Name: באמצעות מנתח השטף של מסחטות כדי למדוד שינויים גליקוליזה ו זירחון חמצוני במהלך הזרע העכבר מדרכיכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: למד כיצד למדוד שינויים בגליקוליזה ובזירחון חמצוני בזמן אמת בזרע עכברים במהלך קיבולת הזרע. פרוטוקול זה מסייע לחוקרים להבין את מטבוליזם האנרגיה בתהליכי פוריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להכיר בתמיכתם של ד ר לוטו ראמוס-אגריטו במרכז המשאבים של התפוקה והספקטרוסקופיה ברוקפלר.

הזרע נאסף מ-8-16 בן שבוע-CD-1 עכברים גברים. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים של וייל קורנל וועדת השימוש (IACUC).
1. יום לפני השיטת התיאום
<ol><li>
הכנת מחסנית חיישן ומנתח השטף של מסחטות כאשר
	<ol>
<li>כדי לימה את מחסנית החיישן, להסיר את מחסנית חיישן מן השטף XFe96 מגלויה מערכת שיטת ומניחים את מחסנית חיישן הפוך ליד לוחית השירות.</li>
		<li>מילוי מאגר הפתרונות עם 25 מ ל של כפול מזוקקים H2o באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 200 μl של h2o כדי כל טוב של צלחת השירות. מניחים את מחסנית החיישן בחזרה לתוך צלחת כלי השירות ו-דגירה לילה ב 37 ° c בחממה שאינה CO2 . הערה: צריך לשתות מחסנית לפחות 4 h.</li>
		<li>מחלק 25 מ ל של מנתח השטף מתוך הזרם מכייל את שפופרת 50 mL ומודלת אותו לילה ב 37 ° c בחממה שאינה CO2 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת מיקרופלטות מצופות לקונה
	<ol>
<li>לפזר 2.5 מ"ג של קונה ב 5 מ ל של כפול מזוקקים H2O כדי להכין 0.5 Mg/mL (w/v) מניות.</li>
		<li>באמצעות הצינורות רב ערוצי, למלא כל היטב של מנתח השטף מגלותאי 96-צלחת לוחית עם 50 μL של הפתרון ה0.5 mg/mL Con A. השאירו את המכסה פתוח ותנו לצלחת להתייבש לילה בטמפרטורת החדר. הערה: לוחות מרובים יכולים להיות מצופים בבת אחת ומאוחסנים ב 4 ° צ' עד ארבעה שבועות עד מוכן לשימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת מאגר זרע
	<ol>
<li>להכין 250 mL של מאבחן השטף מנתח TYH עם הHEPES נמוך המכיל 138 Mm הנאקל, 4.7 Mm kcl, 1.7 Mm cacl2, 1.2 mm KH2הפו4, 1.2 mm mgso4, 5.6 מ"מ גלוקוז, ו 1 מ"מ hepes. מחממים את החוצץ ל37 ° c ומתאימים את ה-pH ל-7.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. יום השיטת הזמן
<ol><li>הכנה לכיול מחסנית
	<ol>
<li>החלף את ה-H2O ב צלחת השירות עם 200 μl של XF מכייל לטוב ומודלת עבור לפחות 1 H ב שאינו CO2 37 ° c חממה. הערה: במקום כיונמלה, מסוננים מסונן PBS, pH 7.4 ניתן להשתמש.</li>
		<li>חום 50 mL של מאגר TYH ב 37 ° c.</li>
	</ol></li>
	<li>יצירת תבנית גל עבור מנתח השטף החילוץ
	<ol>
<li>להפוך את מנתח השטף החילוץ על ולאפשר את הטמפרטורה לייצב 37 ° c.</li>
		<li>פתח את תוכנת הגל ועצב תבנית חדשה על-ידי פתיחת תבנית ריקה (ראה קובץ משלים 1, תבנית גל).</li>
		<li>פתח את הכרטיסיה הגדרות קבוצה . הגדרת מדיית שיטת הגדרה כ-tyh; pH 7.4 וסוג תא כמו זרע העכבר, להשאיר אסטרטגיות הזרקה ולקדם טיפולים ריקים. צור קבוצות שונות עבור כל תנאי שיטת הפעולה; בדוגמה זו, יש 6 קבוצות שונות (TYH, TYH + db-מחנה/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-מחנה/IBMX, נמלה/ריקבון, נמלה/Rot + db-מחנה/IBMX); מחנה מחנאות (db-cAMP) ו-3-איזובוטיל-1-מתילקסאתה (IBMX) כדי לגרום מדרכיכים, 2-deoxyglucose (2-DG) כמו מעכב גליקוליזיס, antimycin A (antA) ו rotenone (להירקב) כמעכב של השלישי המורכב והראשון של רשת התחבורה אלקטרון. הערה: כדי להתחשב בהבדלים בין בארות, לפחות 7-8 בארות לכל תנאי יש למדוד במקביל.</li>
		<li>פתחו את הכרטיסייה של מפת הצלחות והגדירו את מפת הצלחות על-ידי הקצאת קבוצות לבארות ספציפיות. הערה: ארבע הבארות הפינתיות (A1, A12, H1, H12) יהיו מלאות במאגר TYH (ללא זרע) ומאוחר יותר ישמשו לחיסור רקע.</li>
		<li>פתחו את הכרטיסייה ' פרוטוקול ', הוסיפו 4 מחזורי מדידה שונים, בחרו ביציאה המתאימה וערכו את פרטי המדידה (איור 2, טבלה 1). הדגש מדידה לאחר הזרקה ואין להדגיש את השפה.</li>
		<li>שמור את תבנית המילוי, מלא את סיכום הפרוייקט והגדר את מיקום השמירה עבור קובץ התוצאות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת תרכובות להיטען לתוך מחסנית חיישן
	<ol>
<li>להכין 2 מ ל של 50 mM db-מחנה ידי המסת 9.8 mg של תרכובת במאגר TYH ולהוסיף IBMX לריכוז הסופי של 5 מ"מ. הערה: IBMX יש נטייה לזרז לאחר מדולל במאגר TYH. מאיצים יכולים להיות מומס על ידי vortexing ו-הדגירה של TYH/db-מחנה/IBMX פתרון בלוק חום 37 ° c עבור 5 דקות.</li>
		<li>להכין 1 מ ל של 500 mM 2-DG ידי המסת 82.1 mg של תרכובת במאגר TYH.</li>
		<li>הכינו 1 מ ל של 5 μM של AntA/Rot על ידי דילול שתי התרופות במאגר TYH. הערה: תרכובות הם מדולל 10-קיפול על ידי הזרקה לתוך המחסנית מנתח השטף הזרם; לכן, ודא כי פתרונות ההזרקה מרוכזים יותר ב-10x.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד זרע של עכבר
	<ol>
<li>מורדם 3 עכברים זכרים בין 8 ו 16 שבועות על ידי isofלאנה ולהקריב את העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר שום תגובה צובט הבוהן זוהה. הסר את מיכל ה, היותרת והמידה</li>
		<li>מקום כל תסמונת ב 500 μl של מאגר מראש tyh ב 24-באר צלחת היטב, לשתק את תסמונת לתחתית הצלחת באמצעות זוג מלקחיים ולפתוח את הרקמה על ידי ביצוע 5-7 חתכים קטנים עם מספריים נוצה.</li>
		<li>להעביר את הצלחת מיד לתוך החממה2 37 ° c, ולתת לזרע להתפזר עבור 15 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>טעינת מחסנית החיישן
	<ol>
<li>שני מדריכים לטעינת יציאות עבור יציאה A ו-D ויציאה B ו-C מסופקים בערכת השטף מסחטות. לטעינת יציאה מסוימת, הסר את המכסה ממחסנית החיישן ויישר את האות של מדריך הטעינה המתאים של היציאה עם הפינה השמאלית העליונה של המחסנית. בזמן הזרקת, השתמשו בקצות האצבעות של הידיים שאינן מזריקים כדי להחזיק את קו הטעינה של היציאה במקום והכניסו את קצות הפיפטה אנכית לתוך הנמל וטעינת חורי העזר.</li>
		<li>יציאה A: שימוש בפיפטה רב-ערוצית, הכנס 20 μL של מאגר TYH לכל עמודה.</li>
		<li>Port B: הכנס 22 μL של מאגר TYH לטור 1-4, הכנס 22 μL של 500 mM 2-DG לטור 5-8, ו -25 μL של 5 μM AntA/Rot לעמודה 9-12.</li>
		<li>פורט C: להזריק 25 μL של מאגר TYH לתוך כל עמודה עם מספרים אי-זוגיים, להזריק 25 μL של 10 מ"מ db-cAMP/500 μM IBMX לכל עמודה עם מספרים זוגיים.</li>
		<li>מניחים את מחסנית חיישן עם לוחית כיול לתוך מנתח השטף החילוץ ולהתחיל את השיטת. כיול לוקח 10-15 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת לוחות זרע
	<ol>
<li>התמוססות 45 מ"ג של BSA ב 15 מ ל של מאגר TYH (3 מ"ג/mL w/v) ולהכין שלוש שעות של שלושה מ"ל של 3 mL BSA/TYH פתרון כל אחד ב 5 שפופרות צנטריפוגה mL.</li>
		<li>לשלב שתי בארות זרע כל אחד 1.5 mL צנטר שפופרת, לספור את הזרע באמצעות המטציטוטומטר ולדלל את הזרע לריכוז של 2 x 107 זרע/mL. הערה: השתמשו בטיפים חתוכים לחיתוך זרע כדי למנוע פגיעה בתאים.</li>
		<li>צנטריפוגה את הזרע עבור 3 דקות ב 700 x g, להסיר את supernatant ולהוסיף 1 מ ל של מאגר tyh. חזור על צנטריפוגה step, הסר את הסופרנטאנט, והעבר את כל השעיית הזרע לצינור צנטריפוגה אחד של 5 מ ל עם 3 מ ל של BSA/TYH.</li>
		<li>מקום 180 μL של מאגר TYH לכל פינה היטב (A1, A12, H1, H12) של צלחת מצופה קונה. מקום 180 μL של השעיית זרע לתוך כל באר ריקה של הלוח מצופה קונה (1.2 x 106 זרע/טוב).</li>
		<li>צנטריפוגה את צלחת הזרע ב 250 x g עבור 1 דקות, לסובב את הצלחת על ידי 180 °, ו צנטריפוגה שוב ב 250 x g עבור 1 דקות (הבלם הנמוך ביותר 1).</li>
		<li>להסיר את לוחית הכיול ממנתח השטף החילוץ ולהוסיף את לוחית הזרע. המשך בסדר.</li>
	</ol></li>
	<li>מיצוי וניתוח מידע
	<ol>
<li>לאחר שסיימת את העיבוד, הסר את המחסנית, פתח את קובץ התוצאות, לחץ על הכרטיסיה ייצוא וייצא את ההפעלה הושלמה כקובץ של מנסרה (קובץ משלים 2: נתונים לדוגמה ראשוניים המשמשים לאיור 3).</li>
		<li>שכפל את הקובץ ECAR ו-OCR על-ידי לחיצה על הכרטיסייה החדשה ולאחר מכן את משפחה כפולה . ... tab (איור 3א).</li>
		<li>מחק את 7 השורות הראשונות של הנתונים (איור 3ב).</li>
		<li>נרמל את נקודת הנתונים לפני הזרקת המחנה/IBMX באמצעות החסרה שורה 1. לחץ על הכרטיסיה ניתוח ולאחר מכן על הכרטיסיה הסר מתמטיקה בסיסית ועמודה . סמן שורות נבחרות: שורה ראשונה, חישוב: יחס: ערך/בסיס ועמודות משנה: התעלם מעמודת משנה. לחץ על אישור (איור 3ג).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li>
<li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li>
<li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12%2FE1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54(2009).</li>
<li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li>
<li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li>
<li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li>
<li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li>
<li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hyperactivation+in+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li>
<li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75(2012).</li>
<li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li>
<li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse%3A+the+influence+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li>
<li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoglycerate+kinase+2+%28PGK2%29+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li>
<li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S%2C+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme%2C+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li>
<li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+%28mHk1-s%29+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li>
<li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li>
<li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li>
<li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li>
<li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li>
<li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection%3A+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li>
<li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li>
<li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li>
<li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li>
<li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li>
<li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li>
<li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

אובדן של זרע מדרכיכים בהיעדר מצעים מטבולית מסוימים או אנזימים מטבולית קריטיים חשף את חילוף החומרים של האנרגיה כגורם מפתח התומך הפריה מוצלחת. מתג מטבולית במהלך הפעלת התא הוא מושג היטב בסוגי תאים אחרים, עם זאת, אנחנו רק מתחילים להבין איך זרע להתאים את חילוף החומרים שלהם לביקוש האנרגיה הגוברת במהלך מדרכיכים. באמצעות מנתח השטף לחילוץ, פיתחנו כלי ישימה בקלות כדי לפקח על שינויים בגליקוליזיס וזירחון חמצוני בזמן אמת במהלך מדרכיכים זרע. הזיהוי של שינויים ב H+ ו-O2 עם fluorophores לבדוק חיישן הוא פולשני מינימ...

היישום של ספקטרומטר המסה יש מהפכה המחקר של חילוף החומרים. ממוקד פרופיל חילוף החומרים והעקיבה metabolomic לאפשר ניטור מדויק של שינויים בחילוף החומרים באנרגיה. עם זאת, ביצוע טבולומיקס בהצלחה דורש הכשרה נרחבת, צוות מנוסה, ו יקר, ספקטרומטר מסה מאוד רגיש לא זמין לכל מעבדה. בשנים האחרונות, באמצעות מנתח השטף של מסחטות, כגון סוסון ים XFe96 גדל פופולרי כשיטה פונדקאית למדידת שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה בסוגי תאים שונים1,2,3,4,5.
זרע הם תאים מיוחדים מאוד משבצת; אשר משימתו היא לספק את הגנום אבהי כדי oocyte. זרע עוזב את מערכת הרבייה זכר לאחר שפיכה הם עדיין בלתי בוגרים מבחינה פונקציונלית ולא ניתן להפרות את oocyte כי הם לא מסוגלים לחדור את הvestments של oocytes. זרע לרכוש יכולת דישון כאשר הם עוברים דרך מערכת הרבייה הנשית בתהליך התבגרות המכונה מדרכיכים6,7. הפליטה הטרייה של זרע או זרע בגזור מיותרת הזנב יכול להיות capacitated בחוץ על ידי דגירה באמצעות המדרכיכים מדיה מוגדר המכיל Ca2 +, ביקרבונט (hco3-) או מחנה חדיר תאים אנלוגי (למשל, diבוטילטור-מחנה), קבלה כולסטרול (למשל, סרום בשור, bsa), ומקור אנרגיה (למשל, גלוקוז). במהלך המדרכיכים, זרע לשנות את דפוס התנועתיות שלהם לתוך להכות המרצפות אסימטריים, המייצג מצב שחייה שנקרא hyperactivation פעלה8,9, והם הופכים להיות מוכשרים כדי לעבור את התגובה האקרוכמה7, שם אנזימים פרוטבחרדה שפורסמו כי לעכל את הבאויות של oocytes. תהליכים אלה דורשים אנרגיה, ובדומה לתאים סומטיים, זרע לייצר ATP ותרכובות אנרגיה גבוהות אחרות דרך גליקוליזיס, כמו גם מחזור TCA מיטוכונדריאלי וזירחון חמצוני (oxphos)10. בעוד מחקרים מרובים מדגימים כי גליקוליזיס הוא הכרחי ומספיק כדי לתמוך זרע מדרכיכים11,12,13,14, התרומה של oxphos הוא פחות ברור. בניגוד לסוגי תאים אחרים בהם גליקולזיס משולב פיזית למחזור ה-tca, הזרע ממדר מאוד ונחשבים לשמור על תהליכים אלה בתאי הריצוף הנפרדים: המיחלק מתמקד במכונות המייטוכונדריאלי, בעוד שהאנזימים המרכזיים של גליקוליזה מופיעים כמוגבלים לחלק העיקרי15,16. מידור זה מביא לויכוח מתמשך על האם פירובט המיוצר בחלק העיקרי מאת גליקולזיס יכול לתמוך באוקפוס מיטוכונדריאלי באמצע החלק, והאם ATP המיוצר על ידי oxphos ב-midpiece יוכל לפזר במהירות מספקת לאורך הפלאללום כדי לתמוך בדרישות האנרגיה בחלקים העיקריים של החלק העיקרי של הקרן17,18,19. יש גם תמיכה של תפקיד של oxphos במדרכיכים זרע. לא רק האוקפוס יותר מאשר באופן אנרגטי יותר מאשר גליקוליזיס, היוצר פי 16 יותר ATP מאשר גליקוליזיס, אך מידות נפח ותוכן מיטוכונדריאלי מתואמים במישרין עם כושר הרבייה במינים היונקים המוצגים דרגות גדולות יותר של התחרות בין הזכרים לחבריםבגיל 20. התייחסות לשאלות אלה מחייבת שיטות לבדיקת התרומות היחסיות של גליקוליזיס ואוקפוס במהלך מדרכיכים זרע.
Tourmente ואח ' להחיל מנתח השטף היטב של ממרור כדי להשוות את חילוף החומרים של האנרגיה של מינים העכבר קשור היטב עם פרמטרים שונים באופן משמעותי ביצועי זרע21. במקום לדווח על הערכים ECAR בסיס ו-OCR של זרע non-capacitated, כאן, אנו להתאים את השיטה שלהם באמצעות 96-היטב מנתח השטף לעקוב אחר שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה במהלך זרע העכבר מדרכיכים בזמן אמת. פיתחנו שיטה המאפשרת במקביל לניטור גליקוליזיס ו oxphos בזמן אמת בזרע עם הכאת הדגל של עד 12 מצבים ניסיוניים שונים על ידי מדידת שטף של חמצן (O2) ו פרוטונים (H+) (איור 1a). בשל פירוק של פירובט כדי לקטט במהלך גליקוליזיס וייצור של CO2 באמצעות tca-מחזור, non-capacitated ו capacitated זרע הבלטה+ לתוך מדיה היכולת אשר מזוהים על ידי מנתח השטף החילוץ באמצעות H+-רגיש fluorophores לקצה בדיקה של מחסנית חיישן. במקביל, O2 הצריכה על ידי זרחון חמצוני מזוהה באמצעות fluorophores2-רגיש לקיבוע לאותו קצה בדיקה (איור 1b). זיהוי אפקטיבי של H+ ו נצרך O2 דורש מאגר זרע שונה עם קיבולת אגירה נמוכה ללא ביקרבונט או פנול אדום. כך, כדי לגרום מדרכיכים בהעדר ביקרבונט, אימצנו את השימוש במחנה חדיר מחנה אנלוגי מוזרק יחד עם טווח רחב PDE מעכבי IBMX22. שלוש יציאות הזרקה עצמאיות נוספות מאפשרות הזרקה של מפעילים פרמקולוגיים ו/או מעכבי, אשר מקלה על זיהוי בזמן אמת של שינויים בנשימה התאית ובקצב גליקוליזיס עקב טיפול ניסיוני.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-דאוקסי-D-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8375</td><td>2-DG</td></tr><tr><td>3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I7018</td><td>IBMX; הכינו תמיסת מלאי של 500 מ"מ ב-DMSO (111.1 מ"ג/מ"ל) ואחסנו בכמויות קטנות</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>אנטה; הכינו תמיסת מלאי של 5 מ"מ ב-DMSO (2.7 מ"ג/מ"ל) ואחסנו בכמויות קטנות</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A1470</td><td>BSA</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C1016</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>קונקנקלין A, לקטין מ-Arachis hypogaea (בוטנים)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L7381</td><td>ConA</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>איזותזיה</td><td>הנרי שיין בריאות בעלי חיים</td><td>1169567761</td><td>איזופלורן</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>MgSO4</td></tr><tr><td>N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-מלח נתרן מונופוספט מחזורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>db-cAMP</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>KCl</td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13995</td><td>Rot; הכינו תמיסת מלאי של 5 מ"מ ב-DMSO (2 מ"ג/מ"ל) ואחסנו בכמויות קטנות</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>NaHCO3-נתרן</td></tr> <tr><td>כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Equipment וחומרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 פיפטות ערוצים 10-100 &mu; L</td><td>eppendorf</td><td>ES-12-100</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה 12 ערוצים 50-300 &mu; L</td><td>vwr</td><td>613-5257</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C, ללא CO2 אינקובטור</td><td>vwr</td><td>1545</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינורות צטריפוגה</td><td>eppendorf</td><td>30119380</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>vwr</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>עם מתאם צלחת</td><td>Thermo Scientific</td><td>IEC FL40R</td><td></td></tr><tr><td>ערכת חיתוך</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>MOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך עם 40X אובייקטיבי</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 מ"ל, מחולק</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X93</td><td></td></tr><tr><td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 מ"ל, מחולק</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X95</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>נמכר גם כ-XFe96 FluxPak mini (102601-100) עם 6 במקום 18 קרטיג'ים.</td></tr></tbody></table>

באמצעות מנתח השטף של מסחטות כדי למדוד שינויים גליקוליזה ו זירחון חמצוני במהלך הזרע העכבר מדרכיכים

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

הזרע מקבל קיבולת הפריה במערכת הרבייה הנשית בתהליך המכונה מדרכיכים. תהליכים משויכים למדרכיכים דורשים אנרגיה. קיים דיון מתמשך בנוגע למקורות היוצרים את ה-ATP המזין את הזרע לתנועתיות מתקדמת, מדרכיכים, היפרהפעלה ותגובה מאקרומה. כאן, אנו מתארים את היישום של מנתח השטף מחילוץ ככלי לניתוח שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה במהלך מדרכיכים זרע העכבר. באמצעות H+-ו O2-רגישות fluorophores, שיטה זו מאפשרת בניטור גליקוליזיס ו זרחון חמצוני בזמן אמת ב-non-capacitated לעומת הזרע קיבול. שימוש בשיטה זו בנוכחות מצעים אנרגטיים שונים ו/או מפעילים פרמקולוגיים ו/או מעכבי יכולים לספק תובנות חשובות לתרומת מסלולים מטבוליים שונים והצטלבות בין איתות מפלי ומטבוליזם במהלך מדרכיכים זרע.

שיטה זו משתמשת במנתח השטף מתוך לעקוב אחר שינויים בזמן אמת בקצב של גליקוליזיס ו oxphos במהלך מדרכיכים זרע העכבר. איור 4 מראה ניסוי מופתי בו הזרע הcapacitated בנוכחות גלוקוז כמצע האנרגיה היחיד ו-2-DG ו antimycin rotenone כמו מאפלוטורים תרופתי. המצע האנרגיה במאגר מנתח השטף TYH ואת המודולטורים תרופתי ניתן לבחור בחופשיות בהתאם למטרה של הניסוי. הזרע לא capacitated העכבר ב BSA/TYH היו מחוברים לתחתית של מיקרו מצופה החלל הארעי דרך הראש שלהם. בדוגמה זו, ערכי ECAR בסיס ...

אנו מתארים את היישום של מנתח השטף של מסחטות כדי לנטר שינויים בזמן אמת ב גליקוליזיס וזרחון חמצוני במהלך מדרכיכים זרע העכבר.

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להחיל מנתח שטף חוץ תאית כדי לפקח על שינויים בחילוף החומרים של האנרגיה במהלך קיבוליות הזרע. פיתחנו פרוטוקול זה כדי להשוות שינויים בגליקוליזה וזרחון חמצוני בזמן אמת בין זרע עכבר לא קיבולי וקבולי. ביום שלפני ההתראה, הסר את מחסנית החיישן מערכת בדיקה של שטף חוץ-תאי והצב את המחסנית הפוכה ליד לוחית השירות.מלא מאגר פתרון עם 25 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ולהוסיף 200 microliters של מים לכל באר של צלחת השירות, ולאחר מכן למקם את מחסנית החיישן בחזרה לתוך צלחת השירות. מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס שאינו פחמן דו חמצני. לאחר מכן, aliquot 25 מיליליטר של מנתח שטף חוץ תאיים מכויל לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר ולמקם את הצינור לתוך 37 מעלות צלזיוס שאינו פחמן דו חמצני אינקובטור.כדי להכין צלחות מיקרו מצופות ConA, להמיס 2.5 מיליגרם של ConA בחמישה מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ולהשתמש פיפטה רב ערוצית כדי למלא כל באר של מנתח שטף חוץ תאי 96 גם צלחת עם 50 microliters של פתרון ConA, ולאחר מכן להשאיר את המכסה פתוח לתת את הצלחת להתייבש לילה. כדי להכין את מאגר הזרע, מחממים 250 מיליליטר של חיץ TYH מנתח שטף חוץ תאי ל 37 מעלות צלזיוס ולהתאים את ה- pH ל 7.4. ביום ההקפאה, החלף את המים בכל באר של צלחת השירות עם 200 מיקרוליטרים של כיול XF ל באר והחזר את הצלחת לאינקובטור שאינו פחמן דו חמצני למשך שעה אחת לפחות.כדי ליצור תבנית גל, הפעל את מנתח השטף החוץ-תאי. בזמן שהטמפרטורה מתייצבת ל-37 מעלות צלזיוס, פתחו את תוכנת הגלים פתחו תבנית ריקה. תחת הכרטיסיה הגדרות קבוצה, הגדר את מדיום ההקדמה כ- TYH ואת סוג התא כזרע עכבר, והשאיר את אסטרטגיות ההזרקה וההטרדה המוקדמת ריקות.צור קבוצות שונות עבור כל תנאי ממוזג ופתח את מפת הלוחות כדי להקצות כל קבוצה ל בארות ספציפיות. תחת כרטיסיית הפרוטוקול, בטל שיווי משקל של תאורה, הוסף כל אחד מארבעה מחזורי מדידה שונים, בחר את היציאה המתאימה וערוך את פרטי המדידה כך שהמדד לאחר ההזרקה יסומן, ולאחר מכן שמור את תבנית הבדיקה, מלא את סיכום הפרוייקט ושמור את התוצאות. לפני קצירת הזרע, לפני המלחמה 50 מיליליטר של חיץ TYH ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר קצירת caudas מעכברים זכרים בוגרים, מניחים כל cauda ב 500 microliters של חיץ TYH מחומם מראש בארות בודדות של צלחת 24 בארות. השתמש מטלפים כדי לשתק כל cauda בנפרד בחלק התחתון של כל באר במהירות לעשות חמישה עד שבעה חתכים קטנים בכל רקמה באמצעות מספריים נוצה. כאשר כל caudas כבר חרה, מיד למקם את הצלחת לתוך אינקובטור שאינו פחמן דו חמצני כדי לאפשר את הזרע להתפזר במשך 15 דקות.כדי לטעון את מחסנית החיישן, הסר את המכסה ממחסנית החיישן ויישר את האות של קו היישור המתאים לטעינת יציאות עם הפינה השמאלית העליונה של המחסנית. החזקת מדריך טעינת היציאות במקומו, הכנס את קצות הפיפטי אנכית לתוך חורי מדריך טעינת היציאות של יציאה A והזרק 20 מיקרוליטרים של מאגר TYH לכל עמודה. עבור יציאה B, להזריק 22 microliters של מאגר TYH לתוך עמודות אחד עד ארבעה, 22 microliters של 500 מילימולר 2-deoxyglucose לתוך עמודות חמש עד שמונה, ו 25 microliters של חמישה מיקרומולרית אנטימיצין רוטנונה לטורים תשע עד 12.עבור יציאה C, להזריק 25 microliters של מאגר TYH לתוך כל עמודה עם מספרים אי זוגיים ו 25 microliters של 10 מיליליטר של DIBUTYRYL-מחזורי AMP 500 micromolar IBMX לתוך כל עמודה עם מספרים זוגיים, ולאחר מכן למקם את מחסנית החיישן עם לוחית כיול לתוך מנתח שטף חוץ תאי ולהתחיל את ההסתערות. הכיול ייקח 10 עד 15 דקות. כדי להכין את צלחות הזרע, להוסיף שלושה מיליליטר של שלושה מיליגרם לכל אלבומין סרום חזיר מיליליטר במאגר TYH לכל אחד משלושה צינורות צנטריפוגה מיליליטר.לאחר מכן, בריכה שתי בארות של זרע לתוך כל אחד משלושה צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר הספירה, לדלל את הזרע פעמיים 10 כדי שבעה זרע לריכוז מיליליטר לכל מדגם TYH טרי בתוספת אלבומין סרום חזיר. מסיסים את הזרע על ידי צנטריפוגה ומבזבזים מחדש את כדורי הזרע במיליליטר אחד של חיץ TYH.צנטריפוגה הזרע שוב ולהסיר את supernatants דואג לא להפריע כדורי. מעבירים כל השעיית זרע לאחד מחמשת צינורות הצנטריפוגה המוכנים של חמישה מיליליטר ומוסיפים 180 מיקרוליטרים של חיץ TYH לכל באר פינתית של צלחת מצופה ConA. מוסיפים 180 מיקרוליטרים של זרע לתוך כל באר ריקה של צלחת מצופה ConA וצנטריפוגה הצלחת פעמיים סיבוב הצלחת 180 מעלות בין צנטריפוגות, ולאחר מכן למקם את צלחת הכיול עם צלחת הזרע ולהמשיך את ההתראה.בניסוי מייצג זה, הזרע היה קיבולי בנוכחות גלוקוז כמצע האנרגיה היחיד ו 2-deoxyglucose ו אנטימיצין ו rotenone כמו אפנון תרופתי. החץ מציין אינדוקציה של קיבוליות. בנוכחות גלוקוז, קיבוליות לוותה בעלייה של פי שבעה בקצב החומציות החוץ-תאית אשר מעוכבת על ידי חסימת גליקוליזה עם 2-deoxyglucose.זרע קיבולי הדגים עלייה של פי 20 בשיעור צריכת החמצן בהשוואה לזרע שאינו קיבולי המדגים כי זרע העכבר משפר הן גליקוליזה והן זרחון חמצוני כדי לתמוך בביקוש הגובר לאנרגיה במהלך הקיבוליות. העלייה בקצב החומציות החוץ-תאית במהלך קיבוליות הזרע אינה מושפעת ממעכבי הזרחן החמצוני אנטימיצין A ורוטנונה המצביעים על כך שהשינוי בקצב זה מונע בעיקר על ידי שחרור מימן מגליקוליזה. העלייה בשיעור צריכת החמצן, עם זאת, נחסם על ידי אנטימיצין A ו rotenone, כמו גם על ידי 2-deoxyglucose מגלה כי הגידול OXPHOS במהלך קיבוליות הזרע תלוי בפעילות גליקוליטית.מקור האנרגיה והמפעילים הפרמקולוגיים והמעכבים יכולים להיות מגוונים בהתאם למטרה של הניסוי עד 12 תנאים שונים ניתן למדוד במקביל. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות למינים אחרים כמו אדם או bovine שבו השינויים בחילוף החומרים של האנרגיה במהלך קיבוליות הם מסתוריים באותה מידה.

using-an-extracellular-flux-analyzer-to-measure-changes-glycolysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מספק גישה ביוכימית למדידת קצב החמצה חוץ-תאי (ECAR) וקצב צריכת חמצן (OCR) של תאים לוקמיים ראשוניים עם בדיקת שטף חוץ-תאי. הערכת הפרופיל המטבולי של תאים אלה מסייעת לאפיין את דרישותיהם, מה שמוביל לטיפול מותאם אישית.

בדיקת שטף חוץ-תאי: שיטה למדידת פרופיל מטבולי של תאים

מדידת תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; שינויים בזרע אנושי באמצעות ארבע טכניקות: fluorometry הקונבנציונלי, הפסיק fluorometry זרימה, cytometry זרימה והדמיה תא יחיד

ניתוח פרוטאומי של כל סוג תא תלוי מאוד הן בטוהר והן בפיצול מראש של חומר המוצא על מנת לבצע דה-קומפלקסיזציה של הדגימה לפני ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית (MS). על ידי שימוש בטכניקות שטיפה לאחור, ניתן להשיג זרע טהור ממכרסמים. לאחר העיכול, ניתן להעשיר פוספופפטידים באמצעות TiO2.

ניתוח Phosphopeptide של מכרסמים epididymal תאים-זרע

גליקוליזה היא סמן מטבולי מגדיר במערכות ביולוגיות מרובות. ניטור גליקוליזה על ידי מדידת השטף החוץ-תאי של H+ הוא נפוץ, אך דורש תיקון כמותי וחד משמעי. כאן, אנו מדגימים כיצד לאסוף ולתקן נתוני שטף חוץ-תאי כדי להבחין בין מקורות נשימתיים וגליקוליטיים של החמצה חוץ-תאית.

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

הנה, שני מבחני תפוקה בינונית עבור הערכה של השפעות על Ca2 +-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי מתוארים. מבחני אלה יכולים לשמש בקלות ובמהירות מסך כמויות גדולות של תרכובות עבור אפקטים על Ca2 +-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי.

הקרנת מבחני עבור הערכה של השפעות על Ca2 +תפוקה בינונית-איתות ותגובה Acrosome זרע אנושי

מעבר ממצב השקט למצב בידול בשל הפלסטיות המטבולית שלהם במהלך היווצרות הדם. כאן, אנו מציגים שיטה ממוטבת למדידת נשימה מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס של HSPCs.

ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

השיטה המוצגת כאן מסכמת פרוטוקולים ממוטבים להערכת ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים שאינם דבקים ובתאי אב פרימיטיביים (HSPCs) תוך שימוש במנתח השטף החוץ-תאי כדי למדוד את קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) ואת קצב צריכת החמצן (OCR) של HSPCs בזמן אמת.

הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי

ניתוח תפקוד המיטוכונדריה של הזרע על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשר למדוד את צריכת החמצן של זרעונים הנעים בחופשיות במערכת תא סגור. ניתן ליישם את הטכניקה למדידת נשימה בזרעונים אנושיים, המספקת מידע על מאפייני המיטוכונדריה של הזרע ושלמותו.

רספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת תפקוד המיטוכונדריה בזרעונים אנושיים

מודל העכבר AcroSensE ושיטות הדמיה של תאים חיים המתוארים כאן מספקים גישה חדשה לחקר דינמיקת הסידן בתא התת-תאי של אקרוזום הזרע וכיצד הם מווסתים שלבי ביניים המובילים לאיחוי קרום ואקסוציטוזה אקרוזומית.

הדמיה בזמן אמת של דינמיקת סידן אקרוזומלית ואקסוציטוזה בזרע עכבר חי

פרוטוקול זה מתאר דרך חסכונית לביצוע בדיקת מאמץ גליקוליזית לכימות תכנות מחדש מטבולי במיקרוגליה ראשונית של העכברים. לאחר בידוד וגירוי דלקתי, נמדד קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR) באמצעות מגיבים טריים ומותאמים ל-pH, ולאחר מכן נרמול חלבונים כדי לאפשר הערכה מדויקת וניתנת לשחזור של היסטים גליקוליטיים.

חקר גליקוליזה במיקרוגליה ראשונית באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאית

למד כיצד למדוד שינויים בגליקוליזה ובזירחון חמצוני בזמן אמת בזרע עכברים במהלך קיבולת הזרע. פרוטוקול זה מסייע לחוקרים להבין את מטבוליזם האנרגיה בתהליכי פוריות.

באמצעות מנתח השטף של מסחטות כדי למדוד שינויים גליקוליזה ו זירחון חמצוני במהלך הזרע העכבר מדרכיכים

גלה סרטונים נוספים