Name: ייצור פלזמה אוטולוגית עשירה בטסיות דם להגברת הרחבת פיברובלסטים אנושיים במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: למד שיטה לייצור פלזמה עשירה בטסיות דם להגברת הרחבת פיברובלסטים אנושיים במבחנה. פרוטוקול זה מספק דרך בטוחה ואפקטיבית לטיפולים אוטולוגיים ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למר גרגורי שנייטר על הסיוע הטכני בנתוני ציטומטריית זרימה; פרופ' מיוריאל קונדט (מעבדת הפרמקוגנוזיה, בית הספר למדעי התרופות ואוניברסיטת ז'נבה) על התרת השימוש בציטומטר זרימת Attune ובמיקרוסקופ Cytation 3 בעל תפוקה גבוהה; פרופסור בריג'יט פיטט לייעוץ מדעי.

פרוטוקול המחקר תואם את הצהרת הלסינקי, וכל החולים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לפני שהשתתפו במחקר. דגימות עור מתקבלות מנשים בריאות העוברות ניתוח בטן במחלקה לכירורגיה פלסטית, משחזרת ואסתטית בבתי החולים האוניברסיטאיים בז'נבה (ז'נבה, שוויץ). הנוהל תואם את עקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית המקומית (פרוטוקול #3126).
1. הכנת PRP
הערה: צינורות CuteCell-PRP (טבלת חומרים) מיועדים להכנה מהירה של PRP מנפח קטן של דם המטופל במערכת מעגל סגור.
<ol><li>איסוף דם שלם הערה: קצירת דם אוטולוגי מווריד היקפי של הזרוע באמצעות מחט פרפר המחוברת ישירות לצינור PRP, על פי פרוטוקול האיסוף של המכון הרפואי. דם יכול להיות נסוג ישירות דרך צינורית ורידי אם החולה נמצא תחת הרדמה.<ol><li>פתח את חבילת שלפוחית הצינור. בצע את ניקוב ורידי ולמלא את המספר הרצוי של צינורות PRP עם דם שלם. הוואקום בתוך הצינורות יאפשר איסוף אוטומטי של נפח הדם הדרוש (~ 10 מ"ל).</li>
		<li>בזהירות להפוך את צינורות הפוך כמה פעמים כדי לערבב את הדם עם נוגדי קרישה.</li>
		<li>בתוך ארון בטיחות ביולוגית (Class 2), הסר 100 μL של דם מלא הכולל באמצעות מזרק 1 מ"ל לספירה נוספת של מספר תאי הדם.</li>
	</ol></li>
	<li>צנטריפוגה הערה: ודא שהצנטריפוגה מאוזנת כראוי לפני הפעלתה.<ol><li>לאחר איסוף הדם בצינורות PRP, במידת הצורך, להכין צינור איזון (מסופק בנפרד) עם מים באותה רמה כמו הדם בצינור PRP. הניחו את הצינורות המלאים בצנטריפוגה זה מול זה, וודאו שהמכונה מאוזנת.</li>
		<li>דגימות צנטריפוגות בגודל 1,500 x גרם למשך 5 דקות. הערה: הגדר את מהירות הסל"ד המתאימה בהתאם להוראות יצרן הצנטריפוגות. לאחר הצנטריפוגה, הדם יהפוך מקוטע. תאי הדם האדומים והלבנים לכודים מתחת לג'ל, וטסיות הדם מתיישבות על פני השטח של הג'ל (איור 1).</li>
	</ol></li>
	<li>הפוך בעדינות את צינור PRP 20x כדי להשעות מחדש את שקע טסיות הדם בפלזמה supernatant. הערה: ודא שהטסיות מנותקות לחלוטין מהג'ל. הפלזמה צריכה להשתנות משקופה ושקופה לעכורה. אם קיימים אגרגטים טסיות, יש לאסוף אותם עם הפלזמה.</li>
	<li>כדי לאסוף PRP, קח את פתרון הפלזמה מהצינור באמצעות מכשיר העברת מזרק המחובר מזרק 10 מ"ל. הערה: כ-5 מ"ל של PRP יתקבלו מכל צינור. פתרון ה- PRP מוכן כעת לערבב את ההכנה הסופית במדיום. ניתן לשמור את התמיסה בטמפרטורת החדר (RT) מתחת לארון הבטיחות עד לשלבים עתידיים הכוללים מנתח המטולוגי ושימוש.</li>
	<li>לפני השימוש ב- PRP, קבע את ריכוז טסיות הדם, נפח טסיות ממוצע ומספר תאי דם אדומים ולבנים באמצעות מנתח המטולוגי אוטומטי (טבלה של חומר). כדי לעשות זאת, בזהירות למשוך 100 μL של הפתרון ולהעביר לתוך צינור 1.5 מ"ל. הערה: PRP משמש כתוסף תרבית אוטולוגית בריכוז שבין 5-20% v/v. יש לקבוע את הריכוז האופטימלי של PRP עבור כל קו תא. כדי למנוע היווצרות קריש פיברין, יש להוסיף לתרבית הסופית 2 U/mL הפרין.</li>
</ol>2. בידוד של פיברובלסטים אוטולוגיים ותרבית במדיה עם תוספת FBS או PRP
<ol><li>יש לשטוף דגימות עור במי מלח חוצצי פוספט (PBS) על ידי ניעור עדין בצינור פוליפרופילן בנפח 50 מ"ל.</li>
	<li>אם דגימת העור גדולה יחסית (>10 ס"מ2), הניחו את הדגימה על מכסה צלחת תרבית רקמהבגודל 150 ס"מ (צד אפידרמיס כלפי מטה). הסר את רקמת השומן התת עורית באמצעות זוג מלקחיים ומספריים. כדי למנוע מהרקמה להתייבש, שטפו את הרקמה כל כמה דקות ב-PBS. הערה: השתמש בתרבית רקמה קטנה יותר עבור דגימות קטנות יותר.</li>
	<li>כאשר חיתוך השומן הושלם, חתכו את הרקמה לרצועות בגודל של כ-0.5X1.5 ס"מ באמצעות אזמל סטרילי.</li>
	<li>יש להוסיף 5 מ"ל תערובת קולגן-דיספאז (טבלת חומרים; 14 יחידות Wünsch/מ"ל) לצינור סטרילי בנפח 15 מ"ל.</li>
	<li>העבר את הרקמה החתוכה לצינור, וודא כי חתיכות הרקמה שקועות בתמיסה. יש לסגור את הצינור היטב.</li>
	<li>מניחים את הצינורות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות במשך 150 דקות. לאחר הדגירה, הניחו את הצינור המכיל את הרקמה בארון הבטיחות הביולוגית.</li>
	<li>הניחו את המכסה של צלחת תרבית סטרילית בקוטר 100 מ"מ הפוכה בארון הבטיחות הביולוגית. מעבירים את תמיסת הרקמה המעוכלת לתחתית צלחת התרבית בקוטר 100 מ"מ, מבלי להתיז. אם נותרו חתיכות רקמה כלשהן בצינור, השתמש בפיפט סטרילי של 1 מ"ל או במלקחיים סטריליים כדי להעביר את חתיכות הרקמה לתחתית צלחת התרבית של 100 מ"מ.</li>
	<li>כאשר רצועת האפידרמיס פונה כלפי מעלה, יש להפריד את יריעת האפידרמיס השלמה מהדרמיס באמצעות שני זוגות מלקחיים. החזיקו את הדרמיס של רצועת הרקמה עם זוג מלקחיים ואת קצה האפידרמיס עם זוג מלקחיים נוסף. מקלפים את הדרמיס והאפידרמיס לשני חלקים, ושומרים את החתיכות המופרדות על אותו מכסה. נסה לבצע שלב זה במהירות ולחזור על המניפולציה עבור כל פיסת רקמה.</li>
	<li>מעבירים את חתיכות העור לצלחת תרבית חדשה בקוטר 100 מ"מ המכילה PBS.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים מעבדתיים, מניחים את חתיכות העור בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל עם 3 מ"ל של 0.3% טריפסין/PBS. יש לדגור במשך 10-20 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ולהפוך את הצינור מספר פעמים כל 2-3 דקות.</li>
	<li>כדי לעצור את התגובה האנזימטית, יש להוסיף 3-5 מ"ל של מדיום גידול שלם קר כקרח (מדיום הנשר השונה של דולבקו [DMEM] או RPMI המכיל 10% FBS). מערבלים את הצינור במרץ מספר פעמים. סנן את מתלה הפיברובלסט דרך רשת ניילון 85 מיקרומטר (ממוקם מעל החלק העליון של צינור 50 מ"ל) כדי להסיר פסולת עורית.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 150 x גרם, ב 4 ° C. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-100-1,000 מיקרוליטר של מצע צמיחה שלם.</li>
	<li>באמצעות טריפאן כחול (גורם דילול של x2) מעורבב עם השעיית התא, לספור את מספר התאים הכולל קיימא על ידי מילוי החדר של המוציטומטר. הערה: כדאיות התא תלויה בתנאים המשמשים לעיכול אנזימטי. כדי להגביר את התאוששות התאים ואת כדאיות התא, דגימת העור עשויה להיחתך לחתיכות קטנות יותר.</li>
	<li>צלחת 3-10 x 104 תאים ב-5 מ"ל של מצע גידול FBS מלא (DMEM, 10% FBS מנוטרל בחום למשך 60 דקות ב-56°C, 1% 1 M תמיסת חיץ HEPES, 1% 100x תערובת חומצות אמינו לא חיוניות, 1% 100x L-גלוטמין, 1% 100x פניצילין/סטרפטומיצין, 1% 100x נתרן פירובט) בצלוחית תרביתרקמה בגודל 25 ס"מ. לדגור ב 37 °C (77 °F). הערה: פיברובלסטים קיימא יתחברו לבקבוק תוך 24 שעות ויתחילו להציג את צורת הציר תוך 2-3 ימים.</li>
	<li>ביום השני, שואפים את המדיום המכיל תאים שאינם דבקים ומוסיפים מדיום טרי. הערה: מכיוון שתאים מתים במדיום התרבית משפיעים על הצמיחה של פיברובלסטים בני קיימא, יש להסיר תאים מתים שאינם דבקים בתרבית.</li>
	<li>שנה את המדיום כל 3-4 ימים עד שהתרבות מגיעה למפגש של 70-80%.</li>
	<li>כדי לקצור פיברובלסטים, יש לשטוף עם PBS ולדגור עם תמיסת טריפסין/EDTA למשך 3 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור.</li>
	<li>כדי לעצור את התגובה, הוסף 3-5 מ"ל של מדיום צמיחה מלא חם (DMEM או RPMI המכיל 10% FBS). קח aliquot של השעיית התא כדי לספור את התאים עם המוציטומטר. צנטריפוגה את המתלה במשך 5 דקות ב 200 x גרם ולהסיר את המדיום על ידי שאיפה.</li>
	<li>תרבית את הפיברובלסט בתווך PRP (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M תמיסת חיץ HEPES, 1% 100x תערובת חומצות אמינו לא חיוניות, 1% 100x L-גלוטמין, 1% 100x פניצילין/סטרפטומיצין, 1% 100x נתרן פירובט, 2 U/mL הפרין) באינקובטור ב 37 ° C. הערה: צפיפות התאים המינימלית המומלצת היא 4,000 תאים בני קיימא/ס"מ2.</li>
	<li>כדי להעריך את השפעות PRP על התפשטות פיברובלסטים, פיברובלסטים זרעים (מעבר 2) ב -24 צלחות באר בצפיפות של 8 x 103 תאים לכל באר בתווך PRP עם ריכוזי PRP שונים (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ו -50%) ועם 2 U/mL הפרין או בתנאים בינוניים של תרבות קלאסית (10% FBS). לאחר 7 ימים של תרבית, להוסיף צבע חיוני (התפשטות תאים סגול) לתאים ולהעריך את ההתרבות על ידי ציטומטריית זרימה.</li>
	<li>כדי לחקור סידורים מחדש של שלד ציטו-שלד, תאי זרע ב-96 לוחות תחתונים שטוחים שחורים/שקופים היטב בריכוז של 1 x 10 5 תאים/מ"ל ב-DMEM מלא של צמיחת FBS (ראה שלב 2.14) בתוספת FBS של0.5 % למשך 24 שעות. יש לטפל בתאים עם 10% FBS או ריכוזי PRP שונים (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ו-50%) במשך 7 ימים.<ol><li>תקן את הפיברובלסטים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות וחדיר עם 0.1% Triton X-100 למשך 5 דקות ב- RT. הכתימו את הפיברובלסטים עם 50 מ"ל של 5 U/mL phalloidin, שטפו 2x עם PBS, וסמנו עם 50 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) למשך 5 דקות. Cytation 3 cell imaging multimode reader (BioTek) שימש כדי להמחיש צביעת phalloidin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+therapies+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+and+Aesthetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Autologous therapies in dermatology.</a> The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).</li>
<li>Martin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survey+on+cellular+and+engineered+tissue+therapies+in+Europe+in+2009%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).</li>
<li>Stunova, A., Vistejnova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal+fibroblasts-A+heterogeneous+population+with+regulatory+function+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing.</a> Cytokine & Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).</li>
<li>Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+skin+properties+with+autologous+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).</li>
<li>Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+as+maestros+orchestrating+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).</li>
<li>Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+cell+therapy%3A+will+it+replace+dermal+fillers%5BTitle%5D)+AND+%22Facial+Plastic+Surgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).</li>
<li>Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+as+a+practical+alternative+to+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212(2018).</li>
<li>Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+the+use+of+fetal+bovine+serum%3A+serum-free+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.</a> ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).</li>
<li>Karnieli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consensus+introduction+to+serum+replacements+and+serum-free+media+for+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies.</a> Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).</li>
<li>van der Valk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Bovine+Serum+%28FBS%29%3A+Past+-+Present+-+Future%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li>
<li>Cavallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-Rich+Plasma%3A+The+Choice+of+Activation+Method+Affects+the+Release+of+Bioactive+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules.</a> BioMed Research International. 2016, 6591717(2016).</li>
<li>Peng, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-Rich+Plasma+for+Skin+Rejuvenation%3A+Facts%2C+Fiction%2C+and+Pearls+for+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Facial+Plastic+Surgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).</li>
<li>Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+concentration+yields+in+commercially+available+platelet-rich+plasma+%28PRP%29+systems%3A+a+call+for+PRP+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Regional+Anesthesia+and+Pain+Medicine%22%5BJournal%5D)">Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization.</a> Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).</li>
<li>Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Platelet-Rich+Plasma+%28CuteCell+PRP%29+Safely+Boosts+In+Vitro+Human+Fibroblast+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion.</a> Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).</li>
<li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+safety+studies+on+autologous+cultured+human+skin+fibroblast+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation.</a> Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).</li>
<li>Lee, E. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Autologous+Cultured+Fibroblast+Cells+as+a+Treatment+for+Patients+with+Facial+Contour+Defects%3A+A+Clinical+Replication+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetics%2C+Dermatological+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study.</a> Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).</li>
<li>Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+fibroblast+culture+in+the+repair+of+aging+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin.</a> Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).</li>
<li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+fibroblast+suspension+for+the+treatment+of+refractory+diabetic+foot+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Dermatology%2C+Venereology+and+Leprology%22%5BJournal%5D)">Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer.</a> Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).</li>
<li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Platelet+Lysate+as+a+Functional+Substitute+for+Fetal+Bovine+Serum+in+the+Culture+of+Human+Adipose+Derived+Stromal%2FStem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells.</a> Cells. 8 (7), 724(2019).</li>
<li>Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet-rich+plasma%3A+a+biological+supplement+to+enhance+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).</li>
<li>Martinez-Zapata, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet-rich+plasma+for+treating+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).</li>
<li>Cervelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+platelet-rich+plasma+and+hyaluronic+acid+in+the+loss+of+substance+with+bone+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Skin+%26+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure.</a> Advances in Skin & Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).</li>
<li>Nicoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hidradenitis+suppurativa+treatment+using+platelet-rich+plasma+gel+and+Hyalomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix.</a> International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).</li>
<li>Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+platelet-rich+plasma+in+maxillofacial+surgery%3A+clinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Craniofacial+Surgery%22%5BJournal%5D)">Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).</li>
<li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjunctive+Platelet-Rich+Plasma+%28PRP%29+in+Infrabony+Regenerative+Treatment%3A+A+Systematic+Review+and+RCT%27s+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis.</a> Stem Cells International. 2018, 9594235(2018).</li>
<li>Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+pure+platelet-rich+plasma+injections+for+facial+skin+rejuvenation%3A+Biometric+instrumental+evaluations+and+patient-reported+outcomes+to+support+antiaging+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).</li>
<li>Fiaschetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+and+ultrasound+evaluation+after+breast+autologous+fat+grafting+combined+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).</li>
<li>Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting%3A+What+Is+the+Best+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406(2015).</li>
<li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platlet+Rich+Plasma+%28PRP%29+Improves+Fat+Grafting+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li>
<li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma%3A+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66(2017).</li>
<li>Ferrao, A. V., Mason, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+heparin+on+cell+proliferation+and+type-I+collagen+synthesis+by+adult+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).</li>
<li>Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypersensitivity+reactions+to+heparins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Hypersensitivity reactions to heparins.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).</li>
<li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cuénod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research & Therapy. 5 (8), (2015).</li>
</ol>

פרויקט זה מומן על ידי Regen Lab SA. שרה ברנדט היא מנהלת הפרויקט הראשי של תרפיה תאית במעבדת Regen ומועסקת על ידי Regen Lab SA. אנטואן טורזי הוא מנכ"ל RegenLab.

היתרונות של שימוש בפיברובלסטים אוטולוגיים כחלופה טבעית בהשוואה לחומרי מילוי אחרים בטיפול בתאי פצע כוללים תאימות ביולוגית טובה, תופעות לוואי מינימליות וקלות הקציר והשימוש. עם זאת, לפני השימוש בטיפולים אלה במסגרת קלינית יומיומית, יש צורך במחקרים פרה-קליניים נאותים כדי לזהות את תכונות הגידול ולהעריך את התפקוד הביולוגי והבטיחות של פיברובלסטים מבודדים לפני ואחרי ההשתלה. לכן, מיד לאחר תהליך הבידוד, הרחבה חוץ גופית של התאים חייבת להתבצע במהירות על מנת להגביל את מספר חלוקות התא. תנאי התרבית חייבים להיות מבוקרים היטב כדי להבטיח א...

רפואה רגנרטיבית שואפת לרפא או להחליף רקמות ואיברים שניזוקו על ידי גיל, מחלה או טראומה, כמו גם לתקן פגמים מולדים. בטיפול אוטולוגי, תאים או רקמות נסוגים מהמטופל, מורחבים או משתנים, ואז מוצגים מחדש לתורם. לצורה זו של טיפולים יש פוטנציאל רחב בתחום הדרמטולוגיה1. בטיפול אוטולוגי בפיברובלסטים, הפיברובלסטים של המטופל מתורבתים ומוזרקים מחדש לטיפול בקמטים, קמטוטים או צלקות אקנה. מכיוון שפיברובלסטים הם התאים הפונקציונליים העיקריים בדרמיס, הזרקה של פיברובלסטים אוטולוגיים עשויה להיות מועילה יותר מטיפולים אחרים בהצערת הפנים2.
בעור, פיברובלסטים אחראים לסינתזה ולהפרשה של חלבונים חוץ-תאיים (כלומר קולגן, אלסטין, חומצה היאלורונית וגליקוזאמינוגליקנים). הם גם משחררים גורמי גדילה המווסתים את תפקוד התא, נדידה ואינטראקציות בין מטריצת תאים/תאים בהומאוסטזיס עור רגיל ובריפוי פצעים3. פיברובלסטים עוריים כבר הוצגו כטיפול תאי קליני פוטנציאלי לריפוי פצעי עור4, התחדשות רקמות5, או מילוי עורי בהליכים אסתטיים ופלסטיים6. מחקרים מסוימים אף מצביעים על כך שבהקשר של רפואה רגנרטיבית, פיברובלסטים עשויים להיות טיפול תאי מעשי ויעיל יותר מאשר תאי גזע מזנכימליים7.
כדי להשיג מספר מספיק של פיברובלסטים ליישומים קליניים, הרחבת תאים היא בדרך כלל חובה. תרבית תאי Ex vivo/in vitro דורשת תווך בסיסי בתוספת גורמי גדילה, חלבונים ואנזימים לתמיכה בהידבקות ובשגשוג תאים. סרום בקר עוברי (FBS) הוא תוסף נפוץ לתרבית תאים, מכיוון שדם העובר 1) עשיר בגורמי גדילה בהשוואה לדם בוגר 2) מציג תכולת נוגדנים נמוכה8. ככל שהטיפול התאי מתקדם, ישנם חששות לגבי הבטיחות של תנאי תרבית תאים קלאסיים שבהם FBS מתווסף למדיום התרבית. יתר על כן, יש כיום נטייה להחליף את FBS בחלופות9. מספר תחליפים של FBS הראו תוצאות מבטיחות10.
חלופת הפלזמה העשירה בטסיות דם (PRP) נבחרה כאן, ופיתחנו מכשיר רפואי לייצור תכשיר סטנדרטי של PRP, בשם CuteCell-PRP. השימוש המיועד במכשיר זה הוא הכנת PRP אוטולוגי שישמש כתוסף מדיה לתרבית להרחבת תאים אוטולוגיים בתנאי GMP.
PRP מוגדר כתרחיף טסיות מרוכז בפלזמה. מכיוון שישנם פרוטוקולי הכנה רבים, הנבדלים זה מזה ב-1) כמות הדם הדרושה, 2) סוגי המכשירים שבהם נעשה שימוש, ו-3) פרוטוקול צנטריפוגה, ריכוזי טסיות הדם המתקבלים משתנים מעט מעל ליותר מפי 10 מערך הבסיס של הדם. בנוסף, תכשירי PRP מכילים רמות משתנות של זיהום תאי דם אדומים ולבנים. המינוח "PRP" משמש אפוא לתיאור מוצרים השונים מאוד בהרכבם הביולוגי ובהשפעות הטיפוליות האפשריות שלהם.
ברוב המחקרים, החלפת FBS מושגת באמצעות ריכוזים שונים של PRP המופעל (על ידי טרומבין או סידן). הפעלה מלאכותית זו מעוררת שחרור מיידי וחשוב של גורמי גדילה טסיות מ 15 דקות עד 24 שעות11. לכן, הוא האמין כי הפעלת טסיות אינו רצוי עבור יישומים בתרביות תאים, שבו שחרור איטי של גורמי גדילה מ degranulation טסיות הדרגתי נדרש.
טיפול PRP כרוך בהכנת טסיות דם אוטולוגיות בפלזמה מרוכזת12. ריכוז הטסיות האופטימלי אינו ברור, ומגוון רחב של מכשירים מסחריים זמינים להכנת PRP13. חוסר סטנדרטיזציה זה נובע מחוסר עקביות בין מחקרים והוביל לקופסה שחורה לגבי מינון ועיתוי ההזרקה. פרוטוקול זה מתאר הליך להשגת PRP אוטולוגי באמצעות מכשיר PRP ייעודי זה להרחבת פיברובלסטים בעור במודל תרבית אקס ויו אוטולוגי 100%.

<table><tbody><tr><td>96 באר שחור שקוף שטוח תחתון</td><td>BD פלקון</td><td></td><td>353219 32/מארז</td></tr><tr><td>עקבות תאים צבע</td><td>סגול תרמו פישר מדעי</td><td>C34557</td><td>180 בדיקות</td></tr><tr><td>CuteCell PRP</td><td>Regen Lab SA</td><td>CC-PRP-3T</td><td>3 צינורות לחבילה</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 מ"ג</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>52400-025</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>גלוטמין 200 מ"ל</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>מונה המטולוגיה</td><td>Sysmex</td><td>KK-21N</td><td></td></tr><tr><td>Heparin 5000E ליקמין</td><td>Drossapharm AG</td><td></td><td>0.5 מ"ל</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>Liberase DH</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>2x 5 מ"ג לחבילה</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>Na Pyruvate 1 מ"ג/מ"ל</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>פלואידין אלקסה פלואור 488</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A12379</td><td>300 יחידות</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>טריפסין 1x 0.25%</td> <td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>טריפסין EDTA 0.25%</td> <td>גיבקו</td><td>25200056</td><td>100 מ"ל</td></tr></tbody></table>

ייצור פלזמה אוטולוגית עשירה בטסיות דם להגברת הרחבת פיברובלסטים אנושיים במבחנה

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

כיום יש עניין קליני רב בשימוש בפיברובלסטים אוטולוגיים לתיקון העור. ברוב המקרים נדרשת תרבית תאי עור במבחנה. עם זאת, לתרבית תאים באמצעות מדיה של תרבית קסנוגנית או אלוגנית יש כמה חסרונות (כלומר, סיכון להעברת חומרים זיהומיים או התפשטות תאים איטית). כאן, מערכת תרבית אוטולוגית מפותחת להרחבת תאי פיברובלסטים בעור אנושי במבחנה באמצעות פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) של המטופל עצמו. פיברובלסטים עוריים אנושיים מבודדים מהמטופל בזמן שהם עוברים ניתוח בטן. התרביות נמצאות במעקב עד 7 ימים באמצעות מדיום בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) או PRP. תכולת תאי הדם בתכשירי PRP, שגשוג והתמיינות פיברובלסטים מוערכים. פרוטוקול זה מתאר את השיטה לקבלת תכשיר סטנדרטי ולא מופעל של PRP באמצעות מכשיר רפואי ייעודי. התכשיר דורש רק מכשיר רפואי (CuteCell-PRP) וצנטריפוגה. מכשיר זה מתאים בתנאי פרקטיקה רפואיים מספיקים והוא מערכת סגורה חד-שלבית, אפירוגנית וסטרילית הדורשת צנטריפוגת ספין אחת רכה של 1,500 x גרם למשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, מרכיבי הדם מופרדים, ואת פלזמה עשירה טסיות נאסף בקלות. מכשיר זה מאפשר הכנה מהירה, עקבית ומתוקננת של PRP שיכול לשמש כתוסף תרבית תאים להרחבת תאים במבחנה של תאים אנושיים. ה- PRP המתקבל כאן מכיל ריכוז טסיות פי 1.5 בהשוואה לדם שלם יחד, עם הסרה מועדפת של תאי דם אדומים ולבנים. נראה כי PRP מציג השפעה מגבירה בהתפשטות תאים בהשוואה ל- FBS (פי 7.7) וכי פיברובלסטים מופעלים בטיפול PRP.

טכנולוגיה זו, המוגנת בפטנט, היא מכשיר רפואי פשוט, מהיר וניתן לשכפול המשמש לייצור תכשירי PRP סטנדרטיים. זוהי מערכת חד שלבית, סגורה לחלוטין המאפשרת הכנת PRP מדם שלם ורידי לאחר 5 דקות של צנטריפוגה ב 1,500 x גרם (בשל טכנולוגיית ג'ל ההפרדה). ה- PRP המתקבל לאחר ניקוי הצנטריפוגה מתאי דם אדומים ולבנים, היושבים מתחת לג'ל. לאחר כמה היפוכי צינור, טסיות הדם שנמצאות מעל הג'ל מושעות מחדש בפלזמה, וה-PRP מוכן לשימוש (איור 1).
כדי להעריך את יכולת השחזור של תכולת תאי הדם ב...

פרוטוקול זה מציג מכשיר המייצר PRP כדי להגביר את ההתרחבות במבחנה של תאים במערכת תרבית פיברובלסטים אוטולוגית 100%.

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

פרוטוקול זה הוא המערכת האוטולוגית לתרבית פיברובלסטים אנושית עם פלזמה עשירה בטסיות דם של המטופל עצמו והכנה סטנדרטית למשך חמש דקות. PRP מקדם התרחבות תאים מסיבית של פיברובלסטים בתרבית. אני ממליץ לך להשתמש בשיטה זו באמצעות PRP כתוספת תאים כאשר אתה צריך נחל מסיבי והרחבת תאים בטוחה עבור טיפולים תאיים אוטולוגיים.כאשר אתה מנסה פרוטוקול זה, אני ממליץ לך לבדוק את תקינות PRP. הפלזמה שלך צריכה להיות נקייה מאוד עם היעדר תאי דם אדומים. כאשר אתה מעביר אותו, אתה צריך לעשות את זה בזהירות רבה.ולגבי העיכול של הרקמה שלך, זה צריך להיות נקי מאוד לפני שתמשיך. כדי להתחיל, בזהירות להפוך את הדם מלא טסיות דם פלזמה, או PRP, צינורות הפוך שלוש פעמים כדי לערבב את הדם עם נוגדי קרישה. צנטריפוגו את דגימות הדם במשקל 1500 גרם למשך חמש דקות ברוטור קבוע בזווית של 45 מעלות ואזנו את הצינורות.לאחר הצנטריפוגה, הדם המופרד מכיל תאי דם אדומים ולבנים הכלואים מתחת לג'ל המפריד ולטסיות הדם על פני הג'ל. הפוך בעדינות את צינור ה- PRP 20 פעמים כדי להשהות מחדש את שקע טסיות הדם בפלזמה supernatant. ודא שהטסיות מנותקות לחלוטין מהג'ל והפלזמה צריכה להשתנות מצלולה ושקופה לעכורה.אסוף את תמיסת הפלזמה מהצינור באמצעות מכשיר העברה המחובר למזרק 10 מיליליטר. הניחו את דגימות העור בצינור פוליפרופילן של 50 מיליליטר עם PBS ונערו את הצינורית בעדינות. אם דגימת העור גדולה יחסית, הניחו אותה על מכסה של צלחת תרבית רקמה בגודל 150 סנטימטרים רבועים עם צד האפידרמיס כלפי מטה.הסר את רקמת השומן התת עורית באמצעות זוג מלקחיים ומספריים. כדי למנוע מהרקמה להתייבש, שטפו את הרקמה כל כמה דקות ב-PBS. כאשר הסרת השומן הושלמה, השתמש באזמל כדי לחתוך את דגימות העור לרצועות, כ 0.5 על 1.5 ס"מ.לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של תערובת Collagenase/Dispase לצינור סטרילי של 15 מיליליטר. מעבירים את הרקמה החתוכה לצינור. ודא שחלקי הרקמה שקועים בתמיסה וסגור את הצינור היטב.מניחים את הצינורות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות במשך 150 דקות. לאחר הדגירה, העבירו את הצינור המכיל את הרקמה לארון הבטיחות הביולוגית. הניחו את המכסה של צלחת תרבית סטרילית בקוטר 100 מ"מ הפוכה בארון הבטיחות הביולוגית.מעבירים את תרחיף הרקמה לתחתית צלחת התרבית בקוטר 100 מ"מ מבלי להתיז. אם נשארות חתיכות רקמה בצינור, השתמשו בפיפט סטרילי של מיליליטר אחד או במלקחיים סטריליים כדי להעביר את החתיכות לתחתית צלחת התרבית. כשהאפידרמיס פונה כלפי מעלה, החזיקו את הדרמיס עם זוג מלקחיים.אחזו בשולי האפידרמיס עם זוג מלקחיים נוסף וקילפו לגזרים את הדרמיס והאפידרמיס. שומרים את החתיכות המופרדות על אותו מכסה, מניחים את חתיכות העור בצלחת תרבית חדשה של 100 מ"מ המכילה PBS. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים במעבדה, להעביר את חתיכות העור לצינור פוליפרופילן 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של 0.3% טריפסין PBS.דוגרים על הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ומערבבים את התוכן כל שתיים-שלוש דקות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. לאחר 10 עד 20 דקות, עצור את התגובה על ידי הוספת שלושה עד חמישה מיליליטר של מדיום צמיחה מלא קר כקרח. מערבלים את הצינור במרץ מספר פעמים.מסננים את המתרחיף, המכיל את הפיברובלסטים, דרך רשת ניילון של 85 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את תמיסת הפיברובלסט במשקל 150 גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-100 עד 200 מיקרוליטר של מצע גדילה מלא לספירת תאים.לוחים את התאים בצלוחית תרבית רקמה בגודל 25 סנטימטרים רבועים. לאחר מכן, לדגור את הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס. שנה את התווך המכיל תאים שאינם דבקים ביום המחרת, ושוב, כל שלושה עד ארבעה ימים.כאשר הפיברובלסטים מגיעים למפגש של 70% עד 80%, שטפו אותם עם PBS והוסיפו תמיסת טריפסין-EDTA. לאחר הדגירה על הבקבוק במשך שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לעצור את התגובה על ידי הוספת שלושה עד חמישה מיליליטר של מדיום צמיחה מלא חם. לאחר מכן, צנטריפוגו את מתלה התא ב 200 גרם במשך חמש דקות.הסר את הסופרנאטנט על ידי שאיפה. מגדלים את הפיברובלסטים בתווך PRP ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. צפיפות התאים המינימלית המומלצת היא 4, 000 תאים קיימא לסנטימטר בריבוע.מכשיר רפואי ייעודי שימש לייצור PRP על ידי עיבוד דם שלם מ-10 חולים שונים. המכשיר הסיר את רוב תאי הדם האדומים ותאי הדם הלבנים. ריכוז הטסיות הממוצע ב-PRP היה גבוה בכ-50% מריכוז הטסיות בדם שלם.פיברובלסטים אוטולוגיים טופחו במדיום עם 10% FBS או במדיה עם ריכוזי PRP שנעו בין אחד ל -50% לאחר שבעה ימים של תרבית, מבלי לשנות את המדיום, התרביות עם PRP של 20% הציגו מספר גבוה יותר של פיברובלסטים בני קיימא. ל-PRP היו השפעות חזקות כמאיץ התפשטות עד פי 7.7 בהשוואה ל-FBS. צביעת פלואדין הראתה כי השינוי המורפולוגי שנצפה בעת הפעלת PRP היה קשור לארגון מחדש של F-actin, שהוא חתימה של הפעלת פיברובלסט.חשש עיקרי מפני התפשטות מהירה של תאים הוא הסיכון לשינוי גנומי. על מנת להעריך זאת, אתה יכול לבצע בדיקת הכלאה גנומית השוואתית כדי להעריך את היציבות הגנומית של התאים שלך. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא להחליף FBS על ידי PRP, שהוא תוסף ביולוגי אוטולוגי חזק יותר.עם זאת, חוקר יכול לגדל יותר תאים מהר יותר ללא כל תוספת של חומרים קסנוגניים. אנו עשויים להשתמש בטכניקה זו עבור סוגי תאים אחרים הזקוקים להרחבת ex vivo לפני היישום הקליני, לדוגמה, קרטינוציטים או תאי גזע מזנכימליים.

production-autologous-platelet-rich-plasma-for-boosting-vitro-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Lysate טסיות הדם האנושי הוא מקור עשיר של גורמי גדילה תוסף חזק בתרבות התא. פרוטוקול זה מציג את תהליך הכנת מאגר גדול של lysate הטסיות על ידי אנוש החל פלזמה עשירה בטסיות, ביצוע מספר להקפיא להפשיר מחזורים depleting שברי הטסיות.

הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע

סרטון זה מדגים טכניקה להבדלה של מגה-קריוציטים והיווצרות טסיות דם. תאי גזע המטופויטיים - שבודדו מדם טבורי אנושי - מתמיינים למגה-קריוציטים בוגרים בנוכחות טרומבופויטין. המגה-קריוציטים הבוגרים מייצרים שלוחות ציטופלזמיות הנקראות טסיות דם, אשר מעוררות טסיות בודדות.

שיטת מבחנה להבדלה של Megakaryocytes והיווצרות טסיות

סרטון זה מדגים את הכנת הפלזמה העשירה בטסיות (PRP) באיכות גבוהה על ידי בדיקת ספירת טסיות דם, איסוף וצנטריפוגה של דם ובידוד טסיות דם. PRP זה משמש ביישומים טיפוליים להתחדשות וריפוי רקמות.

הכנת פלזמה עשירה בטסיות דם מדם היקפי אנושי

Leucocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) מייצג תכשיר שאושר על ידי ה-FDA של תרכיזי טסיות אוטולוגיים בעל ארכיטקטורת פיברין ייחודית, טסיות מועשרות וגורמי גדילה בשפע. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת L-PRF בצד הכיסא וכן מעריכים את תכונותיו המכניות כולל בדיקות חד ציריות ובדיקת חוזק שימור תפרים.

אפיון של יקוציט-טסיות העשיר הפיברין, רומן ביולוגי

מוצג כאן פרוטוקול ליצירת רקמות חיבור מהונדסות לתרבות מקבילה של 48 רקמות בלוח רב-בארות עם מוטות כפולים, המתאימים למחקרים מכאניסטיים, מידול מחלות ויישומי סינון. הפרוטוקול תואם פיברובלסטים מאיברים ומינים שונים ומודגם כאן עם פיברובלסטים לב ראשוניים אנושיים.

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) משמשת לטיפול בהפרעות שרירים ושלד בסוסים. טכניקות שונות מניבות PRP עם ריכוזי טסיות דם ולויקוציטים משתנים. מאמר זה מתאר שיטה להשגת PRP מדם סוסים.

שיטת צינור צנטריפוגה כפולה פשוטה להשגת פלזמה עשירה בטסיות דם מדם סוסים

עבור יישומים עתידיים כתיקון כדי לתקן דמעות חלקיות של הקדמית הצולבת הרצועה (ACL), תאי שמקורם ACL האנושי בודדו מרקמות שהושגו במהלך הליכים שיקומיים, הרחיבו במבחנה וגדלו על פיגומי רקמה מהונדסת. הידבקות ומורפולוגיה תאיות הייתה אז מבוצעים כדי לאשר התאמה ביולוגית על פני פיגום.

אחזור כירורגי, בידוד ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הרחבת תאים הצולבות קדמי אדם נגזרים רצועה עבור יישומי הנדסת רקמות

כתב יד זה מתאר את הייצור, אפיון ושימושים פוטנציאליים של רקמת מבנה הוושט 3D מהונדס הוכנה מפיברובלסטים נורמלים עיקריים אנושיים הוושט ותאי אפיתל קשקש זורעים בתוך פיגום חזירי דה-cellularized. התוצאות מראות ההיווצרות של האפיתל מרובדת בוגר דומה לושט האדם הנורמלי.

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

מוצג פרוטוקול ליצירת וקטורים אדנו-ויראליים בעלי קיבולת גבוהה החסרים את כל רצפי הקידוד הוויראליים. שיבוט של טרנסגנים הכלולים בגנום הווקטור מבוסס על אנדונוקלאזות ביות. הגברת הנגיף בתאי יצרן הגדלים כתאים נצמדים ובתרחיף מסתמכת על וירוס עוזר המספק גנים נגיפיים בטרנס.

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

פיתחנו מבחן גירוי בעיניים אשר מנצל מודל רקמת האפיתל שלושה כמו קרנית-ממדי משוחזר אנושי (RHCE). המבחן הוא מסוגל להבחין בין גירוי העיני וחומרים מאכלים (קטגוריות GHS 1 ו -2 משולבים) ואלה שאינם דורשים תיוג (GHS אין קטגוריה).

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

למד שיטה לייצור פלזמה עשירה בטסיות דם להגברת הרחבת פיברובלסטים אנושיים במבחנה. פרוטוקול זה מספק דרך בטוחה ואפקטיבית לטיפולים אוטולוגיים ברפואה רגנרטיבית.

ייצור פלזמה אוטולוגית עשירה בטסיות דם להגברת הרחבת פיברובלסטים אנושיים במבחנה

גלה סרטונים נוספים