ההשפעה של ניסוחים דמעה מלאכותית על הפעילות המטבולית של תאי אפיתל הקרנית האנושית לאחר חשיפה להתייבשות

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך במודל מבחנה האם פורמולציות דמעות מלאכותיות יכולות להגן על תאי אפיתל קרנית אנושיים מפני התייבשות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לסייע בזיהוי תכשירי עין יבשה שיכולים לסייע בהגנה על העיניים עבור אנשים עם תסמיני עין יבשה. בדיקה זו משתמשת במדד רגיש מאוד לזיהוי פעילות מטבולית של תאי אפיתל בקרנית.

כתוצאה מכך ניתן לזהות שינויים קטנים בבריאות תאי הקרנית עקב ייבוש. ידגימו את ההליך היום פריסה מירזפור, ניג'אני נגארודקומאראן ואדלין סוקו. התחילו בגידול תאי אפיתל קרנית אנושיים אימורטליים בצלוחיות מצופות קולגן עם 20 מיליליטר של DMEM/F12 המכילים 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, והחליפו את המדיה כל יומיים-שלושה.

לאחר שהתאים כמעט מתלכדים, הסר את אמצעי תרבית התאים, והוסף ארבעה עד שישה מיליליטר של מדיית דיסוציאציה תאית לכל בקבוק. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהם מתנתקים, ובדקו אותם מעת לעת במיקרוסקופ. הוסף שניים עד שישה מיליליטר DMEM/F12 עם 10% FBS לכל בקבוק, והעביר את התכולה לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

צנטריפוגה של התאים ב 450 עד 500 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים במדיה מחוממת מראש. קבע את ריכוז התא בעזרת המוציטומטר, וחשב את הנפח המכיל 100,000 תאים.

הוסף מדיה לכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן I של 48 בארות, יחד עם נפח התאים המחושב, וודא שהנפח הסופי בכל באר הוא 0.5 מיליליטר. לאחר מכן דגרו על התאים למשך 24 שעות. לצורך הליך הבקרה, הסר את אמצעי התרבות מהבארות, וטפל מיד בתאים עם 150 מיקרוליטר של ניסוח בדיקה או תמיסת בקרת מדיה.

לאחר מכן דגרו על התאים למשך 30 דקות. הסר את תמיסת הבדיקה מהתאים, והוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת צבע מטבולית של 10%. דגרו על התאים למשך ארבע שעות נוספות.

לאחר הדגירה, הוציאו 100 מיקרוליטר תמיסת צבע מכל באר, והעבירו אותה לצלחת של 96 בארות. השתמש בקורא צלחות כדי למדוד את הקרינה של כל באר, הגדר את העירור ל-540 ננומטר ואת הפליטה ל-590 ננומטר. כדי לבצע את הליך ההתאוששות, דגרו את התאים עם תמיסות הבדיקה או הפקדים כפי שתוארו קודם לכן.

לאחר מכן הוסף 0.5 מיליליטר של מדיה DMEM/F12 לכל באר. דגרו על התאים למשך 18 שעות. לאחר מכן הסר את המדיה ובדוק את הפעילות המטבולית.

כדי לבצע את הליך הבקרה, הסר את אמצעי התרבות מהתאים בצלחת 48 הבארות, וטפל בהם מיד עם ניסוח הבדיקה או תמיסת בקרת המדיה. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הוציאו את תמיסות הבדיקה מהתאים, והניחו אותן בתא של 37 מעלות צלזיוס ו-45% לחות למשך חמש דקות לייבוש.

לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של תמיסת צבע מטבולית של 10%, ודגרו על התאים למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, העבירו 100 מיקרוליטר מתמיסת הצבע המטבולי מכל באר לצלחת של 96 בארות, ומדדו את הקרינה. כדי לבצע את הליך ההתאוששות, חזור על הפרוטוקול שתואר קודם לכן, וכלול דגירה של 18 שעות עם מדיום DMEM/F12 לאחר שלב הייבוש.

לאחר מכן בצע ניתוח סטטיסטי על הנתונים כמתואר בכתב היד של הטקסט. הושוו שלוש פורמולות לעין יבשה בהשפעתן על הכדאיות של תאי אפיתל בקרנית האנושית. לתמיסות 1 ו-2 הייתה השפעה משמעותית על הפעילות המטבולית של התאים לפני הייבוש.

תאים שנחשפו לתמיסה אחת הראו ירידה נוספת בפעילות המטבולית של התאים לאחר התאוששות של 18 שעות, מה שאומר שהם נפגעו בתחילה והפגיעה לא תוקנה. לשם השוואה, לתמיסה השלישית הייתה השפעה קלה בלבד על הפעילות המטבולית של תאי האפיתל. כאשר משווים את היכולת של תכשירי עין יבשה אלה המכילים שומנים להגן על התאים, נמצא כי תמיסות 1 ו-2 לא הגנו על התאים מפני עקת ייבוש.

הפתרון השלישי, לעומת זאת, הציע הגנה מסוימת. כאשר זורעים את התאים לתוך צלחות מצופות קולגן, וודאו כי תרחיף התאים מכיל תאים מעורבבים באופן אחיד כך שכל באר נזרעת עם מספר תאים שווה. הפתרון השלישי הראה שיפור מובהק סטטיסטית בכדאיות התאים ובהגנה מפני עקת ייבוש בהשוואה לשני המוצרים האחרים המכילים שומנים.

ייתכן ששמן מינרלי עם פוספוליפידים, יחד עם HP-guar ופרופילן גליקול, מאפשרים לתמיסה השלישית לספק הגנת לחות לתאי הקרנית ולהפחית את האידוי תחת ייבוש.