Name: שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: למד שיטת צביעה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי ברקמות קפואות. השיטה מאפשרת זיהוי ומיקום משותף של מספר ביומרקרים בחתך קריוסקציה אחד, כולל מרקרים שאינם ניתנים לזיהוי בחתכי פרפין מסורתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הדרכה הדמיה וניתוח סופקו על ידי מרכז משאבי מחקר – מחקר היסטולוגיה ודימות רקמות הליבה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו הוקמה עם תמיכה מהמשרד של סגן הקנצלר למחקר. העבודה נתמכת על ידי NIH/NCI RO1CA191317 to CLP, על ידי NIH/NIAMS (SBDRC מענק 1P30AR075049-01) כדי ד ר א. Paller, ועל ידי תמיכה של רוברט לוריא מקיף סרטן המרכז להערכת הליבה חיסוני באוניברסיטת נורת'ווסטרן.

הטחול של העכבר ורקמות הגידול של העכבר HLF1623 התקבלו מהמעבדה שלנו. רקמת השומן האנושית נרכשה מספק מסחרי. פרטים מסופקים ברשימת החומרים.
1. הטמעת רקמות
<ol><li>הטמע רקמות טריות ב-OCT (טמפרטורת חיתוך אופטימלית) והקפא הקפאה באמצעות קרח יבש או חנקן נוזלי.</li>
	<li>אחסון רקמות ב-80 ° c.</li>
</ol>2. קריוסיס1
<ol><li>גזור 8 יקרומטר סעיפים ב קריוסטט עם טמפרטורות להגדיר ב-25 ° c. הערה: ניתן לכוונן את עובי המקטע המועדף כדי ליצור תמונות מיוחדות.</li>
	<li>מקם מקטעים על שקופיות של זכוכית טעונה.</li>
	<li>האוויר יבש את הסעיפים 1 h בטמפרטורת החדר (RT) לפני תיקון היסטולוגיה כיתה קרח קר באצטון עבור 10 דקות. הערה: אצטון גורם קרישה של חלבונים מסיסים במים, תמציות שומנים אך אינו משפיע על החומרים המכילים פחמימות. לעומת זאת, פורמאלין שומר על רוב השומנים ויש לו השפעה קטנה על פחמימות24. הבחירה של קבע חשוב בהתאם לבחירה של סמן להיות מזוהה.</li>
	<li>אחסן את השקופיות ב-20 ° c.</li>
</ol>3. מבחר של נוגדנים וfluorophores
הערה: לפני מכתים רקמות, שיבוטים נוגדן כי יהיה מכבש ובמיוחד כתם שלהם אנטיגנים של עניין בתוך סעיפים רציפים מ אצטון קבוע רקמות חייב להיות מאומת. נוגדנים מסוימים עשויים לדרוש תיקונים שונים, ואת התאימות שלהם עם נוגדנים אחרים בפאנל תצטרך גם להיות אמפירי. המטרה היא גם לזהות fluorophores עם חפיפה מינימלית, כי ניתן לזהות עם מסננים epiפלואורסצנטית עבור DAPI, FITC, Cy3, טקסס אדום, ו Cy5.
<ol><li>אשר כתמים על-ידי IHC קונבנציונאלי או לזיהוי immunofluorescence (IF) בסעיפים רקמה עם הביטוי הידוע אנטיגן היעד.</li>
	<li>באמצעות עירור ומסנן פליטה ערכות זמין על מערכת הדמיה חצי אוטומטי ולאחר בדיקת שילובים שונים של fluorophore-נוגדנים ראשוניים מצופני, להכין fluorophores לשמש כי יש חפיפה ספקטרלית מינימלית (למשל, לראות את לוח 1).</li>
</ol>4. צביעת מיכל
הערה: מחדש רקמות ושוטף שקופיות בוצעו בצנצנת Coplin. שלבי הדגירה של החסימה והנוגדן בוצעו בתיבת השקופיות מחולל לחות.
<ol><li>אפשר לשקופיות להתחמם ל-RT במשך 5 – 10 דקות.</li>
	<li>הידרוקסיד מחדש בתמיסת מלח (PBS) במשך 5 דקות.</li>
	<li>בצע שלב חסימה לפני צביעת רקמות עם נוגדנים. למקטעי עכבר, השתמש בפתרון חסימה מיוחד (ראה טבלת חומרים) במשך 10 דקות בשעה RT. עבור חלקים אנושיים, להשתמש 10% הסרום האנושי רגיל במאגר (בשנת) מדולל ב-PBS עבור 15 דקות ב RT. הערה: ניתן לבדוק מאגרי חסימה שונים לפי הצורך כדי לשמר את המאפיינים הספציפיים של המקטעים בהתאם להליכי המעקב שישמשו.</li>
	<li>שטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב-PBS לאחר חסימת.</li>
	<li>לצביעת התאים, הכינו קוקטייל של נוגדנים עם fluorophores תואם בדילול אופטימלי מראש.</li>
	<li>מוסיפים את הקוקטייל של מעגל פלואור מצופף לשקופיות. עבור כתמים בעלי סימון בודד, הוסף רק את הנוגדן הראשי לשקופית.</li>
	<li>כלול שקופית שאינה מוכתמת בפקד שעוברת את אותה הליך כתמים ללא תוספת של נוגדן מעלה מעלה.</li>
	<li>דגירה את השקופיות עבור 1 h ב RT בחושך ולאחר מכן לשטוף את השקופיות 2x עם PBS עבור 5 דקות כל אחד. מכאן והלאה, השקופית המתקבלת מכונה מוכתם באמצעות מולטיפלקס.</li>
	<li>כדי להכתים את הכתם, הוסף DAPI לשקופית מוכתמת במגה-בתים, דגירה של 7 דקות בחשיכה ב-RT, ושטוף את השקופיות 2x עם PBS עבור 5 דקות כל אחד. אל תכחד את הכתמים על שקופיות מוכתמות ובלתי מוכתמות.</li>
	<li>כדי coverslip, להוסיף טיפה של המדיום להרכבה, ובעדינות למקם את שמיכות זכוכית על הרקמה.</li>
</ol>5. הכנת ספרייה ספקטראלית
<ol><li>
רכישת תמונה
	<ol>
<li>. הגדר את כוח המנורה ל-100% בדרך כלל העוצמה מוגדרת ל-10% מכיוון שזיהוי של קרינה ברקמות FFPE כולל צעד הגברה של אות.</li>
		<li>התחל בפתיחת תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>בחר באפשרות ' עריכת פרוטוקול ' ולאחר מכן ' פרוטוקול חדש'.</li>
		<li>ספק "שם פרוטוקול", ובחר באפשרות ' זריחה ' תחת מצב הדמיהוספק "שם מחקר".</li>
		<li>הצב את השקופיות המוכתמות בלבד על הבמה ובדוק כל סמן בערוץ הזריחה המקביל שלו כדי להבטיח כתמים. בחר אזור על הרקמה המבטאת את האות החזק ביותר עבור סמן.</li>
		<li>כוונן את זמני החשיפה באמצעות פוקוס אוטומטי ואפשרויות לחשוף אוטומטית .</li>
		<li>השג תמונות עבור השקופיות המוכתמת ושאינן מוכתמות ושמור את הפרוטוקול. הערה: השלבים הבאים מתבצעים בתוכנת למידה ממוחשבת (ראה טבלת חומרים), תוך שימוש בשקופיות ויטראז ' בודדות כדי לוודא את הכתמים הספציפיים, כמו גם לקבוע את הדיבור על הנוגדן.</li>
		<li>תחת הכרטיסיה בניית ספריות בתוכנה, טען כל אחת מתמונות השקופיות המוכתמת, בחר את האפשרות fluor המתאימה ולחץ על הלחצן ' חילוץ'. התוכנה לחלץ באופן אוטומטי את האות הפלואורסצנטית שנבחר Fluor.</li>
		<li>כדי לשמור את הצבע שחולץ, לחץ על שמור לחנות. ניתן ליצור "קבוצה חדשה" או לאחסן את הצבע המחולצים לקבוצה קיימת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מאמת את הספרייה הספקטראלית
	<ol>
<li>בדוק את חלון עקומת הפליטה ספקטרלי, הממוקם מימין לתמונה המחולצים, עבור כל ערכת מסנן. הערה: האות המחולצים נכון אם העקומה ספקטרלית נצפתה רק בסטים מסנן שבו מזוהה fluorophore. אם עקומה ספקטרלית נצפתה בערכת הסינון הלא נכונה, משמעות הדבר היא שהאות הראשי המצופה בערכת המסננים אינו חזק דיו, או שהתוכנה מזהה אות אחר שהוא גבוה מדי, ייתכן שעקב חפיפה ספקטרלית. במקרה זה, נסה תחילה להשתמש בכלי צייר אזורי עיבוד כדי לצייר אזורים סביב אזורים המבטאים את סמן הפלורסנט ואת הניאון האוטומטית בתמונה. זה מאמן את התוכנה כדי לזהות את האות האמיתי ולהסיר אותות מפריעים. אם הדבר אינו פועל, חזור על התהליך המוכתם עבור השקופית המוכתמת בודדת כדי לבדוק את החדירות השונות לנוגדנים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. הדמיה רב ספקטראלית
הערה: לאחר שהספריה הספקטרלית נוצרת ואומתה, בצע את השלבים הבאים עבור השקופית המוכתמת באמצעות המגה-בפלקס.
<ol><li>
סריקת שקופיות מלאה
	<ol>
<li>כוונן את זמני המיקוד והחשיפה על השקופית המוכתמת במגה-פלקס כפי שהוזכר תחת בסעיף 5.1.
</li>
		<li>תחת סרוק שקופיות, צור משימה חדשה ובחר את הפרוטוקול שנשמר לעיל.</li>
		<li>בצע סריקת שקופית שלמה על השקופית המוכתמת באמצעות מולטיפלקס.</li>
		<li>באמצעות תוכנת סריקת השקופיות כולה, פתח את תמונת סריקת השקופיות כולה. תמונה זו לא היתה מעורבת בספקטרואולית.</li>
		<li>בחר אזורים מעניינים (ROI) לאורך תמונת סריקת השקופיות כולה באמצעות הכלי חותמת או ROI . ROIs אלה ייסרקו באמצעות זמני החשיפה שנקבעו ב6.1.1 לשמש לניתוח ספקטרלי ואנליזה.</li>
		<li>לחץ על עבד שקופית כדי לרכוש rois בהגדלה של 20 x</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ערבוב ספקטרלי
	<ol>
<li>לאחר הרכישה של ROIs, בתוכנת הלמידה של המחשב, תחת הכרטיסייה ניתוח ידני , טען את התמונות המוכתמות על-ידי לחיצה על פתח תחת קובץ.</li>
		<li>בתפריט הנפתח מקור הספרייה הנפתחת לחץ על בחר fluors.</li>
		<li>חלון חדש ייפתח. כאן, לבחור את הספרייה רפאים או קבוצה שנוצרו לעיל.</li>
		<li>טען את תמונת השקופית הבלתי מוכתמת. לחץ על סמל AF ink סמן הממוקם מעל הספרייה ספקטרלית שנבחרו ולצייר קו או אזור על השקופית הבלתי מוכתם כדי לזהות פלואורסצנטית אוטומטי ברקמה.</li>
		<li>תחת הכרטיסיה ערוך סמנים וצבעים , הקצה שמות עבור כל סמן. ניתן להקצות צבעים מדומים בשלב זה. הערה: הצבע עבור ברירת המחדל של התמונה באמצעות הקרינה האוטומטית הוא Darksלטיף. . שנה את זה לשחור</li>
		<li>לחץ על הכן הכל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אימות תמונות שאינן מעורבות באופן משולב הערה: כאשר השלב הבלתי מתערבב מושלם, נוצרת תמונה מורכבת המורכבת מכל הצבעים.<ol>
<li>לחצו על הסמל ' עריכת עין '. כאן, כל צבע ב-"תצוגת רכיב" יכול להיות מכובה או מופעל כדי להציג את ההכתמים של כל סמן בודד.</li>
		<li>לבדוק חזותית את ההכתמים ואת המבנה של התאים כדי להבטיח כי אין חפיפה של סמן, אלא אם כן הוא רלוונטי ביולוגית. פתולוג יכול לעזור לאמת את הצביעת גם. הערה: הצביעת על השקופית מרבב צריך להיות מאומת על ידי השארת החוצה fluorophore אחד בכל פעם ובדיקת דפוס הצביעת. בנוסף, האימות יסייע גם לזהות fluorophores חזק המופיעים בספקטרום הסמוך בשל שיחה לחצות נוגדנים או דימום-through.</li>
		<li>לתצוגות פתולוגיה, המדמים תמונות ברייטפילד לכל סמן פלורסנט, לחצו על הלחצן ' בחר תמונת רכיב '. כאן, בחר סמן כדי להציג תמונה מדומה של שדה ברייטאלי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. ניתוח תמונות מרובת ספקטרליות באמצעות פילוח של תאים ופנוטיפים
הערה: לאחר שמאמת את התמונה שאינה מעורבת בספקטרום, ניתן לבצע פילוח של תאים באמצעות תוכנת הלמידה של המחשב, שתספק הוראות צעד-אחר-צעד. פילוח רקמות לא התבצע כאן. אם הפאנל כולל סמן אחד או יותר רקמה ספציפית ובמיוחד אם הרקמה מבולגן, פילוח רקמות צריך להתבצע.
<ol><li>בחר "ציטופלסמה" ו-"קרום" תחת האפשרות ' פלח '. הערה: "גרעינים" נבחר כברירת מחדל.</li>
	<li>בחרו סמן מהחלונית. הגדר את הסמן כך שיזהה גרעינים, ציטופלסמה או קרום. לדוגמה, ניתן לבחור DAPI כדי לזהות גרעינים ו CD3 עבור קרום.</li>
	<li>לחץ על לחצן שלוש נקודות ('... ') כדי לבחור אפשרות תחת "השתמש באות זה כדי למצוא". לדוגמה, ' גרעין ' עבור DAPI. ניתן לבחור מספר סמנים מהחלונית לפילוח. הערה: עבור cytoplasmic או סמנים ממברנה, בחר את "השתמש באות זה כדי לסייע בפילוח גרעיני" אופציה.</li>
	<li>התוכנה מאתרת ויוצרת באופן אוטומטי מסכה לכל אחד מהגרעין, הציטופלסמה והקרום בתמונה.</li>
	<li>ודא שכל התאים ' מוסתרים ' לפילוח. כדי לכוונן, עבור לתצוגה ' פתולוגיה ' עבור הסמן המסוים שנבחר ב- 7.3. ולהשתמש באפשרויות התצורה בתוכנה.</li>
	<li>לחץ על "פלח הכל" כדי לפלח תאים.</li>
	<li>לאחר פילוח התא, המשך באמצעות תאים פנוטיפים. בשלב זה, לבחור את הסמנים הדרושים לפנוטיפים ולבחור באופן ידני לפחות חמישה תאים מוכתמים בבהירות עם הסמן הנבחר. זה מאמן את התוכנה לאחר מכן באופן אוטומטי לזהות את כל התאים מוכתם עם הסמן הנבחר בתמונה.</li>
	<li>מפת פנוטיפ נוצרת. לנתח כדי להבטיח את התא מוכתם עם הסמן הוא כראוי פנומן. הערה: הפנוטיפים לתא יכול להיות תהליך איטרטיבי. אם התוכנה אינה מסוגלת לפנוטיפ לתאים כראוי, משמעות הדבר היא שהאימונים אינם מספיקים או שגויים. במקרה זה, על המשתמש לבחור באופן ידני יותר תאים ולהכשיר מחדש את התוכנה ולחזור על שלב זה עד שהמשתמש יהיה מרוצה מהאימון.</li>
	<li>צור קבוצה בשם "אחרים" וכלול תאים שאינם מוכתמים עבור כל הסמנים. הערה: שלב זה חשוב להכשיר את התוכנה כדי להוציא את כל התאים הבלתי מוכתמים מן פנוטיפים.</li>
</ol>8. ייצוא תמונות ושולחנות ניתוח
<ol><li>לחצו על הלחצן ' ייצוא ' כדי להציג את החלונית ' הגדרות ייצוא '.</li>
	<li>ב "ייצוא ספריה", לחץ על עיון כדי לבחור מיקום לייצא את התמונות.</li>
	<li>ב "אפשרויות ייצוא תמונה", בחר את תבנית פלט תמונה.</li>
	<li>ברשימה "תמונות לייצוא", בחר את התמונות שיוצאו. "תמונה ללא הפרדות צבע" היא התמונה המדומה האחרונה שאינה מעורבת. "השקפות פתולוגיה" הן הדמויות הבודדות המשמשות לבדיקות ביומיות והן "תמונות Component (מרובת תמונות TIFF)" היא קובץ TIFF מרובה תמונות של נתוני רכיבים הניתנים לשימוש על-ידי תוכנות ניתוח צד שלישי.</li>
	<li>לחץ "ייצוא עבור כל" כפתור כדי לייצא את התמונות. הערה: ניתן לבחור גם טבלאות מניתוח ולייצא אותן בשלב זה.</li>
</ol>

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

הרקמות הקפואות השתמשו בהרחבה עבור הדמיה mIF כדי לזהות באופן מסורתי שלושה עד ארבעה סמנים31 על רקמה באמצעות שיטה ישירה ועקיפה32. בשיטה ישירה, נוגדנים הם מצוענים צבעים רואה או נקודות הקוונטים33 לתווית את הרקמה, ואילו בשיטה עקיפה, נוגדן ראשוני מצומת משמש לתייג את הרקמה ואחריו רואה מצופף משני מעלה מאוד המזהה את הנוגדן העיקרי. כמה מהחדשים האחרונים מכתים גישות שנדונו קודם לכן יכול לשמש גם כדי כתם רקמות קפואות לזהות יותר מארבעה סמנים. אבל את העלות של ריאגנטי...

ההתפתחויות האחרונות בטכניקות דימות מיקרוסקופיים שיפרו באופן משמעותי את הידע שלנו וההבנה של תהליכים ביולוגיים ומצבי מחלה. באיתור באתרו של חלבונים ברקמות באמצעות כרומוגניים אימונוהיסטוכימיה (IHC) מבוצעת באופן שגרתי בפתולוגיה. עם זאת, זיהוי של סמנים מרובים באמצעות כיפוגניים IHC כתמים הוא מאתגר1 ושיטות חדשות יותר להשתמש מערכות משנה החיסונית (mif) צביעת גישות, שבו סמנים ביולוגיים מרובים מתויגים על דגימת רקמה אחת, מפותחים. הזיהוי של סמנים ביולוגיים מרובים הוא שימושי, כי מידע הקשור לארכיטקטורת רקמות, התפלגות מרחבית של תאים, ו אנטיגן שיתוף ביטוי כולם נלכדים בדגימת רקמה אחת2. השימוש בטכנולוגיית הדמיה של קרינה פלואורסצנטית רב-ספקטרלית הפכה את הגילוי של סמנים ביולוגיים מרובים אפשריים. בטכנולוגיה זו, באמצעות אופטיקה ספציפית ספקטרום הקרינה הפלואורסצנטית של כל fluorophore הפרט יכול להיות מופרדים או "unmixed עורב", המאפשר זיהוי של סמנים מרובים ללא כל הצלבות ספקטרלית3. הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטראלית הופכת לגישה קריטית בביולוגיה של התא, פיתוח תרופות טרום-קלינית, פתולוגיה קלינית, והגידול בפרופיל החיסוני4,5,6. חשוב מכך, התפלגות מרחבי של תאים חיסוניים (במיוחד CD8 T תאים) יכול לשמש גורם התחזיות עבור חולים עם גידולים קיימים7.
הגישות השונות לצביעת מולטיפלקס פותחו וניתן לבצעו בו או ברצף. בשיטת הצביעה הסימולטנית, כל הנוגדנים מתווספים יחד כקוקטייל בשלב אחד כדי לתייג את הרקמה. טכנולוגיית UltraPlex משתמשת בקוקטייל של נוגדנים ראשוניים הצוכעשר מעלה ואחריו קוקטייל של fluorophore מעלה נגד הפגוטן נוגדנים משניים. טכנולוגיית Inממקם ב8 משתמש בקוקטייל ייחודי DNA-מצוסד נוגדנים ראשוניים אשר מתווספים בו לרקמות ואחריו צעד הגברה ולבסוף fluorophore-מעלה בדיקות כי הם משלימים כל רצף DNA ייחודי על הנוגדן העיקרי. שתי הטכנולוגיות הללו מאפשרות זיהוי של ארבעה סמנים פלוס 4, 6-diamino-2-פניינידול (DAPI) עבור כתמים גרעיניים. שתי גישות נוספות לצביעת בתים בו מבוססות על מאסה משנית בספקטרומטר היונים9. מערכת הדמיה Hyperion משתמשת הדמיה המסה cy, לנסות10 כדי לזהות עד 37 סמנים. טכנולוגיה זו משתמשת בקוקטייל של נוגדנים מצוחים מתכת כדי להכתים את הרקמות, ואזורים ספציפיים של הרקמות הם מהונן על ידי לייזר והועבר cytometer המוני היכן יוני מתכת מזוהים. טכנולוגיה דומה נוספת היא IONPath, המשתמשת בטכנולוגיית הדמיה של קרן יון ממותגת11. טכנולוגיה זו משתמשת בכלי משתמש בספקטרומטר מסה ובמקור של מקור חמצן במקום לייזר כדי להשתמש בנוגדנים בעלי מתכת. בעוד כל הגישות הללו בו מכתים במקביל לאפשר זיהוי של סמנים מרובים, העלויות הכרוכות ב-DNA, הפעשרות, או מתכות לנוגדנים, אובדן רקמות בשל אבלציה, ואת עיבוד תמונה נרחבת עבור חוסר ערבוב לא ניתן להמעיט. יתר על כן, ערכות ופרוטוקולים כתמים זמינים כרגע רק עבור רקמות FFPE ופיתוח פאנלים מותאמים אישית כרוך בזמן נוסף והוצאות.
לעומת זאת, השיטה הרציפה מכתימה את הרקמה עם נוגדן לסמן אחד, בנוכחות להסיר את הנוגדן, ואחריה רצף חוזר של תהליך זה כדי לתייג סמנים מרובים12. הגברה של האות (ת א) היא השיטה הרציפה ביותר לשימוש הרציף. שתי טכנולוגיות ריבוב אחרות משתמשות בשילוב של שיטות מכתים בו ורציפות. בפלטפורמת הקודקס13 מועסקים קוקטייל של נוגדנים מצוהרים לרצפי דנ א ייחודי של ה-DNA שנוצרו בסופו של דבר עם פלואורוופפור באמצעות צעד הפלמור באינדקס ואחריו הדמיה, להתפשט, וחוזר על התהליך כדי לזהות עד 50 סמנים. מולטימיקו Multix מכתים את הגישה14 הוא איטרציה של כתמים עם קוקטייל של שלושה עד ארבעה fluorophore נוגדנים מצוהרים, הדמיה, מקוצ'ינג את fluorophores, וחוזר על מחזור זה כדי לזהות עד 60 סמנים על מקטע אחד. בדומה לשיטת הצביעה הסימולטנית, בעוד שניתן לזהות מגוון רחב של סמנים, הזמן המעורב בצביעת, רכישת תמונות, עיבוד וניתוח הוא נרחב. הצעד להתפשט/מקוצ'ינג כרוך חימום ו/או הלבנת דגימת הרקמה ולכן, הגישה הרציפה מכתים מתאים בדרך כלל על רקמות FFPE השומרים על שלמות הרקמה על חימום או הלבנה.
קיבעון formalin והטבעה של פרפין בהמשך מבוצע בקלות בהגדרה קלינית, בלוקים רקמות קל לאחסן, ומספר פרוטוקולים מכתים כתמים זמינים. עם זאת, עיבוד, הטבעה, והאחלות של רקמות FFPE, כמו גם לאחזור אנטיגן15, תהליך שבו הנוגדנים יכולים לגשת לאפיסקופים יותר, היא גוזלת זמן. יתר על כן, עיבוד מעורב ברקמות ffpe תורם אוטומטי של16 ומסכות היעד אפיסקופים, וכתוצאה מכך השונות וחוסר שיבוט נוגדן זמין כדי לזהות אנטיגנים ברקמות ffpe17,18,19. דוגמה לכך היא אנטיגן הלוקוציט האנושי (HLA) הכיתה ה-20. לעומת זאת, הקפאה הצמד של הרקמות אינו כרוך שלבי עיבוד נרחב לפני או אחרי תיקון, לעקוף את הצורך אחזור אנטיגן21,22, ועושה את זה מועיל לגילוי מגוון רחב יותר של מטרות. לכן, באמצעות רקמות קפואות עבור הדמיה פלואורסצנטית רב-ספקטרלית יכול להיות יקר כדי לזהות מטרות עבור מחקרים פרה-קליניים וקליניים.
בהינתן המגבלות שהוזכרו לעיל בעת שימוש ברקמות FFPE, שאלנו אם הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטראלית ניתן לבצע על רקמות קפואות. כדי לענות על שאלה זו, בדקנו את השיטה בו מכתים בו באמצעות פאנל של שיטת fluorophore-מעלה נוגדנים כדי לזהות אנטיגנים מרובים וניתח את הצביעת באמצעות מערכת הדמיה מרובת ספקטרלית חצי אוטומטי. הצלחנו להכתים בו שישה סמנים בסעיף אחד ברקמה בתוך 90 דקות.

<table><tbody><tr><td>אצטון (דרגה היסטולוגית)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16F-1GAL</td><td>רקמות קיבוע</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 נגד עכבר CD3</td><td>BioLegend</td><td>100212</td><td>Clone - 17A2; נוגדן מצומד ראשוני</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, eBioscience אנטי-אנושי CD20</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>53-0202-82</td><td>Clone - L26; נוגדן מצומד ראשוני</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>558617</td><td>נוגדן מצומד ראשוני</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 אנטי-אנושי CD3</td><td>BioLegend</td><td>300446</td><td>Clone - UCHT1; נוגדן מצומד ראשוני</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 אנטי-עכבר CD8a</td><td>BioLegend</td><td>100758</td><td>Clone - 53-6.7; נוגדן מצומד ראשוני</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 אנטי-אנושי CD8a</td><td>BioLegend</td><td>372906</td><td>Clone - C8/144B; נוגדן</td></tr> <tr><td>מצומד ראשונישיבוט Alexa Fluor 647 נגד עכבר CD206 (MMR)</td><td>BioLegend</td><td>141711</td><td>- C068C2; נוגדן מצומד ראשוני</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 נגד עכבר CD4 נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>100426</td><td>Clone - GK1.5; נוגדן מצומד ראשוני</td></tr><tr><td>C57BL/6 Mouse</td><td>Charles River Laboratories</td><td>27</td><td>רקמות קפואות של עכבר המשמשות לאימון מולטי-ספקטרלי</td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6016-6EA</td><td>שקופיות לחות ושטיפת</td></tr><tr><td>DAPI Solution</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>כתם חומצת גרעין</td></tr><tr><td>יהלום זכוכית לבנה שקופיות טעונות</td><td>DOT Scientific</td><td>DW7590W</td><td>קטעי רקמה דבקים</td></tr> מי <tr><td>מלח פוספט חוצץ של Dulbecco 1x (ללא Ca ו-Mg)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>MT21031CV</td><td>כביסה</td></tr><tr><td>וכיסוי חותם זהב מדלל מחליק</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3306</td><td>הגנה על רקמות מוכתמות</td></tr><tr><td>שקדים אנושיים תקינים OCT רקמות קפואות</td><td>בלוק AMSBio</td><td>AMS6023</td><td>רקמה קפואה אנושית המשמשת לצביעה מולטי-ספקטרלית</td></tr><tr><td>סרום אנושי 1x</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-512</td><td>חוסם ומדלל לרקמות אנושיות</td></tr><tr><td>InForm</td><td>Akoya Biosciences</td><td>גרסה 2.4.1</td><td>תוכנת למידת מכונה</td></tr><tr><td>PerCP/Cyanine5.5 אנטי אנושי CD4</td><td>BioLegend</td><td>300529</td><td>Clone - RPA-T4; נוגדן מצומד ראשוני</td></tr><tr><td>PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clone - M1/70; נוגדן מצומד ראשוני</td></tr><tr><td>Phenochart</td><td>Akoya Biosciences</td><td>גרסה 1.0.8</td><td>תוכנת סריקת שקופיות שלמה</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36965</td><td>הרכבה בינונית</td></tr><tr><td>מחקר Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>רקמות חתך</td></tr><tr><td>Superblock 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37515</td><td>חסימת רקמות עכבר</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T SOLUTION</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>הטמעת רקמות</td></tr><tr><td>Vectra 3.0 מערכת הדמיה פתולוגית כמותית אוטומטית, 6 שקופיות</td><td>Akoya Biosciences</td><td>CLS142568</td><td>הדמיה מולטי-ספקטרלית חצי אוטומטית מערכת</td></tr><tr><td>Vectra תוכנה</td><td>Akoya Biosciences</td><td>גרסה 3.0.5</td><td>תוכנה להפעלת מיקרוסקופ</td></tr></tbody></table>

שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטראלית על formalin-קבוע פרפין מוטבע (FFPE) רקמות מאפשר זיהוי של סמנים מרובים מדגם רקמה אחת שיכולה לספק מידע על אנטיגן הביטוי והפצה מרחבית של סמנים. עם זאת, חוסר נוגדנים מתאים עבור הרקמות הקבועות של formalin עשוי להגביל את האופי של סמנים כי ניתן לזהות. בנוסף, שיטת הצביעת היא גוזלת זמן. כאן אנו מתארים שיטה מהירה לבצע הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטרלי על רקמות קפואות. השיטה כוללת את שילובי fluorophore בשימוש, צעדים מפורטים עבור כתמים של העכבר ורקמות קפואות האדם, ואת הסריקה, רכישה, וניתוח הליכים. לניתוח מכתים, מערכת הדמיה פלואורסצנטית מסחרית ומרובת כלים למחצה. באמצעות שיטה זו, עד שישה סמנים שונים היו ויטראז וזוהו בסעיף אחד הרקמה הקפואה. תוכנת ניתוח למידה של מחשב יכול להתאים את התאים שניתן להשתמש בהם עבור ניתוח כמותי. השיטה המתוארת כאן עבור הרקמות הקפואות היא שימושית לאיתור סמנים שלא ניתן לאתרם ברקמות FFPE או באילו נוגדנים אינם זמינים עבור רקמות FFPE.

זיהוי סמנים חד-מוכתמים במקטעי טחול קפואים כמו מערכת הדמיה למחצה אוטומטית משתמשת מסנן גביש נוזלי tunable (מערכת ליקוויד TF) המאפשר מגוון רחב יותר של גילוי אורך הגל25, ומשום שאין שלבי הגברה האות בוצעו כאן, אנו הראשון אופטימיזציה של הזיהוי של נוגדנים הראשי שלנו מצופנים עבור כל סמן על המיקרוסקופ. דוגמה מוצגת באיור 1, כאשר כל סמן מוכתם בודד הוא אדום בצבע מדומה. השימוש כאן אומת על ידי החברות המשמשות לאימונוצילובורנציה ולהזרמת cy, שימוש בנוגדנים. עם זאת, ...

אנו מתארים שיטת הצביעה מהירה לביצוע הדמיה רב ספקטראלית על רקמות קפואות.

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

שיטה זו מועילה לזהות, ולהפוך סמנים ביולוגיים מרובים לאוקליזציה במשותף בהקפאה אחת, כולל סמנים שאינם ניתנים לגילוי בדרך כלל במקטעי פרפין. בשיטת הכתמים הניסיונית הזו, זמן הכתמים מצטמצם משמעותית ושיטת ההכתמה יכולה להתבצע בכל מעבדה. הדגמת שיטה זו תהיה דינש ג'ישנקר.הוא פוסט-דוק מיומן מהמעבדה, וגם ליבת הערכת האימונותרפיה, מנהל המתקנים. בעת בחירת נוגדנים לניתוח, שקול את ערכות מסנן העירור וההפחתה הזמינות במערכת ההדמיה האוטומטית למחצה. ולאחר בדיקת שילובים שונים של נוגדנים ראשוניים פלואורופור הוסיף, להכין פלואורופורים לשמש, כך שיש לך חפיפה ספקטרלית מינימלית כפי שהוצע בטבלה.להכתמת מולטיפלקס, הכינו קוקטייל של נוגדנים עם פלואורופורים תואמים בהזיות אופטימליות קבועות מראש, ומוסיפים את הקוקטייל לחלקי הרקמות המעניינים. להכתמת סמן יחיד, הוסיפו את הנוגדן ההצטייד העיקרי רק לשקופית. עבור כל הכתמים, כוללים שקופית שליטה מוכתמת שעוברת את אותו הליך הכתם ללא תוספת של נוגדן תיעב ראשוני.לאחר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור, לשטוף את המגלשות פעמיים עם PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, הדלפק מכתים את השקופיות המוכתמות מולטיפלקס עם DAPI במשך שבע דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור, ואחריו שתי שטיפות חמש דקות PBS. כדי ליצור ספריה ספקטרלית, הגדר את כוח המנורה של מערכת ההדמיה הרב-ספקטרלית ל- 100%ופתח את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ.בחר ערוך פרוטוקול ופרוטוקול חדש. הזן שם פרוטוקול ובחר פלואורסצנטיות במצב דימות. לאחר מכן ספק שם לימוד וטען את השקופיות המוכתמות היחידות על הבמה.לחצו על 'ערוך חשיפה' ולהשתמש באפשרויות המיקוד האוטומטי והחשיפה האוטומטית להתאמת זמני החשיפה ולרכוש תמונות לשקופיות המוכתמות הבודדות. לאחר הדמיית השקופיות המוכתמות הבודדות, שמור את הפרוטוקול. ובתוכנות למידת המכונה תחת הכרטיסייה בניית ספריה, טען כל תמונה מוכתמת בודדת.בחר את הרצפה המתאימה ולחץ על חלץ. התוכנה תחלץ באופן אוטומטי את אות הפלואורסצנט שנבחר ברצפה. כדי לשמור את הצבע שחולץ, לחץ על שמור לאחסון.ניתן ליצור קבוצה חדשה או לאחסן את הצבע שחולץ בקבוצה קיימת. להדמיה רב-ספקטרלית, לאחר שהספריה הספקטרלית נוצרה ואומתה, התאימו את זמני המיקוד והחשיפה בשקופית המוכתמת מולטיפלקס כפי שהוכח, ופתיחת שקופיות סרוקות ליצירת משימה חדשה. ספק מזהה שקופית ובחר פרוטוקול.תחת משימה, בחר סריקת שקופיות שלמה כדי לבצע סריקת שקופיות שלמה בשקופית המוכתמת מולטיפלקס. בתדמית סריקת השקופיות כולה, בחר אזורים מעניינים לאורך התמונה. אזורים אלה ייסרקו באמצעות זמני החשיפה שנקבעו קודם לכן בשקופית מולטיפלקס שישמשו לחשיפה וניתוח ספקטרליים.בתוכנת ההפעלה מיקרוסקופ, בחר לרכוש שדות MSI תחת משימה ולאחר מכן לחץ על עבד שקופית כדי לרכוש אזורי עניין בהגדלה של פי 20. לאחר שאזורי העניין נרכשו, בתוכנת למידת המכונה, לחץ על קובץ ופתיחה תחת לשונית הניתוח הידנית כדי לטעון את התמונות המוכתמות מולטיפלקס. בחרו במקור הספרייה הספקטרלית ולחצו על 'בחר רצפות' לבחירת הספרייה הספקטרלית שנשמרה קודם לכן.לחץ על קובץ ופתיחה כדי לטעון את התמונה שאינה נגועה. לאחר מכן לחץ על סמל סמן הדיו autofluorescence וצייר קו או אזור בשקופית שאינה מוכתמת כדי לזהות שפעת אוטומטית בתוך הרקמה. לאחר מכן, תחת הכרטיסיה עריכת סמנים וצבעים, הקצה שמות עבור כל סמן ולחץ על הכן הכל.לאחר אימות התמונה ללא מעצורים ספקטרלית, בתוכנת למידת המכונה, בחרו באפשרויות הממברנה והסמן של הציטופלסמה מהחלונית. ושימוש בלחצן שלוש הנקודות, בחר להשתמש באות זה כדי למצוא, כדי להגדיר את הסמן כדי לזהות את הגרעינים, ציטופלסמה או קרום. כאשר נבחר סמן ציטופלסמי או ממברנה, בחר באפשרות השתמש באות כדי לסייע בפיצול גרעיני.התוכנה תזהה ותיצור באופן אוטומטי מסכות בודדות עבור הגרעין, הציטופלסמה והממברנה. השתמש בתצוגת הפתולוגיה עבור סמן מסוים ובאפשרויות התצורה בתוכנה כדי להתאים את מסיכות, ולחץ על פלח הכל כדי ליצור מפת פילוח תאים. לאחר פילוח התאים, בחר את סמנים כדי phenotype התאים החיוביים.בנוסף, בחר לפחות חמישה תאים שלא מוכתמים בסמן שנבחר כדי להפנוטיפ את התאים השליליים. לאחר מכן לחץ על מאמן מסווג כדי לאמן את התוכנה לזהות באופן אוטומטי את כל התאים המוכתמים עם סמנים שנבחרו בתוך התמונה. מפת פנוטיפים תיווצר.כפי שתמונות אלה מדגימות, נוגדנים מאומתים עבור ציטומטריית זרימה יכולים לשמש כדי לדמיין כתמי רקמות באמצעות מסנן הגביש הנוזלי הניתן לכוונון במערכת ההדמיה האוטומטית למחצה. כאן ניתן לראות תמונה לא מרוכגת של שקדים אנושיים קפואים הכוללת תיוג של תאי B ותאים מתרבים בתוך המרכז הנבט הזקיקי, ואזור תאי T הבין-זקיקיים. אפשרות ההשקפות הפתולוגיות מאפשרת הדמיה של תבנית הכתמים הבודדת עבור כל סמן בתוך הרקמה המעניינים, מה שמרמז על כך ששיטת הכתמים מולטיפלקס והדמיה ספקטרלית עובדות על רקמה קפואה.כפי שהודגם על קטע גידול עכבר קפוא, הדמיה multispectral יכול לשמש גם כדי לדמיין גידול חודר תאי T, ושושלת תאים מיאלואידיים אחרים כולל מקרופאגים הקשורים הגידול. פילוח תאים ומפות פנוטיפים, ואת מספר התאים המוכתמים עבור כל סמן שנותח על ידי התוכנה ניתן ליצור, המוכיח כי התוכנה יכולה לשמש לכמות של כתמים multispectral על רקמות קפואות. עבור מישהו חדש 6to הטכניקה, חשוב להכיר את התכונות הספציפיות של הפלואורוכרומים שלך, ולהכין שקופיות ספרייה איכותיות עבור ספקטרלי unmixing עם חפיפה ספקטרלית מינימלית.חשוב גם לבצע טיטרציה נוגדנים. לדעתנו, שיטה זו יכולה לספק מידע ליד המיטה על היעילות של אימונותרפיה לסרטן ויישומים טיפוליים אחרים, במיוחד כאשר העיתוי הוא המהות.

a-rapid-method-for-multispectral-fluorescence-imaging-frozen-tissue

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה תאים תמונה שכותרתו fluorescently למחצה עבה פרוסות המוח. על ידי תיקון, חיתוך, ואת אופטית ניקוי רקמת המוח אנו מתארים כיצד הדמיה epifluorescent או confocal רגיל יכול לשמש כדי לחזות תאים בודדים ורשתות נוירונים בתוך רקמת העצבים ללא פגע.

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

סרטון זה מתאר את הליך הקפאת רקמת השריר והשגת החלקים הדקים שלה. הטכניקה יכולה לסייע בחקר קכקסיה הקשורה לסרטן במודלים של עכברים לסרטן המעי הגס.

הקפאה מהירה של רקמת שריר לצורך חיתוך: פרוטוקול להשגת מקטעים דקים במיוחד של רקמת שריר מורין שהוקפאה במהירות

פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

בכתב יד זה, אנו מציגים פלטפורמת קריוהיסטולוגיה אוטומטית למחצה בעלת תפוקה גבוהה להפקת תמונות מרוכבות מיושרות של מדדי תגובה מרובים ממספר סבבים של הדמיה פלואורסצנטית על חלקים קפואים של רקמות מינרליות.

תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized

טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, לב וכבד.

כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

כאן אנו מראים כיצד להשתמש במכשיר הקפאת הכריך להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים בתרבית, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. אנו גם מראים כיצד להכין דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה.

הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים

פיתחנו טכניקת עיבוד רקמות המשתמשת ברקמת ריאה משובצת ויברטומה ואגרוז ליצירת קטעי ריאה, ובכך אפשרנו רכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת ריאות. השתמשנו בצביעת אימונופלואורסנציה כדי לצפות בביטוי חלבונים מרחבי באמצעות סמנים מבניים ספציפיים של הריאה.

חתך ויברטומי אוטומטי של רקמת ריאה משובצת אגרוז להדמיית פלואורסצנטיות מרובת משתתפים

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי &lt; 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

הלבנה איטרטיבית ספקטרלית מרחיבה ריבוי (IBEX) מתבססת על טכניקת IBEX הבסיסית על ידי הוספת חסימת הפרין כדי למזער קשירה לא ספציפית ומינוף זיהוי ספקטרלי עם פירוק חישובי כדי לדכא אוטופלואורסצנטיות. גישה זו מאיצה את רכישת התמונה תוך הפחתת מקורות הרקע, ומאפשרת ניתוחים פרוטאומיים מרחביים רב-עגולים ובעלי פרמטרים גבוהים.

הדמיה גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ספקטרלית כדי למזער פלואורסצנטיות רקמות לא ספציפיות

למד שיטת צביעה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי ברקמות קפואות. השיטה מאפשרת זיהוי ומיקום משותף של מספר ביומרקרים בחתך קריוסקציה אחד, כולל מרקרים שאינם ניתנים לזיהוי בחתכי פרפין מסורתיים.

שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות

גלה סרטונים נוספים