Name: ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן נקודותיים של עכברים עם TNBS המושרה מחלת קרוהן באמצעות Immunofluorescence (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: חקור ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן בקולון עכברים עם דלקת מעי TNBS באמצעות אימונופלואורסצנס. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לחקר קולטנים אלה במחלת קרוהן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה פורסמה בזכות התמיכה הכספית של הרשויות באוניברסיטת לודז ': סגן הרקטור למחקר מדעי, סגן הרקטור לשיתוף פעולה לאומי ובינלאומי ודיקן הפקולטה לביולוגיה והגנת הסביבה. דמיאן ז'זניק נתמך על ידי מענקים (2017/24/T/NZ5/00045 ו-2015/17/N/NZ5/00336) מהמרכז הלאומי למדעים, פולין.

מחקרי בעלי חיים נערכו בהסכמת הוועדה האתית המקומית (28/ל2016) בהתאם לצו 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי ולמועצת ספטמבר 22, 2010 והמלצות מוסדיים.
1. TNBS המושרה מודל מורטין של מחלת קרוהן
הערה: פרוטוקול זה משתמש בעכברים מסוג BALB/C ששוקל 25-28 g. בעלי חיים שוכנו בטמפרטורה קבועה (22-24 ° c) ו, לחות יחסית 55 ± 5%, ומתוחזק 12 h אור/כהה מחזור עם גישה חופשית כדורי אוכל רגיל ברז מים לחות המודעה.
<ol><li>הניחו את העכבר לתוך חדר האינדוקציה וסגרו את המכסה בחוזקה. בקיצור העכבר בקצרה עם isofלוריאן (25% O2 עם o2 שיעור זרימה ב 1.5-2 L/דקות). הערה: קצב הנשימה צריך להישאר קצבי ואיטי מהרגיל, ולא לשנות תגובה לגירוי רעילים.</li>
	<li>להחדיר 4 מ"ג של TNBS ב 0.1 mL של 30% אתנול ב 0.9% הנאל או 0.1 mL של 30% אתנול בשנת 0.9% בתור שליטה ברכב לתוך המעי הגס דרך קטטר. הערה: הקטטר צריך להיות הציג בקפידה כ 3 ס מ לתוך פי הטבעת.</li>
	<li>נטר את העכבר מדי יום מהיום השני עד שמונה עבור פרמטרים קליניים כולל משקל הגוף, דימום רקטלי, שרפרף עקביות ותמותה.</li>
	<li>ביום השמיני, המתת החסד. של העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/60813fig1.jpg"> איור 1: ציר הזמן עבור המודל המושרה TNBS של מחלת קרוהן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60813/60813fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. הפרדת המעי הגס והפקרוסקופי
הערה: יום אחד לפני הפרדת המעי הגס, לדלל 100 μL של אנטיביוטיקה ב 1 מ ל של המלח מאגר פוספט (PBS) ולצאת ב 4 ° c הלילה.
<ol><li>נקה את העור מעל הבטן באמצעות 75% אתנול וגזה סטרילית.</li>
	<li>חותכים את קיר הבטן מעצם החזה לפי הטבעת באמצעות מספריים ופינצטה סטרילית.</li>
	<li>לחתוך את המעי הגס קרוב ככל האפשר פי הטבעת ו cecum.</li>
	<li>מניחים את המעי הגס על צלחת פטרי. חותכים את המעי הגס לאורך פי הטבעת לסוף מעי. נקה ושטוף את המעי הגס 2-4 פעמים בפתרון אנטיביוטי-PBS קר.</li>
	<li>בצע הערכה מאקרוסקופית באמצעות קליבר לפי לוח 1. הערה: הדבקה רקמות* ואודם/דימום,דם צואה ושלשול כפופים להערכה חזותית.# # * הדבקה רקמות להעריך באמצעות סולם שלוש נקודות (0: נקודתיים ללא הדבקה רקמות, 1: קולון עם הדבקה רקמת בינונית, 2: קולון עם הדבקה רקמה נרחבת); מבוססעל היעדרות (0) או נוכחות (1) של אריתמה/דימום, דם צואה ושלשול.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>הדבקה*</td>
			<td>שאריתמה/דימום</td>
			<td>דם צואה</td>
			<td>שלשול</td>
			<td>אורך הכיב</td>
			<td>עובי נקודתיים</td>
			<td>אורך נקודתיים</td>
		</tr>
<tr>
<td>נקודות (0 – 2)</td>
			<td>נקודות (0 – 1)</td>
			<td>נקודות (0 – 1)</td>
			<td>נקודות (0 – 1)</td>
			<td>ס מ/נקודות</td>
			<td>mm/נקודות</td>
			<td>ס מ/נקודות</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 – נעדר</td>
			<td>0 – נעדר</td>
			<td>0 – נעדר</td>
			<td>0 – נעדר</td>
			<td rowspan="3">0.5 ס"מ = 0.5 נקודה</td>
			<td rowspan="3">
n מ"מ = n נקודות</td>
			<td>0 – &lt; 10% קצר יותר מהפקד</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 – בינוני</td>
			<td>1 – הווה</td>
			<td>1 – הווה</td>
			<td>0.5 – שרפרף קל/רופף</td>
			<td>1 – מ-10 עד 20% קצר יותר מהפקד</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 – הווה</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 – הווה</td>
			<td>2 – מעל 20% קצר יותר מאשר הפקד</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מקרוסקופי הניקוד של המעי של עכברים עם מודל המושרה TNBS של מחלת קרוהן.
<ol start="6"><li>להמיר את אורך הכיב בסנטימטרים לסולם נקודה, כלומר, כל 0.5 ס מ של כיב הוא נספר כנקודת 0.5. להמיר את עובי המעי הגס במילימטרים לסולם נקודה, כלומר, כל n mm מתאים n נקודות.</li>
	<li>המר את אורך הנקודתיים בסנטימטרים בקנה מידה של שלוש נקודות. אורך המעי הגס שהושג מכל עכבר עם tnbs המושרה מחלת קרוהן מוערך ביחס לאורך המעי הגס הממוצע עבור קבוצת הביקורת (0: &lt; 10% קצר יותר מאשר הפקד, 1: מ 10 עד 20% קצר יותר מאשר הפקד, 2: מעל 20% קצר מכן ה שליטה).</li>
	<li>לחשב את הציון המקקרוסקופי הכולל על פי המשוואה: ציון כולל מאקרוסקופי = הדבקה (נקודות) + אריתמה/דימום (נקודות) + דם בצואה (נקודות) + שלשול (נקודות) + אורך של כיב (נקודות) + נקודתיים עובי (נקודות) + המעי הגס אורך (נקודות).</li>
</ol>3. הכנה לדגימת קולון
<ol><li>חותכים את המעי הגס לתוך 1-2 ס מ קטעי ומניחים כל על ספוג בקלטת היסטולוגית הנכונה המסומנת. הערה: ספוגים לקלטות היסטולוגית מונעות קיפול קולון במהלך התייבשות ודגירה של פרפין נוזלי.</li>
	<li>מניחים את מקטע המעי הגס 4% פורמלדהיד ו הדגירה לפחות 24 h ב 4 ° c.</li>
	<li>להכין ולתכנת את מעבד הרקמה עבור 1 h של דגירה ב 50%, 70%, 90%, 95%, 100% אתנול, קסילן/100% אתנול (1:1; v/v), ו קסילן בלבד, כמו גם עבור לפחות 3 h של דגירה בפרפין נוזלי. הערה: התייבשות יש לבצע בריכוזים גוברת של אתנול ו xylene, אבל את הריכוז של אתנול ניתן לשנות. תערובת קסילן/אתנול מומלצת אך אינה נדרשת.</li>
	<li>העבר את קטע המעי הגס לתיבה היסטולוגית ומקום במעבד הרקמה המתוכנת מראש.</li>
	<li>. תריץ את מעבד הרקמה</li>
	<li>לאחר שלבי דגירה, מניחים את רסיס המעי הגס בתבנית מתכת, כך שני הקצוות של המעי הגס הם בתנוחה זקופה ולמלא שליש העובש עם פרפין נוזלי.</li>
	<li>מניחים את העובש באזור הקירור (5 ° c) לכמה שניות, ולאחר מכן מזיז את התבנית לאזור ההתחממות (70 ° c). מקום בחלק התחתון של התיבה היסטולוגית ולכסות את שבר המעי הגס כולו עם פרפין נוזלי.</li>
	<li>השאירו את עובש המתכת עם רסיס המעי הגס בפרפין לכמה דקות באזור הקירור. להסיר את תבנית המתכת מבלוק פרפין ו הדגירה לפחות 24 h ב 4 ° c.</li>
	<li>להסיר פרפין עודף מן הבלוק ולהכניס אותו לתוך מיקרוטומה אוטומטית לחלוטין. הערה: בלוק הפרפין עשוי להיות מאוחסן ב-20 ° c לכמה דקות לפני שלב זה.</li>
	<li>חותכים את קטע המעי הגס לתוך 5 יקרומטר סעיפים.</li>
	<li>העבר את חתך המעי הגס לאמבט מים מחומם עד 40 ° c.</li>
	<li>השתמש בשקופית הזכוכית המסומנת כדי להסיר את מקטע הנקודתיים מאמבט המים. הערה: מקטעי המעי הגס צפים על המים. שימו את שקופית הזכוכית המסומנת במים מתחת לסעיף המעי הגס ולמשוך את שקופית הזכוכית בזהירות.</li>
	<li>השאירו את מגלשת הזכוכית 24 שעות בטמפרטורת החדר. לאחסון לטווח ארוך, שמרו על שקופית הזכוכית ב -4 ° c לאחר 24 שעות של דגירה בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>4. אימונוהיסטוכימיה עם מכתים מאימונולובורנציה
הערה: אל תאפשר למקטע הנקודתיים להתייבש בכל שלב במהלך השגרה.
<ol><li>הסרת פרפין על ידי דגירה את שקופית הזכוכית קסילן עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>מניחים את שקופית הזכוכית xylene/100% אתנול (1:1; v/v) עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>מחדש את מקטע המעי הגס בסדרה של ריכוזי אתנול הפחתת, כלומר, 70%, 50%, 30% ו 10% אתנול עבור 5 דקות.. חזור על כל שלב שלוש פעמים</li>
	<li>לשטוף את שקופית הזכוכית תחת מים זורמים עבור 5 דקות.</li>
	<li>מחממים מאגר אחזור אנטיגן (10 מ"מ נתרן ציטראט; 0.05% רצף 20, pH 6.0) עד 95-98 ° צ' ומחממים את שקופית הזכוכית בתמיסה הרתיחה של האנטיגן במשך 10 דקות. הערה: שלב אחזור האנטיגן הוא אופציונלי אך מומלץ. פתרון ללא מיסוך צריך להיות ממוטב בהתאם לנוגדן המשמש את הניסוי.</li>
	<li>ציירו עיגול סביב מקטע המעי הגס בעזרת עט הידרופובי. הערה: שלב זה הוא אופציונלי אך מומלץ. העט ההידרופובי מונע בזבוז של ריאגנטים על ידי שמירה על נוזלי במאגר בנפח קטן בתוך מסומן במעגל.</li>
	<li>מודטה את הסעיף ב 3% המים פתרון של מימן peroxidase עבור 10 דקות.</li>
	<li>לשטוף את הפתרון כביסה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4; 150 mM הנאל; 0.05% רצף 20) עבור 5 דקות.</li>
	<li>דגירה בפתרון חסימה (5% סרום עז רגיל; 50 mM טריס-HCl, pH 7.4; 150 mM הנאל; 0.05% טריטון X-100) עבור 1 h בטמפרטורת החדר. הערה: בפתרון החסימה, הנסיוב הרגיל חייב להיות מאותו זן כמו הנוגדן המשני. בשלבים שבהם נדרשת דגירה, הניחו את שקופית הזכוכית בחדר לחות כדי למנוע התאיידות מוגזמת.</li>
	<li>להסיר את הפתרון חסימה ולהוסיף 20-50 μL של הנוגדן העיקרי נגד ERα, ERβ או GPER מדולל ב 1% בסרום פרה אלבומין עם 50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 mM הנאל, 0.05% טריטון X-100. הערה: דילול מומלץ של נוגדנים ראשוניים מוצגים בטבלה 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>סוג נוגדן</td>
			<td>נוגדן נגד</td>
			<td>Clonality</td>
			<td>מין מארח</td>
			<td>פעילות מחודשת במינים</td>
			<td>דילול</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">ראשי</td>
			<td rowspan="4">מיכל שלמה</td>
			<td rowspan="4">פוליבטיים</td>
			<td rowspan="4">ארנב</td>
			<td>אדם</td>
			<td rowspan="13">1:100</td>
		</tr>
<tr>
<td>עכבר</td>
		</tr>
<tr>
<td>צב</td>
		</tr>
<tr>
<td>קפיברה</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">ERβ</td>
			<td rowspan="6">פוליבטיים</td>
			<td rowspan="6">ארנב</td>
			<td>אדם</td>
		</tr>
<tr>
<td>קוף</td>
		</tr>
<tr>
<td>עכברוש</td>
		</tr>
<tr>
<td>עכבר</td>
		</tr>
<tr>
<td>כבשים</td>
		</tr>
<tr>
<td>חזיר</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">מיכל הגופר</td>
			<td rowspan="3">פוליבטיים</td>
			<td rowspan="3">ארנב</td>
			<td>אדם</td>
		</tr>
<tr>
<td>עכברוש</td>
		</tr>
<tr>
<td>עכבר</td>
		</tr>
<tr>
<td>שני</td>
			<td>דילייט 650</td>
			<td>פוליבטיים</td>
			<td>עז</td>
			<td>ארנב</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 2: מאפייני הנוגדנים.
<ol start="11"><li>מודלת עם נוגדן ראשוני לילה ב 4 ° c בחשיכה.</li>
	<li>הסר את פתרון נוגדן ולשטוף בפתרון כביסה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4; 150 מ"מ הנאל; 0.05% רצף 20) עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>הוסף 20-50 μL של DyLight 650 נוגדן משני מדולל ב 1% בסרום שור אלבומין (המכיל 50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 מ"מ הנאל, 0.05% טריטון X-100). דגירה עם נוגדן משני מעלה עם צבע עבור 1 h בטמפרטורת החדר בחשכה. הערה: הדילול המומלץ של הנוגדן המשני מוצג בטבלה 2.</li>
	<li>הסר את פתרון נוגדן ולשטוף בפתרון כביסה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 mM הנאל, 0.05% רצף 20) עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>הוסף 2% DiOC6 (3) מדולל 50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 mM הנאל ו דגירה עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר בחשכה.</li>
	<li>הסר את הפתרון ולשטוף בתמיסה כביסה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 mM הנאל, 0.05% רצף 20) עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>הוסיפו כמה טיפות מנוזל גליצרול המבוסס על DAPI ישירות על החלק הנקודתיים וכיסו בזהירות בשקופית כיסוי. מחלקת המעי הגס לפחות 24 שעות ב -4 ° c. הערה: הימנע מבועות אוויר בעת כיסוי הרקמה עם שקופית המכסה.</li>
	<li>לנתח את מקטע המעי הגס תחת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד שמציעות 20x או 63 מטרות וטבילה שמן באמצעות תוכנה ייעודית. הערה: טבלה 3 רשימות מאפיינים של fluorochromes בשימוש זה מחקר.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">סוג פלואורואוכדום</td>
			<td colspan="2">אורך הגל (nm)</td>
			<td rowspan="2">צבע</td>
		</tr>
<tr>
<td>עירור</td>
			<td>פליטה</td>
		</tr>
<tr>
<td>דאפי</td>
			<td>405</td>
			<td>460 – 480</td>
			<td>כחול</td>
		</tr>
<tr>
<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>485</td>
			<td>538 – 595</td>
			<td>ירוק</td>
		</tr>
<tr>
<td>דילייט 650</td>
			<td>654</td>
			<td>660 – 680</td>
			<td>אדום</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 3: מאפייני fluorochromes.

<ol><li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li>
<li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li>
<li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li>
<li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone+colitis%3A+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li>
<li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li>
<li>Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li>
<li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous%2C+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H%2FHeJ+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li>
<li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li>
<li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+estrogen+receptor+%CE%B2+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li>
<li>Włodarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+30+%28GPR30%29+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+and+Liver+Diseases%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li>
<li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+%CE%B1+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415(2018).</li>
<li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749(2019).</li>
<li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li>
<li>Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li>
<li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+the+study+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li>
<li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li>
<li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis%2C+but+not+oxazalone-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li>
<li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

ישנם מודלים רבים של בעלי חיים עבור בדיקה פתופסולוגיה IBD, כולל גנטי, מודלים אימונולוגיים או ספונטנית, כמו גם דגמים המושרה כימית15. בין מספר סוגים של מודלים בעלי חיים של קוליטיס, כימית המושרה מודלים כגון מודל TNBS המושרה המתואר בפרוטוקול זה, הם זולים יחסית וקל להשיג. המודל המושרה TNBS של קוליטיס יש כמה תסמינים קליניים הקשורים בסיס פתולוגי של תקליטור. בעלי חיים בעלי קוליטיס מושרה מאופיינים בהיווצרות צואה לא עקבית, שלשול מדמם ואובדן משקל הגוף. עם זאת, אין זה אומר כי מודל זה ניתן להשתמש כדי ללמוד CD e...

קרוהן (CD) היא מחלת מעיים דלקתית (IBD) הנראית כמו דלקת המעי כרונית. האטיולוגיה של תקליטור הוא הבין בצורה גרועה, אבל יש כמה גורמים עיקריים שנראים להיות אחראי על פיתוח תקליטורים, כולל microbiota המעי, וגורמים גנטיים וסביבתיים, כגון דיאטה או מתח1. להבנה טובה יותר של הפתוגנזה של מחלת קרוהן, מודלים שונים של דלקת במעיים שימשו2,3,4,5,6,7. במאמר זה, אנו מציגים את התוצאות שהתקבלו מ 2, 4, 6-trinitrobenzene נזן חומצה sulfonic (TNBS)-מודל murine המושרה של תקליטור.
זה תועד כי אסטרוגנים מסוגלים למודולט דלקת מעיים כרונית8,9,10,11,12. הפעילות הביולוגית של אסטרוגנים מתווכת על ידי קולטנים קנצוני, ביניהם הם קולטני אסטרוגן גרעיני (ERs), כלומר, erα (ג ' ין ESR1) ו ERβ (גנים ESR2), כמו גם G חלבון מצמידים קולטן אסטרוגן, כלומר, gper (גנים GPER1), המכונה ממברנה מאוגד ER13,14. ישנן מספר שיטות לקביעת רמת קולטני אסטרוגן, אבל רק מעטים יכולים לשמש כדי להמחיש אותם במעי.
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא שיטה נפוצה במחקרים קליניים ובסיסיים לאיתור אנטיגנים מסוימים בתאים או ברקמות עם נוגדנים מצוונים fluorochrome. IHC נראה שיטה חשובה הדמיית מבנה רקמות, כמו גם זיהוי ולוקליזציה של חלבונים ספציפיים, אשר עשוי להיות קריטי להבנת ההתפתחות של קוליטיס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מלא ומאומת עבור הדמיה אימונוהיסטוכימיה של קולטני אסטרוגן במעי באמצעות immunofluorescence.

<table><tbody><tr><td>עכברי Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C</td><td>אוניברסיטת לודז'</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td>VWR</td><td>62379-531</td><td></td></tr><tr><td>בלוק קרטון</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA מיקרוסקופ קונפוקלי - TCS SP8</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום סיבובי אוטומטי לחלוטין - RM2255</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>שקופית זכוכית</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800BMNT</td><td></td></tr><tr><td>מודול הטמעת פרפין מחומם - EG1150 H</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>קופסה היסטולוגית</td><td>Marfour</td><td>LN.138747</td><td></td></tr><tr><td>עט הידרופובי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>איזון מעבדה</td><td>Radwag</td><td>WL-104-0048</td><td></td></tr><tr><td>LAS X תוכנה</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>תבנית מתכת</td><td>Marfour</td><td>CP.5105</td><td></td></tr><tr><td>גזה סטרילית</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA מספריים סטריליים</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr> NA <tr><td>פינצטה סטרילית</td><td></td><td></td> NA <td></td></tr><tr><td>מעבד רקמות NA - TP1020</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92822</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6 (3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 650 נוגדן משני</td><td>Abcam</td><td>ab96886</td><td></td></tr><tr><td>ER&alpha; נוגדן ראשוני</td><td>Abcam</td><td>ab75635</td><td></td></tr><tr><td>ER&beta; נוגדן ראשוני</td><td>Abcam</td><td>ab3576</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>אוונטור חומרי ביצועים פולין</td><td>396480111</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>אוונטור פרפורמנס פולינס פולין</td><td>432173111</td><td></td></tr><tr><td>GPER נוגדן ראשוני</td><td>Abcam</td><td>ab39742</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Avantor Performance Materials פולין</td><td>575283421</td><td></td></tr><tr><td>מימן פרוקסידאז</td><td>Avantor Performance Materials פולין</td><td>885193111</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן (פוראן)</td><td>בקסטר</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>פרפין</td><td>Leica Biosystems</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Petrie dish</td><td>Nest Scientific</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer מלח</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פיזיולוגית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>פרימוצין (אנטיביוטיקה)</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifage Mountant עם DAPI (נוזל מבוסס גליצרול עם DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>P36971</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Chempur</td><td>WE/231-598-3</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>אוונטור חומרי ביצועים פולין</td><td>795780429</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Avantor Performance Materials פולין</td><td>853470115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Avantor Performance חומרים פולין</td><td>BA0860119</td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן נקודותיים של עכברים עם tnbs המושרה מחלת קרוהן באמצעות immunofluorescence

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

קרוהן היא הסוג האובחן ביותר של מחלת המעי הדלקתית. דלקת כרונית המתפתחת במעי מוביל להפרעה הפריסטלזיס ולנזק של רירית המעי ונראה להיות משויך לסיכון מוגבר של שינוי המעי הגס הנאופלסטי. צבירת ראיות עולה כי אסטרוגנים וקולטנים אסטרוגן להשפיע לא רק רקמות הורמונלי רגיש, אלא גם רקמות אחרות לא קשור ישירות אסטרוגנים, כגון הריאות או המעי הגס. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לצביעת החיסונית מוצלחת של קולטני אסטרוגן במעי הגס המתקבל ממודל murine של מחלת קרוהן המושרה. פרוטוקול מפורט אינדוקציה של מחלת קרוהן בעכברים והכנה למעיים מסופק, כמו גם צעד אחר צעד אימונוהיסטוכימיקלים הליך באמצעות formalin קבוע-מקטעים המעי מוטבע. השיטות שתוארו הם לא רק שימושי לזיהוי קולטן אסטרוגן החקירה איתות אסטרוגן ב vivo אבל יכול גם להיות מיושם על חלבונים אחרים אשר עשויים להיות מעורבים בפיתוח של קוליטיס.

המאפיינים המקסקופיים של נקודתיים בעכברים עם מחלת קרוהן הנגרמת על ידי TNBS תמונות מייצגות של נקודתיים שנלקחו מהפקד ועכברים שטופלו ב-TNBS מוצגים באיור 2. בעכברים עם מודל TNBS המושרה של מחלת קרוהן, אורך המעי הגס מופחת בעוד רוחב המעי הגס הוא גדל.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/60813fig2a.jpg"> איור 2: נקודתיים מייצגים שהתקבלו מעכברי הבקרה ...

הפרוטוקול מציג מודל מאומת TNBS המושרה מלאה של מחלת קרוהן ושיטות עבור ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות immunofluorescence מקטעים נקודתיים קבוע מוטבע פרפין.

ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן נקודותיים של עכברים עם TNBS המושרה מחלת קרוהן באמצעות Immunofluorescence

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

הגדלת הראיות מרמזת על ההשפעה של איתות אסטרוגן על החלק המעי הגס של הפיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה מבטיחה לזיהוי קולטני אסטרוגן במעי הגס והם מתפתחים קוליטיס. אנו מציגים פרוטוקול מלא מאומת עבור הדמיה אימונוהיסטוכימית של קולטני אסטרוגן במעי הגס, באמצעות immunofluorescence. יחד עם ד"ר סילביה מיכלווסקה מהמעבדה להדמיה מיקרוסקופית של אוניברסיטת לודז', נדגים את ההליך.מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי. חותכים את המעי הגס לרסיס אחד עד שני סנטימטרים. מניחים כל שבר על ספוג בקלטת היסטולוגית המסומנות כראוי.מקם קלטת המכילה שבר נקודתיים ב- 4%paraformaldehyde. דגירה לפחות 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. הכן ותכנת את מעבד הרקמה לשעה אחת של דגירה ב- 50%70%90%95%ו- 100%אתנול, קסילן 100% אתנול וקצילן בלבד, וכן למשך שלוש שעות לפחות של דגירה בפרפין נוזלי.העבר את שבר המעי הגס לקופסה היסטולוגית. מקם את התיבה במעבד הרקמות המתוכנת מראש והפעל את המעבד. לאחר הדגירה במעבד הרקמות מוציאים את המעי הגס מהתיבה ההיסטולוגית וממקם את שבר המעי הגס בתבנית מתכת, כך ששני קצות המעי הגס נמצאים במצב זקוף.ממלאים שליש מהתבנית בפרפין נוזלי. מניחים את התבנית באזור הקירור במינוס חמש מעלות צלזיוס לכמה שניות ולאחר מכן להעביר את התבנית לאזור ההתחממות ב 70 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מניחים את התבנית בחלק התחתון של התיבה ההיסטולוגית ומכסים את כל שבר המעי הגס בפרפין נוזלי.מניחים את תבנית המתכת המכילה את שבר המעי הגס ופרפין באזור הקירור במשך כמה דקות. לאחר מכן להסיר את עובש המתכת מן המעי הגס ואת בלוק פרפין. דגירה קולון וגוש פרפין לפחות 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, להסיר פרפין עודף מהבלוק. הכנס את המעי הגס וגוש הפרפין למיקרוטום סיבובי אוטומטי לחלוטין. חותכים את שבר המעי הגס לחמישה מקטעי מיקרומטר.מעבירים חלק מעי גס אחד לאמבט מים, שחומם מראש ל-40 מעלות צלזיוס. השתמש במגלשת הזכוכית המסוויגת כדי להסיר את קטע המעי הגס מהאמבטיה ולהדגר את מגלשת הזכוכית בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. ראשית, להסיר את הפרפין על ידי דגירה שקופית הזכוכית ב xylene במשך חמש דקות.חזור על שלב זה שלוש פעמים. לאחר מכן מניחים את החלקת הזכוכית בתערובת של אחד לאחד של קסילן ו 100% אתנול במשך חמש דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.השתמש בסדרה של ריכוזי אתנול יורדים כדי rehydrate סעיף המעי הגס. לטבול את השקופית באתנול במשך חמש דקות. יש לחזור שלוש פעמים על כל ריכוז לפני שתמשיך לריכוז הבא.יש לשטוף את מגלשת הזכוכית מתחת למים זורמים למשך חמש דקות. מחממים את מאגר אחזור האנטיגן ל-95 עד 98 מעלות צלזיוס. ואז לחמם את החלקת הזכוכית בתסכול אחזור אנטיגן רותח במשך 10 דקות.כדי למנוע בזבוז של רייגנטים, השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגול סביב החלק המעי הגס. לאחר מכן, הדגירה את המגלשה במשך 10 דקות בתווית 3%של מימן peroxidase ומים. לשטוף את השקופית בתסתר כביסה במשך חמש דקות.לאחר מכן הדגירה את השקופית בתת פתרון חסימה במשך שעה בטמפרטורת החדר. הסר את פתרון החסימה והוסף 20 עד 50 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני נגד אלפא E-R, E-R בטא או G-P-E-R מדולל. דגירה הנוגדן העיקרי לילה בארבע מעלות צלזיוס בחושך.הסר את פתרון הנוגדנים. לשטוף את השקופית שלוש פעמים בתסתר כביסה במשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, מוסיפים נוגדן משני מדולל.הדגירה את המגלשה עם נוגדן משני גדומה צבע במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. הסר את פתרון הנוגדנים המשני מהמגלשה. לשטוף את השקופית שלוש פעמים בתסתר כביסה במשך חמש דקות בכל פעם.מוסיפים פלואורוכרום מדולל להדמיית קרום ומדגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הסר את הפתרון ולשטוף את השקופית שלוש פעמים בתסתר כביסה במשך חמש דקות בכל פעם. הוסף כמה טיפות של DAPI נוזלי מבוסס גליצרול, פלואורוכרום עבור הדמיה גרעיני התא, ישירות על החלק המעי הגס.כסו אותו בזהירות באמצעות שקופית כיסוי. דגירה סעיף המעי הגס לפחות 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. נתח את קטע המעי הגס תחת מיקרוסקופ קונפוקל הכולל מטרות 20x או 63x וטבילת שמן.הספציפיות של הנוגדנים המשמשים במחקר אומתה באמצעות תאי MCF-7. נוגדני קולטן האסטרוגן אפשרו זיהוי של קולטני אסטרוגן גרעיניים E-R אלפא ו- E-R בטא, כמו גם קולטן אסטרוגן כרוך קרום G-P-E-R. כמו כן בוצעה שליטה שלילית שבה תאי MCF-7 הוכתמו רק בנוגדנים משניים עם פלואורוכרום ונוזל מבוסס גליצרול עם DAPI.אות ציטופלסמי חזק של אלפא E-R נמצא בחלקי המעי הגס המתקבל מעכברי בקרה ומעכברים עם מחלת קרוהן הנגרמת על ידי TNBS. עם זאת, רק המעי הגס המתקבל מעכברי בקרה היה E-R אלפא מקומי בציטופלסמה תא הזבל. מיקרוסקופ קונפוקל חשף גם לוקליזציה ציטופלסמית של בטא E-R בחלקי המעי הגס של שני הבקרה והעכברים שטופלו ב- TNBS.באופן דומה, לוקליזציה ציטופלסמית של G-P-E-R תועדה בחלקי המעי הגס שהתקבלו מעכברי בקרה ועכברים שטופלו ב- TNBS. המיקום הנכון של המעי הגס בתבנית חיוני ליצירת חתך רוחב נכון. פלואורוכרום צריך להיבחר על ידי ספקטרום גירוש ו הפליטה משלו.שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על חלבונים אחרים שעשויים להיות מעורבים בפיתוח של קוליטיס. זיהוי אימונוהיסטוכימיה על ידי שפעת חיסונית ניתן להאריך כדי להכתים חלבונים אחרים במצב כיוון חלבון חלבון.

visualization-estrogen-receptors-colons-mice-with-tnbs-induced-crohn

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים את ההערכה של קוליטיס הנגרמת על ידי כימיקלים באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית של רקמת המעי הגס של עכבר. בקטע רקמה מוכתמת, נוכחותם של מספר רב של תאים המגיבים למערכת החיסון ברקמה הפגועה מייצגת את חדירת תאי החיסון במהלך קוליטיס.

הערכה של קוליטיס הנגרמת על ידי כימיקלים באמצעות ניתוח אימונוהיסטוכימי של קטעי רקמת המעי הגס

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת חדירת מקרופאגים במעי במודל מורין של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלואורסצנטי (FMT). עם גרימת קוליטיס בעכבר באמצעות דקסטרן נתרן סולפט (DSS), מזריקים לחיה נוגדנים המזהים את סמן הגליקופרוטאין F4/80 על מקרופאגים שחדרו למעי הגס. לאחר מכן העכבר מצולם במכשיר FMT שבו אותות הפלואורסצנטיות וההחזרה משוחזרים לתמונה תלת-ממדית כדי לקבוע את הפיזור המרחבי והעוצמה של הפלואורסצנטיות.

שימוש בטומוגרפיה בתיווך פלואורסצנטי להערכת דלקת מעיים מורין

טכניקות הדמיה חיה קטנות מאפשרות בדיקות אבחון סדרתי והתערבויות טיפוליות in vivo. לאחרונה, היקף היישומים התרחב באופן משמעותי וכיום כולל הערכה של התפתחות גידולים במעי הגס, ריפוי פצעים וניטור של דלקת. פרוטוקול זה מדגים יישומים פוטנציאליים המגוונים אלה של אנדוסקופיה העכברית.

העכברי אנדוסקופיה ל בVivo ריפוי Multimodal הדמיה של היווצרות הסרטן וההערכה של מעיים פצע ודלקת

זיהוי מדויק ומיקום של תאי אפיתל לאורך רירית רירית המעי חיוני להגדיר שושלות תאים שונות. הדמיה תקינה של רקמות מעי היא קריטית לזיהוי דפוסי ביטוי חלבון עם רזולוציה מקסימלית. מחקר זה נועד להתוות שיטות האופטימליות ותנאי רקמות מעי עכבר עיבוד.

טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent

במודל קוליטיס מונע אנטיגן זה, תאי OT-II CD4+ T המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום הועברו באופן מאומץ לעכברי RAG-/- המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בפגוציטים חד-גרעיניים (MPS). המארחים אותגרו עם Escherichia coli (E.coli) המבטא את חלבון האובאלבומין (OVA) שהתמזג לחלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP).

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

אנו מתארים כאן מודל של עכבר מדווח טרנסגני כדי לדמיין את התאים המייצרים IL-22 בתוך רקמות עכבר שונות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר מיקומם של ציטוקינים אחרים או חלבוני מזכיר בעכבר.

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

הגששים במטרה לייצג כלי חדשני עבור ניתוח המנגנונים המולקולריים, כגון חלבון ביטוי בסוגים שונים של המחלה (למשל, דלקת, זיהום, ו- tumorigenesis). במחקר זה, אנו מתארים הערכה כמותית טומוגרפי תלת מימדי של הסתננות מקרופאג מעיים במודל מאתר של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות F4/80-ספציפיות.

בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר

במחקר זה, אנו מתארים הליך מפורט של פיברוזיס בתיווך מעיים של TNBS, אשר מציג הפתופסולוגיה המקבילה ל-פיברוזיס של קרוהן. אנו גם דנים גישה זו לאור של rapamycin הקלה השפעות מעכבות על סיסטיק מעיים.

תובנה מכניסטית לתוך פיתוח של מעיים TNBS-תיווך פיברוזיס והערכת השפעות העכבות של Rapamycin

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הפיתוח של מודל קוליטיס דמוי קרוהן במכרסמים. דלקת טרנסמולרית מובילה להיצרות באתר ההחדרה של TNBS, והגדלה מכנית נצפתה במגזר הפרוקסימלי להיצרות. שינויים אלה מאפשרים ללמוד מתח מכני בקוליטיס.

מודל מכרסמים המושרה על ידי TNBS לחקר התפקיד הפתוגניים של מתח מכני במחלת קרוהן

אנו מתארים פרוטוקול המפרט את הבידוד של קריפטים המעי הגס מורין לפיתוח קולונואידים תלת ממדיים. לאחר מכן ניתן להתמיין באופן סופני בין הקולונואידים המבוססים כדי לשקף את ההרכב התאי של אפיתל המארח לפני קבלת אתגר דלקתי או הפניה להקמת חד-שכבה אפיתליאלית.

חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים

חקור ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן בקולון עכברים עם דלקת מעי TNBS באמצעות אימונופלואורסצנס. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לחקר קולטנים אלה במחלת קרוהן.

ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן נקודותיים של עכברים עם TNBS המושרה מחלת קרוהן באמצעות Immunofluorescence

גלה סרטונים נוספים