חקירה מקבילה של גיוס β-Arrestin2 עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה מוקטן של הסרט באמצעות שיטת הטנגו-פרסטו

פלטפורמת פרסטו-טנגו הומצאה כדי לבצע את החקירה המקבילה בו זמנית של כל GPCRs שאינם חוש הריח בגנום האנושי, כולל כי מטרות יתומות פרופיל בטא-arrestin הנגרמת על ידי ליגנד 2 גיוס. פלטפורמת פרסטו-טנגו היא משאב קוד פתוח היחיד לפרופיל הגנום GPCR כולו בגישה מקבילה, באמצעות בדיקה עצמאית לגיוס בטא-arrestin חלבון G. הוכחת המעבד תהיה ז'נבייב לארוש עמית מחקר במעבדה שלי, ומנאל זיגאל, מועמד לדוקטורט במעבדה שלי.

לפני תחילת ההליך להוסיף 20 microliters של 25 מיקרוגרם לכל פתרון פולי-L-ליסין מיליליטר לכל באר של המספר הניסיוני המתאים של 384 לוחות תחתונים אופטיים דגירה הצלחות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות עד שעתיים. בסוף הדגירה, להעיף את הצלחות מעל הכיור כדי להסיר את עודף פולי L-ליסין ולהוסיף 40 microliters של פתרון אנטי מיקוטי אנטיביוטי לכל באר. לאחר מכן הדגירה את הצלחות הדרושות לזרוע תאים ב 37 מעלות צלזיוס ומנחים את שאר הצלחות בארבע מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.

כדי לזרוע תאי HTLA להקרנה ראשונית, יש לשטוף בעדינות תרבויות תאים של 150 מילימטרים עם 10 מיליליטר של PBS לפני הטיפול בתרבויות עם שישה מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA למנה. כאשר התאים יש בריכה מנותקת מתלי התא בצינור חרוט 50 מיליליטר המכיל נפח שווה של DMEM. ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.

להשעות מחדש את גלולה ב 2.2 פעמים 10 לתאים החמישי לכל מיליליטר של ריכוז DMEM ולהעיף את הצלחות מעל הכיור כדי להסיר את הפתרון האנטימיקוטי אנטיביוטי. הקש על הצלחות לייבוש וזרע 45 מיקרוליטרים של תאים לתוך כל באר. ואז למקם את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 45% פחמן דו חמצני לילה.

כדי להכין את צלחת מקור DNA 384 היטב עבור transfection להפיץ 50 ננוגרם למיליליטר של כל פלסמיד חינם DNA קידוד מבנה טנגו GPRC של עניין 0.1X טריס-EDTA לתוך כל באר של צלחת 96 היטב. השתמש פיפטה רב ערוצית להעביר באופן ידני 10 microliters של פתרון DNA מכל באר של 96 צלחת גם בארות בודדות של אחד 384 גם צלחת מקור DNA מרובע עבור כל מצב כפי שמודגם. לאחר מכן, מעבירים 40 מיקרוליטרים של תוסף סידן כלורי טוחן 0.313 לכל באר של צלחת מקור הדנ"א ומערבבים בעדינות את התוכן של כל באר.

הוסף 50 מיקרוליטרים של חיץ HEPES 2x לכל באר של צלחת מקור DNA 384 היטב עם ערבוב עדין. לאחר העברה של דקה אחת 10 microliters של תערובת transfection DNA מ 384 צלחת מקור DNA היטב לכל באר של תאי HTLA זרעים דגירה התאים באינקובטור תרבות התא לילה. למחרת decant מדיום התא מנומק לאט להוסיף 40 microliters של בינוני מורעב לכל טוב דואג לא לגעת בתאים ישירות.

לאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוליטרים של חיץ הרכב לשורות המתחלפות ללא תרכובת ב-20 מיקרוליטרים של מתחם הריבית בריכוז של פי שלושה לשורות המתחלפות, לפני החזרת הצלחת לאנקובטור תרבות התאים. 16 עד 24 שעות לאחר גירוי decant את מדיום התא מנוכה ולהוסיף 20 microliters של reagent זוהר מוכן טרי לכל באר עבור דגירה חמש עד 20 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. ואז לקרוא את הצלחות על מונה זוהר מיקרו צלחת עם זמן אינטגרציה של שנייה אחת לגם.

עבור הקרנה משנית, תת תרבות תאי HTLA ב 100 מילימטר מנות ב חמש פעמים 10 לשש תאים צפיפות התא הכוללת ב 11 מילימטרים של מדיום מלא לכל צלחת במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, מעורב 10 מיקרוגרם של GPCR חינם DNA עם 500 microliters של פתרון סידן כלורי Tris-EDTA עם מערבולת ואחריו תוספת של 500 microliters של מאגר HEPES. לאחר רעידות נמרצות, הדגירה את הפתרון במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ומיד להוסיף מיליליטר אחד של הפתרון טיפה חכם על התאים.

מתנדנדים בעדינות כדי להפיץ את המשקעים באופן שווה ולה מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. למחרת, לבדוק את יעילות transfection תחת תמונה תא פלואורסצנטי. תנועות הגדולות מ- 50%כיסוי הן אידיאליות.

יש לשטוף בעדינות את התאים המהותיים בתווית פסוק לפני ניתוק התאים בשלושה מיליליטר של 0.05%trypsin EDTA. לאסוף את התאים ניתוק על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה בארבע פעמים 10 לתאים החמישי למיליליטר של ריכוז בינוני מורעב. ואז זרעים 45 microliters של תאים לתוך כל באר של פולי L-ליסין מקודד 384 צלחת גם למקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא לפחות ארבע שעות.

כדי להכין צלחת תגובה חצי יומן מינון עקומת להוסיף 270 microliters של HBSS בתוספת HEPES ואנטיביוטיקה antimycotic לכל אבל השורה האחרונה של צלחת 96 גם ולהוסיף 30 microliters של כל פתרון תרופה גבוהה ונמוכה לתוך בארות של שורה H.Transfer הפתרון מכל באר של שורה H לתוך באר המתאימה של שורה G עם ערבוב ולהמשיך לדלל באופן סדרתי את תרכובות התרופה עד השורה האחרונה של H לתוך באר המתאימה של שורה G עם ערבוב ולהמשיך לדלל באופן סדרתי את תרכובות התרופה עד השורה האחרונה של H לתוך באר תואמת של שורה G עם ערבוב ולהמשיך לדלל באופן סדרתי את תרכובות התרופה עד השורה האחרונה של הוא הגיע. באמצעות סכמטי כהפניה, לערבב 20 microliters של דילול עמודות נמוך משורות A עד G של צלחת 96 גם ו 20 microliters של דילול עמוד גבוה בארות B דרך H של צלחת 96 גם לצלחת 384 באר יושב בעבר. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך מינימום של 16 שעות.

16 עד 24 שעות לאחר decant גירוי מדיום התא מנוכה ולהוסיף 20 microliters של reagent זוהר לכל באר במשך חמש עד 20 דקות דגירה לפני קריאת הצלחות על מונה זוהר צלחת מיקרו עם זמן אינטגרציה של שנייה אחת ל הבאר. בניסוי מייצג זה, מתוך 168 GPCRs שנחקרו בהקרנה העיקרית, רק קולטן דופמין D3 ואופסין 5 היו מתמודדים כיתרים פעילים פוטנציאליים. קולטן דופמין D3 הפיק שינוי משמעותי קיפול log2 של 4.7 ואילו opsin 5 הפיק תגובה מעט נמוכה יותר של 2.39.

לשם השוואה, קולטן דופמין D2, השליטה החיובית עבור המסך הראשי הפיק שינוי קיפול log2 של 4.58. עקומות תגובה אלה מן ההקרנה המשנית הראו כי תמצית גרנול כרומטין לייצר חלונות אות דומים בערכי ריכוז יעילים חצי מקסימלית כדי quinpirole המאשר את תוקפו כמו להיט פעיל קולטן דופמין D3. עקומת מינון שטוח דומה לשליטה השלילית הופק עבור opsin 5 עם זאת שולל קולטן זה כמטרה אפשרית עבור תמצית גרנול כרומטין. Presto-טנגו דורש טיפול מיוחד כמו variabilities בהפצת תאים, יעילות transfection ודילול תרופות סדרתי יכול לגרום לשגיאה מורכבת, אשר יכול להשפיע על הדיוק של הנתונים.

שיטות אורתוגונליות כגון גישות מחייבות רדיוליגנד, העברת אנרגיה תהודה Bioluminescence ו סידן AMP מחזורי בדיקות תפקודיות הפנמה ניתן להשתמש כדי לאשר עוד יותר לאפיין אינטראקציות קולטן ligand.