Name: שיטת שיתוף התרבות כדי ללמוד Neurite Outgrowth בתגובה שיניים זולה הקרנף סימנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: למד שיטת שיתוף תרבות לחקירת אינטראקציות בין תאי שן לנוירונים טריגמינליים. הפרוטוקול מאפשר מניפולציה גנטית וניתוח מורפולוגי של צמיחת נויריטים במודל מעבדתי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו היתה נתמכת על ידי) המוסדות הלאומיים לבריאות/NIAMS (להעניק מספרים R01 AR062507 ו R01 AR053860 ל RS), ב) אוניברסיטת אלבמה הדרכה המחקר האקדמי של ברמינגהאם (DART) מענק (מספר T90DE022736 (PI MacDougall) כדי SBP מן המכון הלאומי לרפואת שיניים, מכוני בריאות הלאומי, ג) מרכז עולמי UAB עבור הגולגולת, אוראלי הפרעות שיניים (GC-מקודד) פיילוט והיתכנות מענק SBP ו-d) המכון הלאומי לרפואת שיניים וקרניו Ofacial מחקר/מכוני לאומי של בריאות K99 DE024406 מענק SBP.

<ol><li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li>
<li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+morphogenesis%3A+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+biologie+buccale%22%5BJournal%5D)">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li>
<li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li>
<li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+finding+of+pain+nerve+fibers%3A+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li>
<li>Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li>
<li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions%2C+signaling+networks%2C+and+semaphorin+3A%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).</li>
<li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+neurite+outgrowth+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li>
<li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li>
<li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114(2015).</li>
<li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hexadimethrine+bromide+%28polybrene%29+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1%2FSSAV+1+and+BaEV%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li>
<li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li>
<li>Alić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li>
<li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li>
<li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number%3A+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li>
<li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558(2013).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li>
<li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification%2C+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).</li>
<li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li>
<li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li>
<li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li>
<li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li>
<li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799(2016).</li>
<li>Pagella, P., Neto, E., JimÃ©nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326(2014).</li>
<li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+on+a+chip%3A+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הפעילויות היומיומיות של חלל הפה דורשים כי תחושת השיניים גירויים חיצוניים דלקת פנימית על מנת לאפשר שימוש נאות ותחזוקה. עם זאת, רק מידע מוגבל זמין לגבי האותות הנוהגים בתהליכים ההתפתחותיים של השימור השן. פרוטוקול זה מספק שיטה לבידוד ושיתוף של התאים העיקריים של DP ו-TG הנוירונים כדי ללמוד את התקשורת בין שתי האוכלוסיות. מספר משתנים היו ממוטבים והשאירו שדרות פתוחות נוספות של מחקר, כמתואר להלן.
הפקדים חשובים בכל שלב בסדר זה. מסנן transwell עם נוירונים TG בלי תאים DP הבסיסית צריך להיכלל בכל הספקות כדי...

אינבציה שן מאפשר לשיניים לחוש לחץ, טמפרטורה ודלקת, כולם חיוניים לשימוש ותחזוקה של איבר השן. אי תחושה של כאב שיניים הקשורים עששת וטראומה מוביל התקדמות המחלה. לכן, אינבציה נכונה היא דרישה לצמיחה שן רגילה, תפקוד וטיפול.
בעוד רוב האיברים הם פונקציונליים לחלוטין innervated על ידי זמן הלידה, התפתחות שיניים מרחיב לחיי מבוגרים, עם אינבציה שן ומינרליזציה המתרחשים בקונצרט במהלך השלבים לידה1,2. באופן מעניין, עיסת שיניים (DP) מזנכימה בתחילה מפריש אותות דוחה במהלך embryogenesis כדי למנוע כניסה אקסון לתוך האיבר המתפתח השיניים, אשר מאוחר יותר משתנה הפרשה של גורמים מושכים כמו השן התקרבות התפרצות3,4. במהלך השלבים לאחר הלידה, כלי לימפה אקסונים מתוך העצבים המשולש (TG) לחדור לתוך ולאורך השן סביב הזמן דנטט התצהיר מתחיל (נבדקו pagella, P. et al.5). מספר מחקרים vivo הוכיחו כי התקשורת העצבית-mesenchymal מדריך שיניים מורה בעכברים (נבדקו ב Luukko, K. et al.6), אבל כמה פרטים של מנגנונים מולקולריים זמינים.
שיתוף התרבויות הסלולארי מספק סביבות מבוקרות שבהן החוקרים יכולים להשפיע על האינטראקציות בין אוכלוסיות נירואליות לבין אוכלוסיית מסנצ'יאל. שיתוף האמנות ניסויים לאפשר להתעמק עמוק יותר לתוך משעולים איתות המנחה השן ופיתוח. עם זאת, כמה מהשיטות הקונבנציונליות המשמשות לחקר התאים בתרבות המשותף מציגים אתגרים טכניים. למשל, כתמים קריסטל סגול של neurite מוצלח יכול לא במיוחד הכתמים שתאי schwann כלולים בדיסיות הצרור TG, וייתכנו פסגות בחוזק צבע עם תגובות קטנות יחסית7. חדרי מיקרופלואידיג מציעים אופציה אטרקטיבית, אבל הם הרבה יותר יקרים מאשר מסנני העברה של8,9 ורק לאפשר את החקירה של תגובות נוירואליות הפרשות העקורים. כדי לטפל בנושאים אלה, פיתחנו פרוטוקול המאפשר: a) כתמים מדויקים והדמיה של TG neurite מוצלח בתגובה הפרשות DP, b) שינוי גנטי של תאים dp ו/או הנוירונים TG לחקור מסלולים מסוימים איתות, ו c) חקירה של תגובות תא DP הגורמים מופרש על ידי TG נוירונים. פרוטוקול זה מספק את היכולת לחקור במדויק מספר תכונות של אינבציה שן בסביבה מבוקרת של שיתוף תרבות חוץ-גופית.

<table><tbody><tr><td>5-Fluoro-2'-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>משמש כמעכב מיטוטי בגיל 15 &mu; ריכוז M במצע תרבית משותפת, יום 2</td></tr><tr><td>24 צלחת תרבית תאים</td><td>באר קורנינג</td><td>3524</td><td>צלחת תרבית משותפת</td></tr><tr><td>Alexa-546 אנטי עוף</td><td>Invitrogen</td><td>A-11040</td><td>משני להכתמת צמיחת נויריט המסומנת על ידי נוגדן נגד GFP, דילול 1:500 נוגדן</td></tr><tr><td>נגד GFP</td><td>Aves Lab, Inc</td><td>GFP-1010</td><td>נוגדן ראשוני לסימון נוירונים Thy1-YFP, דילול 1:200</td></tr><tr><td>אנטי נוירופילמנט 200 נוגדן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NO142</td><td>נוגדן ראשוני חד שבטי לסימון נוירונים, דילול 1:1000, חלופה אם עכברי YFP אינם זמינים</td></tr><tr><td>B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>12603</td><td>Tgfbr2f/f מודל עכבר המשמש לתאי מוך שיניים בפרוטוקול</td></tr><tr>B6 אופטימלי.<td> Cg-TG(Thy1-YFP)16Jrs/J</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>3709</td><td>גנוטיפ מודל עכבר Thy1-YFP המשמש לנוירונים טריגמינליים</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג II</td><td>Millipore</td><td>234155-100MG</td><td>משמש לפיזור נוירונים טריגמינליים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10437</td><td>תוסף למדיה של תרבית משותפת</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11413-11</td><td>מלקחיים עדינים לדיסקציה TG</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>מצפה את תוספות הטרנסוול בריכוז סופי של 10 &mu; גרם/מ"ל, תמיסת המלאי מניחה ב-1.5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>מאגר ליזה (מאגר RLT)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>תמציות RNA מתאי עיסת שיניים לאחר תרבית משותפת</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>תוסף למדיה של תרבית משותפת</td></tr><tr><td>מספריים מיקרו-ניתוחים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>מספריים לדיסקציה לפתיחת</td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ גולגולת זכוכית</td><td>פישרברנד</td><td>12-545-81</td><td>כיסוי עגול לתרבית תאים אופציונלית ועיבוד אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי A</td><td>Gibco</td><td>12571063</td><td>בסיס מדיה לתרבית משותפת</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>תוסף</td><td>אנטיביוטי 15070063 למדיה של תרבית משותפת</td></tr><tr><td>מעכב פוספטאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04 906 837 001</td><td>תוסף ל-RIPA Buffer למיצוי חלבון מתאי מוך שיניים לאחר קו-תרבית</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>משמש לסיוע בהעברת תאי מוך שיניים</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>ציפוי כיסוי לסיוע בהידבקות תאית של מוך שיניים</td></tr><tr><td>מעכבי פרוטאז</td><td>Millipore</td><td>05 892 791 001</td><td>תוסף ל-RIPA Buffer למיצוי חלבון מתאי מוך שיניים לאחר תרבית משותפת</td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף ללא RNAse/DNAse</td><td>דנוויל</td><td>C-2172</td><td>צינורות 1.7 מ"ל מעוקרים מראש לאיסוף RNA, DNA או חלבון בסוף הבדיקה</td></tr><tr><td>ThinCert Cell Culture</td><td>Insert Greiner Bio-One</td><td>662631</td><td>Transwell מוסיף לנוירונים טריגמינליים במבחני תרבית משותפת</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>משמש לפיזור תאי מוך שיניים</td></tr><tr><td>טריפסין סוג II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-7409</td><td>משמש לפיזור נוירונים טריגמינליים</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים במיוחד</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td>מלקחיים עדינים במיוחד לדיסקציה</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>משמש כמעכב מיטוטי ב-1 &mu; ריכוז M במדיה של תרבית משותפת,</td></tr><tr><td>מערכת סינון ואקום</td> יום 2 <td>Millipore</td><td>SCNY00060</td><td>מסנן חד פעמי Steriflip, 50 &mu; m ניילון נטו מסנן</td></tr><tr><td>בקבוקון מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>110006-15</td><td>מלקחיים ארוכים להעברת רקמות לחרוטים</td></tr></tbody></table>

שיטת שיתוף התרבות כדי ללמוד neurite outgrowth בתגובה שיניים זולה הקרנף סימנים

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

אינבציה שן מאפשר לשיניים לחוש לחץ, טמפרטורה ודלקת, כולם חיוניים לשימוש ותחזוקה של איבר השן. ללא שימור חושי, פעילות שבעל פה יומית. תגרום נזק בלתי הפיך למרות חשיבותו, תפקידי האינבציה בהתפתחות השן ותחזוקתו התעלמו במידה רבה. מספר מחקרים הוכיחו כי תאים DP להפריש חלבונים מטריקס מטריצות ואותות הפרדרין כדי למשוך ולהנחות TG אקסונים לתוך ולאורך השן. עם זאת, מחקרים מעטים סיפקו תובנה מפורטת לתוך הטבלת הצלבות בין מספר העקורים לבין האפיפראנטים העצביים. כדי לטפל בפער זה בידע, החוקרים החלו לנצל שיתוף תרבויות ומגוון של טכניקות כדי לחקור את האינטראקציות האלה. כאן, אנו להדגים את השלבים מרובים מעורבים בתאי DP הראשי של העקורים עם הנוירונים TG התפזרו על מסנן מעבר היטב עם נקבוביות בקוטר גדול כדי לאפשר צמיחה סיבי דרך הנקבוביות. בתאי DP העיקרי עם הגן של הריבית מוקף האתרים loxP היו מנוצלים כדי להקל על מחיקת גנים באמצעות אדנווירוס-recombinase GFP מערכת. שימוש בנוירונים TG מהעכבר Thy1-yfp מותר לדימות מדויק של כלי לימפה, עם ביטוי היטב מעל רמות הרקע על ידי המיקרוסקופיה. תגובות DP ניתן לחקור באמצעות חלבון או או RNA איסוף וניתוח, או לחילופין, באמצעות כתמים immunofluorescent של תאים DP מצופה על כיסוי זכוכית נשלפת. מדיה ניתן לנתח באמצעות טכניקות כגון ניתוח פרוטאומית, למרות זה ידרוש המחסור אלבומין בשל נוכחותם של סרום העוברי העובר במדיה. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה שיכולה להיות מניפולציות כדי ללמוד את התגובות מורפולוגית, גנטית, השלד ואת התשובות של הנוירונים TG ותאי DP בתגובה לסביבה מבוקרת של שיתוף תרבות שיטת.

תוצאות אלה מראות כי הגדילה TG neurite מוצלח הוגדלה בנוכחות תאים DP העיקרי בבסיס היטב לעומת השליטה של TG neurite מונוקולטורה (איור 2א, ג). יש כמה שינויים בneurite הצמיחה. לפיכך, יש לכלול את מרחב העצב הTG של החברה באופן קבוע כפקד כדי לזהות את רמות הבסיס של neurite outgrowth. התאים הראשוניים מהעכבר Tgfbr2f/f שימשו בפרוטוקול זה לאחר זיהום של לספירה-gfp ו-Ad-egfp אושרה במספרים שווי ערך של תאים (איור 2ד). ה-Ad-eGFP שימש כוו...

אנו מתארים את הבידוד, פיזור וציפוי של התאים הראשוניים של שיניים (DP) בתאי הראשי עם מסננים (TG) נוירונים תרבותי על גבי מסנני transwell יטב. התגובות הסלולר של תאים DP ניתן לנתח עם immunofluorescence או בניתוח RNA/חלבון. אימונואופלונציה של סמנים עצביים עם מיקרוסקופ קונפוקלית מאפשר ניתוח של תגובות neurite מוצלח.

שיטת שיתוף התרבות כדי ללמוד Neurite Outgrowth בתגובה שיניים זולה הקרנף סימנים

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

פרוטוקול זה מספק מתאר מפורט של איך לתאי גזע עיסת שיניים שיתוף עם נוירונים trigeminal. עם זאת, אנחנו יכולים לחקור תגובות מרובות מונע על ידי crosstalk שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת ללמוד ולתפעל אוכלוסיות תאים או שתיהן ולמדוד במדויק את התוצאות.שיטה זו יש רלוונטיות ישירה למחקר עצבי והוא יכול לספק תובנה לתוך מחקר על איך תאי גזע עיסת שיניים לתקן רקמה עצבית פגום על ידי אירועים טראומטיים או מחלות ניווניות. יש כמה שלבים של טכניקה זו ללמוד וזה יכול להיות קשה לשמור על דרכי כולם. פרוטוקול זה מפרט כל שלב כדי לעזור עם זה.עיסת שיניים וגנגסטרים קשה לפזר ודורשים מערבולות שונות pipetting. גם אז לא תקבל פיזור מלא כך אופטימיזציה ושכפולים יידרשו. לאחר המתת חום של העכבר, מניחים את הראש על האנדרפד החד פעמי, כך שהפה הוא לכיוון התקרה ואת הבסיס של הצוואר שטוח על משטח העבודה.השתמש בסכין גילוח ותהל מנסר כדי להפריד את הגמלייה מהמקסילה. הסר את הלשון עם מספריים או מדפים כדי לאפשר גישה קלה יותר לטוחנות. מניחים את הראש הפתוח בצלחת על משטח גזה סטרילי ומ מניחים את הדגימה מתחת למיקרוסקופ הניתוח.הסר את רקמת העצם המהותית המקיפה את הטוחנות הראשונות. הכנס מלקחיים לתוך פתח מכתשיים להקניט את הרקמה מן השן לכיוון buccle או בצד ה לשוני של הפה. לאסוף את כל הטוחנות הראשונות maxillary בעדינות להעביר את התת-מנדבי וא

a-co-culture-method-to-study-neurite-outgrowth-response-to-dental

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות חומוס הגנגליון E4 statoacoustic ו E6 explants חוט השדרה. Explants הם תרבותי תחת בסרום ללא תנאים ג'ל קולגן 3D עבור 24 שעות. ההיענות Neurite נבדק עם המדיום גורם הגדילה, שיושלם עם חלבון מצופים חרוזים.

Dissection והתרבות של גנגליון צ&#39;יק Statoacoustic Explants ואת חוט השדרה ג&#39;ל קולגן עבור מבחני תוצאה Neurite

השיטה מתוארת בידוד ואפיון של תאי גזע אנושיים שיניים זולות (hDPSCs) באמצעות...

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

סרטון זה מציג טכניקה לביסוס תרבית משותפת של נוירונים טריגמינליים ותאי מוך שיניים ראשוניים באמצעות מסנן טרנסוול. במצב זה של הפרדה פיזית, תאים מזנכימליים המתקבלים מרקמת מוך השן מפרישים מולקולות איתות פרקריניות החוצות דרך הנקבוביות, ומקדמים התמיינות ונדידה של נוירונים לעבר התאים המזנכימליים היוצרים מערכת תרבית משותפת.

הקמת תרבית משותפת של תאי מוך השן ונוירונים טריגמינליים לתקשורת צולבת

סרטון זה מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי כדי לחקור את האינטראקציות בין מוך נבט השן לבין גרעינים טריגמינליים. הוא מציג את מיקום הרקמות בתוך המכשיר המיקרופלואידי ומספק הדמיה מפורטת של צמיחת עצבים טריגמינליים לכיוון נבט השן דרך המיקרו-חריצים של המכשיר. בנוסף, הוא מדגיש את תפקידם של גורמים מולקולריים שמקורם בשיניים בקידום או עיכוב הרחבת נוירויט למוך נבט השן, שהוא חיוני להבטחת עצבוב שיניים יעיל לאחר הלידה.

ניתוח אינטראקציות בין נבט שיניים וגרעינים טריגמינליים באמצעות מערכת תרבית משותפת מיקרופלואידית

גרעיני גב שורש (DRG) הם מבנים המכילים את תאי העצב התחושתיים של מערכת עצבים ההיקפית. כאשר ניתק, הם יכולים להיות שיתוף תרבותי עם תאים כמו SC-המופק שומן גזע (ASC), מתן מודל רב ערך כדי ללמוד במבחנה התחדשות עצב וmyelination, מחקה את סביבת in vivo באתר הפציעה.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

תרביות משותפות מייצגות שיטה רבת ערך לחקר האינטראקציות בין עצבים לרקמות ואיברי מטרה. מערכות מיקרופלואידיות מאפשרות תרבית משותפת של גנגליונים ואיברים או רקמות מתפתחים שלמים במצעי תרבית שונים, ובכך מייצגות כלי רב ערך למחקר במבחנה של הדיבור בין נוירונים למטרותיהם.

ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

אנו מספקים פרוטוקולים להערכה של גזע mesenchymal מבודד מן עיסת שיניים ואינטראקציות התא סרטן הערמונית המבוסס על שיטות תרבות שיתוף ישיר ועקיף. מצב בינוני וממברנות הטרנס-ובכן מתאימים לניתוח פעילות paracrine עקיף. זריעה באופן שונה מוכתמת. בתאים ביחד הוא מודל המתאים לאינטראקציה תא ישירה-cell.

בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם

כאן אנו מציגים עבור בידוד תאי גזע זולה שיניים האנושי והתפשטות פרוטוקול על מנת להעריך את הביטוי חלבון פריאון בתהליך בידול עצביים.

בידוד, הפצת וביטוי חלבונים פריון במהלך עצביים התמיינות של תאי גזע אנושי זולה שיניים

כאן, אנו מספקים שיטה לניתוח התנהגות של האקטונים הגדלים בתוך מטריצות תלת-ממד, מחקה את התפתחותם הטבעית.

דור של 3-D הידרוג'לים קולגן מבוססי לנתח צמיחה Axonal התנהגות במהלך פיתוח מערכת העצבים

מאמר זה מספק מדריך הדרגתי לביסוס תרבית ראשונית של תאי גזע במוך השן באמצעות שיטת תרבית explant ואפיון תאים אלה בהתבסס על הנחיות ICSCRT. התאים שבודדו על ידי פרוטוקול זה יכולים להיחשב כתאי גזע מזנכימליים ליישומים נוספים.

תרבית ראשונית של תאי גזע במוך השן

פרוטוקול זה מתאר שיטות להקמת תרביות שלמות ומנותקות של גרעיני שורש הגב של העכבר (DRG) והשימוש בהן להערכת אינטראקציות גידול-עצב.

הקמת מודלים במבחנה של תרבית גרעיני שורש גב: גישות משלימות לחקירת הצלבה בין סרטן לעצב

למד שיטת שיתוף תרבות לחקירת אינטראקציות בין תאי שן לנוירונים טריגמינליים. הפרוטוקול מאפשר מניפולציה גנטית וניתוח מורפולוגי של צמיחת נויריטים במודל מעבדתי מתקדם.

שיטת שיתוף התרבות כדי ללמוד Neurite Outgrowth בתגובה שיניים זולה הקרנף סימנים

גלה סרטונים נוספים