שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות
30 במרץ 2020
אנו מתארים שיטת הצביעה מהירה לביצוע הדמיה רב ספקטראלית על רקמות קפואות.
שיטה זו מועילה לזהות, ולהפוך סמנים ביולוגיים מרובים לאוקליזציה במשותף בהקפאה אחת, כולל סמנים שאינם ניתנים לגילוי בדרך כלל במקטעי פרפין. בשיטת הכתמים הניסיונית הזו, זמן הכתמים מצטמצם משמעותית ושיטת ההכתמה יכולה להתבצע בכל מעבדה. הדגמת שיטה זו תהיה דינש ג'ישנקר.
הוא פוסט-דוק מיומן מהמעבדה, וגם ליבת הערכת האימונותרפיה, מנהל המתקנים. בעת בחירת נוגדנים לניתוח, שקול את ערכות מסנן העירור וההפחתה הזמינות במערכת ההדמיה האוטומטית למחצה. ולאחר בדיקת שילובים שונים של נוגדנים ראשוניים פלואורופור הוסיף, להכין פלואורופורים לשמש, כך שיש לך חפיפה ספקטרלית מינימלית כפי שהוצע בטבלה.
להכתמת מולטיפלקס, הכינו קוקטייל של נוגדנים עם פלואורופורים תואמים בהזיות אופטימליות קבועות מראש, ומוסיפים את הקוקטייל לחלקי הרקמות המעניינים. להכתמת סמן יחיד, הוסיפו את הנוגדן ההצטייד העיקרי רק לשקופית. עבור כל הכתמים, כוללים שקופית שליטה מוכתמת שעוברת את אותו הליך הכתם ללא תוספת של נוגדן תיעב ראשוני.
לאחר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור, לשטוף את המגלשות פעמיים עם PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, הדלפק מכתים את השקופיות המוכתמות מולטיפלקס עם DAPI במשך שבע דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור, ואחריו שתי שטיפות חמש דקות PBS. כדי ליצור ספריה ספקטרלית, הגדר את כוח המנורה של מערכת ההדמיה הרב-ספקטרלית ל- 100%ופתח את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ.
בחר ערוך פרוטוקול ופרוטוקול חדש. הזן שם פרוטוקול ובחר פלואורסצנטיות במצב דימות. לאחר מכן ספק שם לימוד וטען את השקופיות המוכתמות היחידות על הבמה.
לחצו על 'ערוך חשיפה' ולהשתמש באפשרויות המיקוד האוטומטי והחשיפה האוטומטית להתאמת זמני החשיפה ולרכוש תמונות לשקופיות המוכתמות הבודדות. לאחר הדמיית השקופיות המוכתמות הבודדות, שמור את הפרוטוקול. ובתוכנות למידת המכונה תחת הכרטיסייה בניית ספריה, טען כל תמונה מוכתמת בודדת.
בחר את הרצפה המתאימה ולחץ על חלץ. התוכנה תחלץ באופן אוטומטי את אות הפלואורסצנט שנבחר ברצפה. כדי לשמור את הצבע שחולץ, לחץ על שמור לאחסון.
ניתן ליצור קבוצה חדשה או לאחסן את הצבע שחולץ בקבוצה קיימת. להדמיה רב-ספקטרלית, לאחר שהספריה הספקטרלית נוצרה ואומתה, התאימו את זמני המיקוד והחשיפה בשקופית המוכתמת מולטיפלקס כפי שהוכח, ופתיחת שקופיות סרוקות ליצירת משימה חדשה. ספק מזהה שקופית ובחר פרוטוקול.
תחת משימה, בחר סריקת שקופיות שלמה כדי לבצע סריקת שקופיות שלמה בשקופית המוכתמת מולטיפלקס. בתדמית סריקת השקופיות כולה, בחר אזורים מעניינים לאורך התמונה. אזורים אלה ייסרקו באמצעות זמני החשיפה שנקבעו קודם לכן בשקופית מולטיפלקס שישמשו לחשיפה וניתוח ספקטרליים.
בתוכנת ההפעלה מיקרוסקופ, בחר לרכוש שדות MSI תחת משימה ולאחר מכן לחץ על עבד שקופית כדי לרכוש אזורי עניין בהגדלה של פי 20. לאחר שאזורי העניין נרכשו, בתוכנת למידת המכונה, לחץ על קובץ ופתיחה תחת לשונית הניתוח הידנית כדי לטעון את התמונות המוכתמות מולטיפלקס. בחרו במקור הספרייה הספקטרלית ולחצו על 'בחר רצפות' לבחירת הספרייה הספקטרלית שנשמרה קודם לכן.
לחץ על קובץ ופתיחה כדי לטעון את התמונה שאינה נגועה. לאחר מכן לחץ על סמל סמן הדיו autofluorescence וצייר קו או אזור בשקופית שאינה מוכתמת כדי לזהות שפעת אוטומטית בתוך הרקמה. לאחר מכן, תחת הכרטיסיה עריכת סמנים וצבעים, הקצה שמות עבור כל סמן ולחץ על הכן הכל.
לאחר אימות התמונה ללא מעצורים ספקטרלית, בתוכנת למידת המכונה, בחרו באפשרויות הממברנה והסמן של הציטופלסמה מהחלונית. ושימוש בלחצן שלוש הנקודות, בחר להשתמש באות זה כדי למצוא, כדי להגדיר את הסמן כדי לזהות את הגרעינים, ציטופלסמה או קרום. כאשר נבחר סמן ציטופלסמי או ממברנה, בחר באפשרות השתמש באות כדי לסייע בפיצול גרעיני.
התוכנה תזהה ותיצור באופן אוטומטי מסכות בודדות עבור הגרעין, הציטופלסמה והממברנה. השתמש בתצוגת הפתולוגיה עבור סמן מסוים ובאפשרויות התצורה בתוכנה כדי להתאים את מסיכות, ולחץ על פלח הכל כדי ליצור מפת פילוח תאים. לאחר פילוח התאים, בחר את סמנים כדי phenotype התאים החיוביים.
בנוסף, בחר לפחות חמישה תאים שלא מוכתמים בסמן שנבחר כדי להפנוטיפ את התאים השליליים. לאחר מכן לחץ על מאמן מסווג כדי לאמן את התוכנה לזהות באופן אוטומטי את כל התאים המוכתמים עם סמנים שנבחרו בתוך התמונה. מפת פנוטיפים תיווצר.
כפי שתמונות אלה מדגימות, נוגדנים מאומתים עבור ציטומטריית זרימה יכולים לשמש כדי לדמיין כתמי רקמות באמצעות מסנן הגביש הנוזלי הניתן לכוונון במערכת ההדמיה האוטומטית למחצה. כאן ניתן לראות תמונה לא מרוכגת של שקדים אנושיים קפואים הכוללת תיוג של תאי B ותאים מתרבים בתוך המרכז הנבט הזקיקי, ואזור תאי T הבין-זקיקיים. אפשרות ההשקפות הפתולוגיות מאפשרת הדמיה של תבנית הכתמים הבודדת עבור כל סמן בתוך הרקמה המעניינים, מה שמרמז על כך ששיטת הכתמים מולטיפלקס והדמיה ספקטרלית עובדות על רקמה קפואה.
כפי שהודגם על קטע גידול עכבר קפוא, הדמיה multispectral יכול לשמש גם כדי לדמיין גידול חודר תאי T, ושושלת תאים מיאלואידיים אחרים כולל מקרופאגים הקשורים הגידול. פילוח תאים ומפות פנוטיפים, ואת מספר התאים המוכתמים עבור כל סמן שנותח על ידי התוכנה ניתן ליצור, המוכיח כי התוכנה יכולה לשמש לכמות של כתמים multispectral על רקמות קפואות. עבור מישהו חדש 6to הטכניקה, חשוב להכיר את התכונות הספציפיות של הפלואורוכרומים שלך, ולהכין שקופיות ספרייה איכותיות עבור ספקטרלי unmixing עם חפיפה ספקטרלית מינימלית.
חשוב גם לבצע טיטרציה נוגדנים. לדעתנו, שיטה זו יכולה לספק מידע ליד המיטה על היעילות של אימונותרפיה לסרטן ויישומים טיפוליים אחרים, במיוחד כאשר העיתוי הוא המהות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטת צביעה מהירה עבור דימוי מולטיספקטרלי של רקמות קפואות, המאפשרת זיהוי ומיקום משותף (co-localization) של מספר סמנים ביולוגיים בתוך נתח קריו-סניט (cryosection) בודד. השיטה מקצרת משמעותית את זמן הצביעה וניתן לבצעה בכל מעבדה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביוטכנולוגיה
- אימונולוגיה
רקע
- חתכים מסורתיים בפרפין מגבילים את הגילוי של סממנים ביולוגיים מסוימים.
- חתכים של רקמה קפואה מספקים שימור טוב יותר של שלמות הסממנים הביולוגיים.
- דימות רב-ספקטרלי מאפשר ניתוח סימולטני של מספר סממנים.
- שיטות צביעה מהירות משפרות את היעילות המעבדתית.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטת צביעה מהירה ויעילה עבור רקמות קפואות.
- מתן אפשרות לזיהוי של סמנים ביולוגיים שבדרך כלל אינם ניתנים לזיהוי בחתכי פאראפין.
- הפשטה של השימוש בשיטה זו במסגרות מעבדתיות שונות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בחירה של נוגדנים מתאימים בהתבסס על סטים של מסנני עירור ופליטה.
- בדיקה של שילובים שונים של נוגדנים ראשוניים המשוררים לפלואורופורים.
- הכנת פלואורופורים במטרה למזער חפיפה ספקטרלית.
- הדגמה של השיטה על ידי פוסט-דוקטורנט מיומן.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת קו-לוקליזציה של מספר סמנים ביולוגיים.
- זמן הצביעה קצר משמעותית בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- ניתן לבצע את הפרוצדורה בכל סביבת מעבדה, דבר המשפר את הנגישות.
- הוכשלה יעילות בזיהוי סמנים שבדרך כלל אינם ניתנים לגילוי.
מסקנות
- שיטת הצביעה המהירה היא כלי בעל ערך עבור חוקרים.
- היא מרחיבה את היכולות של דימוי רב-ספקטרלי ברקמות קפואות.
- גישה זו יכולה להוביל לניתוח מקיף יותר של סמנים ביולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מספר סממנים ביולוגיים (multiplex biomarker detection) בחתכי רקמה קפואים, ובכך נותנת מענה למגבלה מרכזית של בדיקות המבוססות על FFPE, שבהן סממנים מסוימים אינם ניתנים לזיהוי עקב ארטיפקטים של קיבוע או חוסר תאימות של נוגדנים. על ידי קיצור זמן הצביעה וניצול מערכות דימוי מולטי-ספקטרליות הזמינות מסחרית, השיטה תומכת בבדיקת השערות מהירה יותר בתוכניות מחקר בתחומי האימונולוגיה והאונקולוגיה. הגישה מגבירה את הביטחון החיזוי בתהליכי תיקוף מטרות (target validation) על ידי מתן אפשרות לניתוח קו-לוקליזציה מרחבית של סממני חיסון וגידול במודלים של רקמות רלוונטיות קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי סימולטני של עד שישה סמנים בחתך קריו-סניגל בודד, ובכך מבהיר דפוסי ביטוי משותף של אנטיגנים.
- ערך תפעולי: מקצר משמעותית את זמן הצביעה בהשוואה לשיטות מסורתיות, ובכך מאיץ את זרימת העבודה של סריקת סמנים ביולוגיים בשלבים מוקדמים.
- ערך ניבוי: תומך באפיון פנוטיפי של תסנונית חיסונית (למשל, B-cells, T-cells, macrophages) ברקמות קפואות של בני אדם ועכברים, ובכך מסייע בהפחתת סיכונים של מטרות פונקציונליות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מקל על הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה המשכיים, וזאת באמצעות יצירת ספריות ספקטרליות מביקורות צבועות בצבע בודד, המבטיחות חפיפה ספקטרלית מינימלית.
- ערך תפעולי: משתמש במערכת דימות מולטי-ספקטרלית חצי-אוטומטית כדי להפוך את הרכישה והניתוח לסטנדרטיים, ובכך משפר את השחזוריות בין משתמשים ומעבדות.
- סקלביליות: מאפשרת הערכה מהימנה של תרכובות באמצעות יצירת מפות פנוטיפיות כמותיות, המבוססות על סגמנטציית תאים וזיהוי סמנים באמצעות למידת מכונה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על שלמות הביומארקרים ברקמות קפואות, ומספקת מערכת רלוונטית למחלה לצורך זיהוי סמנים שאינם נגישים בחתכי FFPE.
- התאמה למודלים פרה-קליניים: יעילות מוכחת בחתכי גידול קפואים של עכברים להדמיית T-cells חודרי גידול ושושלות מיאלואידיות, מה שתומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים במחקרי אימונותרפיה.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשרת כימות של תאים צבועים לכל סמן, ובכך מספקת נתונים להחלטות go/no-go בתעדוף מטרות ומיון תיקי פיתוח.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות יעדים מוקדם ועד לאימות פרה-קליני, במיוחד עבור אימונותרפיה שבה ההקשר המרחבי של ביטוי הסממנים הביולוגיים הוא קריטי למנגנון הפעולה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי אפשור ניתוח קו-לוקליזציה של מספר סמנים ביולוגיים במבנה רקמה שלם.
- סריקה: מספקת מוכנות למבחנים באמצעות יצירה סטנדרטית של ספרייה ספקטרליתית וסריקה של השקף כולו בהגדלה של 20x, מה שמבטיח תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- אנליטיקה: מייצרת מפות פלגום ומפות פנוטיפ באמצעות תוכנת למידת מכונה, מה שמאפשר השוואה אובייקטיבית של תנאי צביעה ואוכלוסיות תאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין שלב הגילוי לרציפות פרה-קלינית על ידי שימור אנטיגניות ברקמות קפואות, דבר המאפשר זיהוי של סמנים האובדים בתהליך עיבוד פראפין.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת לשימוש חוזר בניתוח סמנים ביולוגיים מרובים (multiplexed) בין פרויקטים שונים, ובכך מפחיתה את התלות בפרוטוקולי צביעה לשימוש חד-פעמי.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות ריבוי אותות מרחבי (spatial multiplexing).
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות דימיון חצי-אוטומטי והפרדה ספקטרלית מונחית תוכנה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות מהירה של המשך או הפסקה (go/no-go) והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכונים מוקדמת.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתוני סממנים ביולוגיים כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית ממודלים של רקמות רלוונטיים קלינית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, בחירת נוגדנים על בסיס תאימות עירור/פליטה, ויצירת ספריית ספקטרים.
- תלוי בגישה למערכת דימות רב-ספקטרלית חצי-אוטומטית עם מסנן גבישים נוזליים כיוון (LCTF) ותוכנת ניתוח מבוססת למידה מכונה תואמת.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תערובות נוגדנים, פרוטוקולי דילול ובקרות צביעה כדי להבטיח תוצאות עקביות בין מעבדות.
- דורש התאמה של פאנלים של פלואורופורים כדי למזער חפיפה ספקטרלית, במיוחד כאשר מרחיבים מעבר לשישה סמנים או מחליפים סוגי רקמות.
- מגבלה מעשית: השיטה מותאמת לרקמות קפואות; ביצועים בחתכים של FFPE אינם נתמכים ועשויים לדרוש תיקוף מחדש בשל הבדלים בנגישות לאנטיגנים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Antibody and Fluorophore Selecting and Staining
1:52
Spectral Library Preparation
2:59
Multispectral Imaging
3:54
Spectral Unmixing
4:37
Analyzing Multispectral Images via Cell Segmentation and Phenotyping
5:52
Results: Representative Multispectral Imaging and Cell Quantification
7:07
Conclusion
