Name: משלוח mRNA שונה במודל לעכבר אוטם שריר הלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: למד שיטת העברת גנים באמצעות mRNA שונה ללב עכברים לאחר אוטם שריר הלב. הפרוטוקול מספק גישה סטנדרטית להזרקה ישירה ללב ומאפשר ביטוי זמני של גנים במודלים שונים של פגיעה לבבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מכירים אן אנו קונאן על עזרתה בכתב יד זה. עבודה זו ממומנת על ידי מענק הסטארט-up קרדיולוגיה הוענק המעבדה Zangi וגם על ידי NIH מענק R01 HL142768-01

כל הליכי החיות המתוארים כאן אושרו על ידי בית הספר לרפואה ע י Icahn בראש הועדה המוסדית של הר סיני.
1. סינתזה של modRNA
הערה: הפרטים של סינתזה של modRNA ניתן למצוא ב-Kondrat ואח '13.
<ol><li>הזמן את תבניות הפלביניים (טבלת חומרים) וצור מוצר PCR נקי שישמש כתבנית mrna.</li>
	<li>להכין את modRNAs על ידי שעתוק בתוך מבחנה עם תערובת ribonucleoside מותאם אישית של הבאים (טבלת חומרים): T7 kit, 6 מ"מ אנטי הפוכה כובע אנלוגי (מארקה) 30-O-Me-m7G (50) ppp (50) G, 75 mm guanosine triphosphate, 75 mm אדנוזין triphosphate, 75 mm cytidine triphosphate, 100 הפסבדו מ"מ-5-triphosphate, ו האנזים T7 DNase.</li>
	<li>לטהר את modRNA עשה בשלב 1.2 עם ערכת ניקוי שעתוק (לוח חומרים) ולטפל עם פוספספטאז האנטארקטי. בשלב הבא, הסלידה מmodrna עם ערכת ניקוי התעתיק ומכמת אותו באמצעות ספקטרוסקופיה.</li>
	<li>מזרז את modRNA עם אתנול ו אמוניום אצטט ו להשעות מחדש ב-10 mM טריס-HCl ו 1 מ"מ EDTA.</li>
	<li>לרכז את modRNA עבור במסירה vivo ידי מסננים צנטריפוגליים ולמדוד את האיכות באמצעות פלטפורמת אלקטרופורזה אוטומטית (טבלת חומרים).</li>
</ol>2. הכנת הזרקת modRNA למסירה vivo
<ol><li>לחשב את הנפח הדרוש עבור 100 μg של לוציפראז (לוק)/הזרקה modRNA הזרקת מבוסס על הריכוז modRNA.</li>
	<li>מערבבים את הנפח המחושב של modrna עם חלקים שווים של הפתרון סוכרוז הכין ב נוקלאז מים ללא תשלום (0.3 g/mL) ו 0.1 הפתרון של ציטראט (pH = 7) (20 μl כל מומלץ).</li>
	<li>הביאו את הכרך הסופי של הזריקה ל-60 μL על-ידי הוספת תמיסת מלח.</li>
</ol>3. ניתוח אוטם שריר הלב
<ol><li>הרדמה והכנת החיה הערה: מחקר זה משתמש בעכבר CFW זכר ונקבה 8 עד 12 שבועות.<ol>
<li>שבור את העכבר עם 2% isofלוריאן באמצעות חדר אינדוקציה ומניחים את החיה על גבו בתנוחה גב עם מסכה על האף והפה כדי לשמור על ההרדמה. שמרו על ההרדמה באמצעות אוורור מכני תוך שימוש במכונת ההנשמה המצוידת בצינור אווירי 7-8 מ"מ ומסנן.</li>
		<li>, לשתק את העכבר בפלטפורמת הניתוח. לאבטח את איבריו בנייר כירורגי גלח את אזור הצוואר ואת הצד השמאלי של הצלעות ולחטא באמצעות 70% אתנול ו povidone יוד. חזור על שלב החיטוי פעמיים. בדוק את הרפלקסים שלה, צובט את הזנב ואת הרגליים האחוריות כדי להעריך את עומק ההרדמה.</li>
		<li>ברציפות לפקח ולתחזק את טמפרטורת הגוף הליבה בנוראממיה (37.5-38 ° c).</li>
		<li>לשמור על דרכי הנשימה פתוח על ידי ביצוע צנרור intratracheal. כדי לעשות זאת, מניחים את העכבר בתנוחה מגיית עם הפה מול הניסויים ומושכים את הלשון בעדינות. התאימו את זווית הצוואר וישרו את נתיב הצנרור ודחפו את צינורית הצנרור.</li>
		<li>במידה והחיה אינה מסוגלת לנשום דרכו, ניתן לבצע שעומת קנה. בצע חתך צוואר הרחם לאורך קו האמצע בידוד העור, שריר, רקמה לחלוקה לרמות את קנה הנשימה באמצעות מיקרוסקופ. כאשר קנה הנשימה נראה בבירור, להכניס את צינור האנדוקנה לתוך הרקמה בין שתי טבעות מחסנית מתחת glottis על ידי עשיית חור קטן מחזיק את החלק הגולגולתית של קנה הנשימה באמצעות מלקחיים יקרוכירורגית.</li>
		<li>שימו לב לתנועת החזה של העכבר כדי לוודא ששתי הריאות מקבלות חמצן. שיעור הנשימה (RR) צריך להיות כ-120 נשימות לדקה, עם לחץ inspiratory של 17 עד 18 ס"מ H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הארכה שמאלית קדמית (LAD)<ol>
<li>כדי לבצע את הפנייה לחור, סובב את העכבר בזהירות, כך שהוא שוכב על צידו הימני. הרם את העור ובצע את הניקור השמאלי בין הצלע השלישית לצלעות הארבע ונתח את הרקמה ואת השריר בזהירות. . השתמש בבית-גידול כדי למנוע דימום</li>
		<li>פתח את החזה בזהירות וברגע שהוא פתוח, מצא את הלב, בלי לגעת בריאה עם כל חפץ חד. מניחים את הטרקטורים לתוך החתך כדי לשמור על חלל החזה פתוח יש לראות ברור של הלב. עכשיו להעביר את הריאות לקצה החתך ולהסיר את החלק של שק קרום הלב המכסה את הלב כדי לגשת אל פני השטח הקדמי של הלב.</li>
		<li>בזהירות לזהות את LAD, אשר ניתן לראות ככלי אדום אור עמוק הממוקם בין עורק הריאות לבין האוריקל השמאלי. ליגייט הצעיר עם תפר אחד של תפר משי 7-0 מניחים צינורית חזה (28 גרם, קטטר וונאל), בין הצלע הרביעית לבין ה-5.</li>
		<li>לסגור את החתך בחזה בשכבות. השתמש משי 6-0 פועל תפרים להתאים את הצלעות ולהשתמש 5-0 משי פועל תפרים לסגור את העור. הקפידו להשאיר חלון מתאים למדידת מדידת האקו-קרדיוגרפית העתידית.</li>
		<li>בזהירות לנקז את בית החזה עם פתרון איזוטוניק חם (9 גרם של נתרן כלוריד 1 L של מים) באמצעות מזרק 2 mL. הניחו את העכבר על גבו. אם ביצוע מימוש בקנה הנשימה, השתמש בצינור האנדוקנה ובעזרת הכלי להתאמת מחסנית הקנה עם תפר של 7-0 באחת. מניחים את מסיכת הפנים על העכבר ולסגור את העור באמצעות 5-0 משי פועל תפרים.</li>
		<li>לשלב ההתאוששות, לנתק את צינורית הצנרור ממכונת ההנשמה ולאפשר נשימה ספונטנית. מניחים את החיה תחת מנורת חום עד שהיא משיגה את התודעה. אל תשאירו את בעל החיים ללא השגחה לאחר הניתוח עד שהוא ער לחלוטין.</li>
		<li>ניהול טיפול בכאב עם buprenophine ב 0.1 מ"ג/ק"ג משקל הגוף, מוזרק תת-עורי עבור 3 הימים הבאים במרווחי זמן של 12 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. משלוח לב של modRNA
<ol><li>לספק סכום כולל של 60 μL של modRNA מוכן בשלב 2.3 הפנימי (IM) באמצעות מזרק אינסולין (31 G) בעקבות MI.<ol>
<li>הכנס 20 μL של modRNA בשלושה אתרים שונים של שריר הלב המקיפים את אזור סיכונים (שניים בכל צד של הארכה ואחד בקודקוד). בצע את הזריקות מיד לאחר LAD, לפני סגירת החזה. הערה: תמונות מייצגות של אתרי הזרקת modRNA ניתן לראות באיור 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. אימות ביטוי החלבון בתוך הלב לכתוב MI
<ol><li>ביטוי לוציפראאז מודרנה באמצעות מערכת דימות ביולומינסנציה הערה: סך של 100 μg של לוק mRNA הכין ב 60 μL של המאגר הציטראט של סוכות מוזרק ישירות ללב של עכברים CFW לאחר MI.<ol>
<li>ב 24 h לאחר הזרקת MI ו modrna, מורדם העכברים עם 2% isofלוריאן באמצעות חדר אינדוקציה ו intraperitoneally הזריק לוספרין (150 מ"ג/g משקל גוף) כדי לאמת את האות לוק ב vivo.</li>
		<li>התמונה עכברים באמצעות מערכת הדמיה biלומינסנציה כל 2 דקות עד האות לוק מגיע לרוויה.</li>
		<li>לכמת את נתוני ההדמיה שנאספו עם תוכנת ניתוח הדמיה. השתמש עכברים מוזרק עם מלוחים רק כקריאה בסיסית עבור לוק ביטוי להפחית את אות הרקע שנאסף מתוך עכברים מוזרק מלוחים. הערה: האות לוק מתבטא ב-p/s/cm2/sr x 106.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כתמים לאימות מעגל היצור<ol>
<li>כדי לאמת את הקשר עם היצור, להקריב את החיות 24 שלאחר ההזרקה באמצעות הזרקת הצפק של 100 mg/ק"ג ו 10 מ"ג/ק"ג xylazine ואחריו פריקה צוואר הרחם. לפני ביצוע חתך, לחטא את החזה ואת הבטן באמצעות 70% מספוגית אלכוהול.</li>
		<li>פתח את חלל בית החזה על ידי ביצוע חתך רוחבי ~ 1 ס מ נמוך יותר עצם החזה ולהעביר את המספריים לכיוון הראש, חיתוך דרך כלוב הצלעות.</li>
		<li>פתח את החזה ולהזריק 1 מ ל של ה-PBS סטרילי בחדר הימני הנכון כדי להסיר דם עודף. בלו את הלב מיד והניחו אותו בערוץ ה-PBS הסטרילי כדי לשטוף את הדם שנותר.</li>
		<li>לתקן את הלב ב 4% פאראפורמלדהיד (בארה ב) עבור 24 שעות, ואחריו דגירה לילה ב 30% הפתרון סוכרוז ב 4 ° c. ביום למחרת להטביע את ליבם של טמפרטורה החיתוך האופטימלי בינונית ולחלק אותם בעובי של 10 יקרומטר באמצעות קריוסטט.</li>
		<li>כתם את הסעיפים עם הנוגדן העיקרי נגד המוני האני (cTNI) ולתייג אותם עם נוגדן משני פלורסנט. כדי לזהות את הגרעין, כתם עם 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) עבור 5 דקות. תמונה השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. אנליזה סטטיסטית
<ol><li>מתווה גרף עמודות המבוסס על הביטוי לוק בתוך מלוחים ועכברים מוזרק לוק ומדווח על הערכים כממוצע ± SEM. השוואת שתי הקבוצות באמצעות מבחן t שאינו משויך (* * * * p < 0.0001).</li>
</ol>

<ol><li>Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+response+to+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The innate immune response to adenovirus vectors.</a> Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).</li>
<li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li>
<li>Calcedo, R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+Immune+Response+to+AAV%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humoral Immune Response to AAV.</a> Frontiers in Immunology. 4, 341(2013).</li>
<li>Diebold, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+agonists+for+Toll-like+receptor+7+are+defined+by+the+presence+of+uridine+ribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides.</a> European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).</li>
<li>Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Based+Protein+Replacement+Therapy+for+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li>
<li>Hadas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Modified+mRNA+In+Vitro+Synthesis+Protocol+for+Heart+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy.</a> Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Cardiac+Delivery+of+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).</li>
<li>Zangi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Carlsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+VEGF-A+mRNA+Improves+Cardiac+Function+after+Intracardiac+Injection+1+Week+Post-myocardial+Infarction+in+Swine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine.</a> Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).</li>
<li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chemically+modified+mRNA-based+delivery+of+cytoprotective+factor+promotes+early+cardiomyocyte+survival+post-acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).</li>
<li>Magadum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+a+Single+N-Glycosylation+Site+in+Human+FSTL+1+Induces+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Cardiac+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).</li>
<li>Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Modified+mRNA+for+Myocardial+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).</li>
<li>Gan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+delivery+of+modified+mRNA+encoding+VEGF-A+in+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes.</a> Nature Communication. 10 (1), 871(2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

טיפול גנטי הראה פוטנציאל עצום כדי לקדם באופן משמעותי את הטיפול במחלת לב. עם זאת, כלים מסורתיים המועסקים ניסויים קליניים הראשונית לטיפול ב-HF הראו הצלחה מוגבלת משויכים תופעות לוואי חמורות. RNA שונה מציג משלוח גנטי לא נגיפי כי הוא צובר פופולריות ברציפות ככלי העברת גנים בלב. ModRNA לא דורש לוקליזציה גרעינית של גנים לתרגום, ובכך מציע ביטוי יעיל ומהיר של החלבון. עוד, כמו mRNA אינו משתלב לתוך מארח הגנום, משלוח גנטי ידי modRNA מדלג על הסיכון של מוטזיס. כתוצאה מכך, בשל יתרונותיה של כלי רכב משלוח גנים קונבנציונליים, modRNA הפך לא...

טיפול גנטי הוא כלי רב עוצמה מעורבים המסירה של חומצות גרעין לטיפול, ריפוי, או מניעה של מחלות אנושיות. למרות ההתקדמות בגישות אבחון וטיפולי למחלת לב, יש הצלחה מוגבלת בהעברת גנים אוטם שריר הלב (MI) ואי ספיקת לב (HF). פשוט כמו תהליך של ריפוי גנטי נראה, היא גישה מורכבת במידה ניכרת בהתחשב גורמים רבים שצריכים להיות ממוטבים לפני שימוש ברכב משלוח מסוים. וקטור משלוח נכון צריך להיות לא חיסוני, יעיל, ויציב בתוך גוף האדם. המאמצים בתחום זה יצרו שני סוגים של מערכות משלוח: נגיפי או לא ויראלי. בשימוש נרחב מערכות ויראליות, כולל העברה גנטית על ידי אדנווירוס, רטרווירוס, הנגיף, או וירוס הקשורים adeno, הראו קיבולת התמרה יוצאת דופן. עם זאת, השימוש שלהם במרפאות מוגבל בשל התגובה החיסונית חזקה הנגרמת1, הסיכון של tumorigenesis2, או הנוכחות של נוגדנים לנטרל3, כולם נשארים מכשול גדול ליישום רחב ואפקטיבי של וקטורים ויראליות בטיפול גנטי האדם. מצד שני, למרות דפוס הביטוי המרשים שלהם, המסירה של ה-DNA העירום מציג יעילות הזיהום הנמוך, בעוד mRNA העברה מציג חיסוני גבוה ורגישות השפלה על ידי RNase4.
עם מחקר נרחב בתחום של mRNA, modRNA הפך לכלי אטרקטיבי עבור העברת גנים ללב ואיברים אחרים שונים בשל יתרונותיה הרבים על פני וקטורים מסורתיים5. החלפת השלמה של uridine עם התוצאות הטבעיות המתרחשות באופן טבעי ביטוי חלבונים חזקים יותר וארעי, עם אינדוקציה מינימלית של התגובה החיסונית מולדת הסיכון של אינטגרציה גנומית6. פרוטוקולים שהוקמו לאחרונה להשתמש כמות ממוטבת של אנטי הפוכה כובע אנלוגי (מארקה) כי עוד מגביר את תרגום החלבון על ידי הגברת היציבות והיכולת הטרנססינתטית של mRNA הסינתטי7.
דיווחים קודמים הראו את הביטוי של כתבת שונים או גנים פונקציונליים שנמסרו על ידי modRNA ב שריר הלב מכרסם לאחר MI. עם יישומים modrna, אזורים משמעותיים של שריר הלב, כולל הקרדיוציטים וללא קרדיוציטים, היתה בהצלחה לאחר הפגיעה הפוסט-קרדיולוגית8 כדי לגרום לאנגיוגנזה9,10, הישרדות תא הלב11, ו התפשטות קרדיומוציט12. מנהל יחיד של modRNA מקודד עבור האדם מוטציה follistatin כמו 1 גורם התפשטות של העכבר CMs למבוגרים ומגדילה באופן משמעותי את תפקוד הלב, מקטין את גודל הצלקת, ומגביר את צפיפות נימי 4 שבועות post-MI12. מחקר שנערך לאחרונה דיווח על תפקוד לב משופר לאחר MI עם יישום של וודרנה modRNA במודל חזיר10.
כך, עם הפופולריות הגוברת של modRNA בשדה הלב, זה חיוני לפתח ולייעל פרוטוקול למשלוח של modRNA ללב post-MI. בזאת הוא פרוטוקול המתאר את ההכנה והמסירה של מודנה מטוהרים ואופטימיזציה בניסוח ביולוגי מלוחים ציטראט המספק חזק, ביטוי חלבון יציב מבלי לעורר תגובה חיסונית. השיטה המוצגת בפרוטוקול זה וידאו מדגים את ההליך הכירורגי הרגיל של העכבר MI על ידי הארכה לצמיתות של העורק הקדמי שמאל בירידה (LAD), ואחריו שלושה זריקות האתר תאיים של modRNA. המטרה של הנייר הזה היא להגדיר בבירור שיטה מדויקת מאוד מדויק של משלוח modRNA כדי שריר הלב murine כדי להפוך יישום modRNA נגיש באופן נרחב לטיפול גנטי לב.

<table><tbody><tr><td>אדנוזין טריפוספט</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>כלול בערכת Megascript</td></tr><tr><td>אנטארקטיקה פוספטאז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>אנלוגי נגד כובע הפוך, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>N-7003</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיה Bioluminescense</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>IVIS100 מערכת הדמיה של מכשיר מצמד מטען</td></tr><tr><td>מחזירים קהים</td><td>FST</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>טרופנין לב I</td><td>Abcam</td><td>47003</td><td></td></tr><tr><td>Cytidine triphosphate</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>כלול בערכת Megascript</td></tr><tr><td>מערכת הרדמה כפולה</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>75-2001</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים- Adson</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים- Dumont #7</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>גואנוזין טריפוספט</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>כלול בערכת Megascript</td></tr><tr><td>ערכת תמלול במבחנה</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>5X MEGAscript T7 ערכת</td></tr><tr><td>אינטובציה צינורית</td><td>הרווארד מכשיר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaclear ערכת</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאוורר עכבר</td><td>מכשיר הרווארד מכשיר</td><td>73-4279</td><td></td></tr><tr><td>N1-methylpseudouridine-5-triphosphate</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>N-1081</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר NanoDrop</td> תרמו <td>סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט אולסן הגר עם מספריים תפרים</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>תבניות פלסמיד</td><td>GeneArt, Thermo Fisher מספריים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מחודדים</td><td>FST</td><td>14200-12</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תפרים</td><td>Ethicon</td><td>Y433H</td><td>5.00</td></tr><tr><td>תפרים</td><td>Ethicon</td><td>Y432H</td><td>6.00</td></tr><tr><td>תפרים</td><td>Ethicon</td><td>7733G</td><td>7.00</td></tr><tr><td>T7 DNase אנזים</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>כלול בערכת Megascript</td></tr><tr><td>תחנת</td> <td>קלטתAligent</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ניקוי תמלול</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908</td><td>Megaclear</td></tr><tr><td>Ultra-4 מסננים צנטריפוגליים 10k</td><td>Amicon</td><td>UFC801096</td><td></td></tr></tbody></table>

משלוח mrna שונה במודל לעכבר אוטם שריר הלב

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

אוטם שריר הלב (MI) הוא גורם מוביל לתחלואה ותמותה בעולם המערבי. בעשור האחרון, טיפול גנטי הפך לאפשרות טיפול מבטיח עבור מחלות לב, בשל היעילות שלה השפעות טיפוליות יוצאת דופן. במאמץ לתקן את הרקמה הפגומה post-MI, מחקרים שונים המועסקים DNA מבוססי או נגיפי טיפול גנטי אבל יש התמודד מכשולים ניכרים בשל הביטוי המסכן ובלתי מבוקרת של הגנים הנמסרים, בצקת, הפרעת קצב, והיפרפרס לב. שונה סינתטי mRNA (modRNA) מציג גישה גנטית הרומן טיפול המציעה גבוהה, ארעי, בטוח, לא חיסוני, מסירה mRNA מבוקרת לרקמת הלב ללא כל סיכון של אינטגרציה גנומית. בשל המאפיינים המדהימים הללו בשילוב עם הפרמקוקינטיקה בצורת פעמון בלב, הפכה modRNA לגישה אטרקטיבית לטיפול במחלת לב. עם זאת, כדי להגביר את יעילותו ב vivo, שיטת מסירה עקבית ואמינה צריך להיות אחריו. מכאן, כדי למקסם את יעילות מסירה modRNA ועקביות תשואה בשימוש modRNA עבור יישומים vivo, שיטה ממוטבת של הכנה ומסירה של הזרקת modRNA בתוך מודל MI העכבר מוצג. פרוטוקול זה יהפוך את מסירת modRNA לנגישה יותר עבור מחקר בסיסי וטרנסלייתי.

שמונה עד עשרה עכברים בני שבוע. הורדם עם איזולבנה וצינורות לאחר שהחיה הייתה תחת הרדמה, אזור החזה השמאלי היה מגולח ומעוקר באתנול, והלב נחשף לקשר בחור. עורק העורקים השמאלי הושאר בחוזקה על ידי שיסוף התפר מתחת לעורק הראשי (ייצוג התרשים באיור 1A). לאחר אוטם מוצלח (המצוין על-ידי paling של הקיר השמאלי חדרית חינם), הזרקה ישירה של 100 μg של לוק או המוני modRNA מומס סוכרוז ציטראט נמסר ישירות לתוך שריר הלב בשלושה אתרים שונים (איור 1B) המקיפים את אזור הפציעה באמצעות מזרק אינ...

פרוטוקול זה מציג דרך פשוטה וקוהרנטית לupregulate גן של עניין באמצעות modRNA לאחר אוטם שריר הלב בעכברים.

משלוח mRNA שונה במודל לעכבר אוטם שריר הלב

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

RNA שונה היא שיטה חדשנית להעברת גנים ללב, ואיברים אחרים. פרוטוקול זה יספק גישה מדויקת של אספקת הגנים הרצויים באופן ארעי ללב, לאחר אוטם שריר הלב. שיטה זו אינה מוגבלת לאוטם שריר הלב, אך ניתן להחילה גם על כתוצאה מכך, ומודלים של התכווצות אבי הרוח הרוחב.RNA שונה נמצא בשימוש במספר ניסויים קליניים בבני אדם. עם זאת, אין פרוטוקול מתוקן לגן המועבר ללב בשיטה זו. הדגמה חזותית תאפשר לחוקרים להזריק כראוי RNA שונה באתרים המתאימים בלב.הפגנת הפרוצדורה תהיה אג'יט מגדום, פוסט דוקטורנט, ואלנה צ'פורקו מפקחת על בעלי חיים מהמעבדה שלנו. בהתבסס על הריכוז של modRNA שהוכן בעבר ב modRNA, לחשב את נפח modRNA הדרושים להזרקת 100 מיקרוגרם. עושה כמויות שוות של פתרונות סוכרוז וציטראט.לאחר מכן הוסיפו את הנפח המחושב של modRNA, ומספיק תמיסת מלח כדי להביא את נפח ההזרקה ל-60 מיקרוליטרים. לאחר הרדמה של החיה, מניחים אותה בצד הגחון כלפי מעלה, עם פיו פונה לכיוון הניסוי. לאחר מכן, כדי לשמור על דרכי הנשימה הפתוחות על ידי ביצוע צנרור תוך-מאמץ, משוך בעדינות את הלשון.כוונן את זווית הצוואר כדי ליישר את נתיב הצנרור, ולדחוף את cannula הצנרור. שימו לב לתנועת בית החזה של העכבר כדי לוודא ששתי הריאות מקבלות חמצן. קצב הנשימה צריך להיות כ 120 נשימות לדקה.כדי להתחיל את הרצועה LAD, להפוך את העכבר בזהירות על הצד הימני שלה. להרים את העור, ולב

delivery-of-modified-mrna-in-a-myocardial-infarction-mouse-model

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

מניפולציות גנטיות רבות ו / או זריקות intramyocardial של גנים, חלבונים, תאים, ו / או biomaterials באים על גבי מימד הזמן במחקרים של פגיעה איסכמיה / reperfusion חריפה שיפוץ כרונית בעכברים. וידאו זה ממחיש את הליכי microsurgical עבור איסכמיה / reperfusion, קשירת עורק כלילי קבע, ומחקרים הזרקת intramyocardial.

קשירת עורקים כלילית לבין הזרקת Intramyocardial ב מודל Murine של אוטם

ההליך הניתוחי המשמש ללגרום לאוטם שריר לב בעכברי ניסוי מתחיל בבית חזה שמאלי בין השלישי ואת צלעות 4 כדי להמחיש את המשטח הקדמי של הלב והריאה שמאלית. העורק הכלל שמאלי גבעול, החזה סגור והעכבר מותר להתאושש באופן ספונטני.

טכניקה שונה לקשירת עורקים הכליליים בעכברים

אנחנו מציגים את שיטה כירורגית כדי לגרום לאיסכמיה / reperfusion הניסיוני (I / R) פציעה כדי לדמות אוטם שריר הלב (MI) בעכברי מודל, המאפשר ליותר בהירות במיצוב של קשירה בעורק השמאלי הקדמי יורד (LAD) כדי להגדיל את שחזור ניסויים MI בעכברים.

דגם של שריר הלב איסכמיה reperfusion הפגיעה Murine באמצעות קשירת של העורק השמאלי קדמי יורד

הזרקת intramyocardial מלעורית מונחה אקו מייצגת שיטה יעילה, אמינה, וניתן למקד עבור המשלוח של סוכני העברת גנים או תאים לתוך הלב העכברי. בעקבות הצעדים המפורטים בפרוטוקול זה, המפעיל יכול להיות מוכשר במהירות בטכניקה תכליתית, פולשנית זו.

הזרקת Transthoracic Intramyocardial אולטרסאונד מונחה בעכברים

מתואר מודל בעל יכולת שחזור גבוהה לאוטם שריר הלב בעכברים עם מניפולציות פולשניות מינימליות. ניתן לבצע את המודל בקלות, וכתוצאה מכך יכולת שחזור ושיעור הישרדות גבוהים. לפיכך, המודל המתואר יפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים כמתבקש על ידי עקרון 3R (החלפה, עידון והפחתה).

נוהל כירורגי זעיר פולשנית של גרימת אוטם שריר הלב בעכברים

כאן אנו מתארים הליך כירורגי המראה כיצד להשיג הארכה קבועה של עורק שמאלי הקדמי כלילית בעכברים. מודל זה הוא בעל רלוונטיות גבוהה לחקור את הפתופסולוגיה של אוטם שריר הלב ואת התהליכים הביולוגיים המקביל.

מודל אוטם שריר הלב באמצעות הארכה קבועה של עורק שמאלי קדמי כלילי יורד

תחת הרדמה מספקת, לב העכבר הוחצן דרך החלל הבין-קוסטלי, ואוטם שריר הלב נגרם בהצלחה על ידי קשירת העורק היורד הקדמי השמאלי (LAD) באמצעות חומרים הזמינים ברוב המעבדות.

שיטה פשוטה שונה להשראת אוטם שריר הלב בעכברים

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה וניתנת לשחזור שיכולה לגרום לאוטם שריר הלב או לפגיעה באיסכמיה של שריר הלב בעכברים על ידי קשירה מדויקת של העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי באמצעות מיקרומניפולציה.

השראת אוטם שריר הלב ופגיעה באיסכמיה של שריר הלב בעכברים

מוצג כאן הליך כירורגי לקשירה קבועה של העורק הכלילי השמאלי בעכברים. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה ואת התגובה הדלקתית הקשורים לאחר אוטם שריר הלב.

קשירת עורקים כליליים שמאליים: מודל מורין כירורגי של אוטם שריר הלב

פרוטוקול זה מתאר את היצירה ואפיון הפנוטיפ של מודל עכבר C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9, על מנת לחקור את תפקידו של CRACD בעיצוב מחדש של הלב (cardiac remodeling) בעקבות אוטם בשריר הלב.

יצירה ואפיון פנוטיפי של מודל עכבר חסר Cracd שהונדס באמצעות CRISPR/Cas9 למחקרי רה-מודלציה לאחר אוטם שריר הלב

למד שיטת העברת גנים באמצעות mRNA שונה ללב עכברים לאחר אוטם שריר הלב. הפרוטוקול מספק גישה סטנדרטית להזרקה ישירה ללב ומאפשר ביטוי זמני של גנים במודלים שונים של פגיעה לבבית.

משלוח mRNA שונה במודל לעכבר אוטם שריר הלב

גלה סרטונים נוספים