זיהוי תפוקה גבוהה של עמידות לפסאודומונס syringae pv. עגבניה בעגבניה באמצעות שתיל שיטפון שיטת
10 במרץ 2020
השטף שתיל המבול מאפשר הקרנה מהירה של הקלה עגבניות בר עבור התנגדות פסבדו החיידק syringae bacterium. מעשה זה, המשמש בשילוב עם השימוש בקביעת הצמיחה החיידקית של הנבט, יכול לסייע עוד יותר באפיון ההתנגדות הבסיסית לחיידק, וניתן להשתמש בו כדי לקבוע את הבסיס לאוכלוסיות מיפוי כדי לברר את היסוד הגנטי של ההתנגדות.
פרוטוקול תפוקה גבוה זה מאפשר סינון מהיר של שתילי עגבניות מגישה פראית למזרק פסאודומונס פתוגן חיידקי. מבדיקה של שיטפון השתילים ממזערת את זמן צמיחת הצמחים ואת צרכי תא הצמיחה, מאפשרת תחלופה מהירה של צמחים ומאפשרת נבדקים גדלי מדגם גדולים. בדיקה זו היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לסנן התנגדות בגישה פראית וקווים אחרים עם רקע גנטי מורכב.
הפרוטוקול מספק כיוונים ספציפיים להזרקת שיטפונות של שני זנים מזרק Pseudomonas. עם זאת, הוא רב תכליתי ו ניתן לשנות כדי לזהות עמידות המארח פתוגנים חיידקיים אחרים. הדגימה להליך תהיה יאנה חסן, מומחית מחקר במעבדה שלי.
התחל בגידול שתילי העגבניות. מניחים זרעי עגבניות בצינור מיקרוצנטריפוגה 2.2 מיליליטר ומוסיפים שני מיליליטר של 50% פתרון אקונומיקה. רוק הצינור במשך 25 דקות ולאחר מכן להסיר את הפתרון אקונומיקה עם פיפטה.
מוסיפים שני מיליליטר של מים טהורים במיוחד ושוטפים את הזרעים על ידי היפוך הצינור חמש פעמים. שאפו את הנוזל מהצינור, וחזרו על הכביסה ארבע פעמים נוספות. לאחר הכביסה הסופית, מוסיפים שני מיליליטר של מים טהורים במיוחד ויוצקים את הזרעים לתוך צלחת פטרי סטרילית.
סטריליזציה ממטרים על ידי בוער אותם באתנול ואז להשתמש בהם כדי להעביר חמישה עד שבעה זרעים על צלחת 100 על ידי 25 מיליליטר עם 0.5 XMS בתוספת 0.8 אחוז אגר מדיה. לאטום את הקצוות של הצלחת עם קלטת כירורגית. ודא כי הצלחות מוערמות שטוחות עם הפנים כלפי מעלה.
מרביים את הזרעים הסטריליים בארבע מעלות צלזיוס בחושך במשך שלושה ימים לפחות כדי לסנכרן נביטה. לאחר שלושה ימים, מכוונים אנכית את הצלחות כך שהשורשים יגדלו לאורך פני השטח של הצלחת וקו הזרעים מכוון אופקית. מעבירים את הזרעים לתא צמיחה שנקבע ל-22 מעלות צלזיוס עם מחזור חושך של 16 שעות, 8 שעות.
לגדל את השתילים במשך עשרה ימים בתא, ובנקודה זו הם בדרך כלל יציגו קוטילדונים מגיחים ומורחבים ועלים אמיתיים ראשונים. פס חיידקים טריים על אגר KB מתאים עם קיסם שטוח, סטרילי. עבור PstT1, דגירה הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות לפני השימוש בחיידקים בניסוי השיטפון.
כדי להכין את inoculum, באופן בלתי ניתן לחישוב מחדש את החיידקים סטרילי, עשרה מילימולר מגנזיום כלורי לצפיפות אופטית של 0.1. לאחר מכן לבצע שני דיללולים סדרתיים כדי לקבל ריכוז עבודה עם OD600 של 0075. כמו כן להכין אחד עד עשרה דילול של קופולימר פעילי שטח שאינם יוניים במגנזיום כלוריד 10 מילימולאר.
מערבולת זה ולהוסיף אותו לחיידקים, מערבולת הצינור לערבב. מעבירים את הצלחות עם השתילים בני עשרת הימים מתא הגדילה לארון האבטחה הביולוגית ומסירים את הקלטת הכירורגית. ואז להעביר שישה מיליליטר של inoculum לכל צלחת.
בעדינות לדחוף את השתילים לתוך inoculum עם קצה פיפטה ולהתחיל טיימר במשך שלוש דקות. החזיקו צלחת אחת בכל יד והטו את חזית הצלחת כלפי מטה כדי להטביע את הקוטילדונים ועלי השתילים. סוויש את inoculum מצד לצד חמש עד שבע פעמים, ואז להטות את הצלחות בחזרה כדי לכסות את השורשים עם inoculum.
להטות את הצלחות שוב למטה ולחזור על המחזור במשך שלוש דקות בסך הכל. יוצקים את inoculum את הצלחות, להגדיר אותם על משטח שטוח, ויוצקים את כל inoculum שיורית בפעם השנייה. לעטוף מחדש את הצלחות ולמקום אותם בחזרה בתא הצמיחה.
Moneymaker-PtoR ו Moneymaker-PtoS זנים הוצפו PSTDC3000 ו פנוטיפים שבעה עד עשרה ימים לאחר הצפה. שתילים Moneymaker-PtoR לשאת את אשכול הגנים PtoPRF היו עמידים PSTDC3000. בעוד כמעט איזוגני Moneymaker-PtoS שתילים, אשר לא יכול לזהות את PSTDC3000 משפיעים AVRPto או AVRPto-B מת במהירות, בתוך שבעה ימים לאחר הצפה.
שתילים בני עשרה ימים הוצפו ב- PstT1 ובפנוטיפים לפחות עשרה ימים לאחר ההצפה. זיצויים רגישים היו מתים, היו להם מריסטמים אפים חומים וחסרו צמיחה חדשה. לעומת זאת, שתילים עמידים הציגו רמה גבוהה של צמיחה ירוקה חדשה ושרדו זיהום עם PstT1.
בדיקות גידול חיידקים בוצעו כדי לאשר כמותית עמידות PstT1 ו Solanum NeoRici LA1329. היה הבדל של 1.7 ביומן הצמיחה החיידקית בין LA1329 עמידים רגישים הבדל יומן 1.6 בין LA1329 עמיד Moneymaker-PtoS, אשר בקורלציה עם התוצאות פנוטיפיות. בעת ביצוע בדיקה זו, הדברים החשובים ביותר לזכור הם לשים לב לטכניקה aseptic לאורך כל הפרוטוקול ולהבטיח כי כל השתילים על הצלחת מוצפים ביסודיות.
הקפד autoclave רקמת צמח נגועים וחיידקים להיפטר מחומרים בהתאם לתקנות המתאימות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
בדיקת הצפת השתילים מאפשרת סריקה מהירה של זני עגבנייה ברים לעמידות בפני החיידק Pseudomonas syringae. פרוטוקול זה, בעל תפוקה גבוהה, מקצר את זמן גידול הצמחים ומאפשר בדיקה יעילה של מדגמים גדולים.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- פתולוגיה של צמחים
- גנטיקה
- מיקרוביולוגיה
רקע
- בדיקת ההצפה של השתילים נועדה לסריקת שתילים של עגבנייה.
- Pseudomonas syringae הוא פתוגן חיידקי משמעותי המשפיע על עגבניות.
- ניתן להתאים בדיקה זו עבור פתוגנים חיידקיים אחרים.
- היא תומכת בזיהוי עמידות גנטית באוכלוסיות של עגבנייה ברייה.
מטרת המחקר
- סריקת רכיבי גנטיים של עגבנייה ברת (wild tomato accessions) במטרה לאתר עמידות ל-Pseudomonas syringae.
- אפיון הבסיס הגנטי של העמידות באוכלוסיות מיפוי.
- אספקת שיטה בעלת תפוקה גבוהה לבדיקה של גדלי מדגמים גדולים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדבקה בשיטת הצפה של שתילים של עגבנייה עם זני Pseudomonas syringae.
- הערכת צמיחת חיידקים בתוך השתילים.
- השוואה של רמות העמידות בין אקססיונים (accessions) שונים.
- שימוש בתנאי תא גידול לאופטימיזציה של צמיחת הצמחים.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מזהה ביעילות זני עגבנייה עמידים.
- היא מאפשרת תפריון מהיר ובדיקה של מדגמים רבים.
- הוכרה ורסטיליות בזיהוי עמידות למגוון פתוגנים חיידקיים.
- היא מקלה על ביצוע ניתוחים גנטיים נוספים של תכונות עמידות.
מסקנות
- בדיקת הצפת השתילים היא כלי רב-עוצמה לסריקת עמידות בעגבניות.
- ניתן להתאימה ליישומים רחבים יותר בפתולוגיה של צמחים.
- שיטה זו משפרת את היעילות של סריקת עמידות במחקר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי מהיר של עמידות לנתיבי פתוגנים במערכות צמחים תומך בתיקוף יעדים בשלב מוקדם בתהליכי גילוי של חומרי הדברה כימיים וביו-פסטיצידים. בדיקת הצפת שתילים מאפשרת סריקה פנוטיפית בסביבניות גבוהה של גנטיקה פראית, ובכך מאיצה את גילוי תכונות עמידות בעלות ערך חיזוי עבור תהליכי הגנה על גידולים חקלאיים. גישה זו מפחיתה את הסיכון הביולוגי על ידי תיקוף פונקציונלי של מנגנוני עמידות לפני ביצוע ניסויי שדה הדורשים משאבים רבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן מנגנונים של אינטראקציה בין מאחב לפתוגן כדי להבהיר מסלולי עמידות בעגבנייה.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של לוקוסים גנטיים באמצעות פנוטיפים מובחנים של הישרדות או מדדי צמיחה כמותיים.
- ערך ניבוי: תומך בתיעדוף של מועמדים לעמידות על ידי קורלציה בין תוצאות פנוטיפיות לבדיקות צמיחה בקטריאלית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר פנוטיפים של עמידות הניתנים לשחזור בנבטים בני 10 ימים, מה שמאפשר הערכה של גרמפלזמה בהיקף רחב.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של נהלי ההחדרה וההצפה כדי להבטיח חשיפה עקבית של הפתוגן בכל הדגימות.
- יכולת הרחבה (Scalability): מקצר את זמן הגדילה ואת שטח הפנים של תא הגידול, מה שמאפשר תחלופה מהירה ובדיקה של גישהים (accessions) מגוונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מקשר פנוטיפים של עמידות בנבטים לתוצאות רלוונטיות לשטח באמצעות קורלציה עם נתוני התרבzość חיידקית.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבדיל בין רגישות המופעלת על ידי אפקטורים (למשל, זיהוי AvrPto) לבין עמידות רחבת-ספקטרום באמצעות קווים כמעט-איזוגניים.
- המשכיות פרה-קלינית: מספק סינון ראשוני בר-הרחבה המנחה מיפוי גנטי ותיקוף תכונות בשלבים מאוחרים יותר.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, מסריקת פלזמה נבטית ועד לזיהוי מובילים, ומאפשרת גילוי מוקדם של תכונות עמידות לפני מיפוי גנטי או תיקוף בשטח.
- ביולוגיה של הגילוי: בוחנת את השפעות הגנוטיפ של המאכסן על הישרדות הפתוגן וחיוניות השתיליים בעקבות הדבקה מבוקרת בהצפה.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים (מדידת צמיחה חדשה) ואיכותיים (הישרדות/מוות) לצורך דירוג עמידות.
- אנליטיקה: מאפשרת קורלציה בין עמידות פנוטיפית לבין הבדלים בצמיחה בקטריאלית (למשל, הפחתה של 1.6–1.7 log) כדי לתקף תוצאות חיוביות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין בדיקות שתילים לאישור גנים של עמידות באמצעות השוואת קווים כמעט-איזוגניים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתנת להתאמה למספר זני Pseudomonas syringae ולפתוגנים בקטריאליים אחרים בשינויים מינימליים של הפרוטוקול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור פנוטיפים של עמידות לרקעים גנטיים מוגדרים (למשל, נוכחות/היעדר Pto/Prf).
- ערך תפעולי: מגדיל את התפוקה באמצעות קיצור מחזור הצמיחה והחדרה סטנדרטית בשיטת הצפה.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של go/no-go בקידום תכונות עמידות על ידי אספקת אישור פנוטיפי וכמותי מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של נגיעות ברים (wild accessions) מותאם סיכונים, בהתבסס על חוזק עמידות מאומת ויכולת מניפולציה גנטית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקה אספטית, טיפול בפתוגנים וגידול צמחים בתנאים מבוקרים.
- תלוי במCב בטיחות ביולוגית, תאי גידול עם מחזורי אור וטמפרטורה מדויקים, וספקטרופוטומטריה לצורך סטנדרטיזציה של האינוקולום.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי עיתוי ההצפה, מחזורי ההטיה ונפח האינוקולום כדי להבטיח הדירות בין ניסויים.
- התאמה לזני פתוגנים חדשים דורשת אופטימיזציה של OD600 חיידקי וריכוז חומר פעיל שטח תוך שמירה על חיוניות השתילים.
- דיוק הניסוי הפנוטיפי תלוי בתקופות דגירה עקביות לאחר ההצפה ובהערכה אובייקטיבית של צמיחה ירוקה חדשה.
