהוי מדויק של sgRNA וזיהוי חזק של מטרות גנים פונקציונליות.

שיפור מסכי CRISPR-Cas9 בתאי CAR T – שיטה משופרת להכנת ספרייה

למדו זיהוי אינטראקציות קולטן-ליגנד בשטח התא באמצעות מסכים גנטיים בקנה מידה גנומי CRISPR/Cas9. שיטה זו מאפשרת גילוי ללא הטיות של אינטראקציות תאיות ליישומים תרפויטיים.

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

גלה סרטונים נוספים