זיהוי של המלכודות נויטרופילים מסחטות ב פרפין-מוטבע בעורקים בעורק החתולים באמצעות מיקרוסקופ אימונולומוטורנציה

אנו מתארים את השיטה כדי לזהות השמנות נויטרופילים מסחטות (רשתות) ב פורמלדהיד-קבוע ו פרפין-מוטבע העורקים בעורק העורקי באמצעות החום המושרה אנטיגן ופרוטוקול immunolabeling כפול.

פרוטוקול זה של parafinization ואחריו אחזור אנטיגן של מקטעי aortic מוטבע פרפין יכול להיות כלי שימושי כדי ללמוד את התפקיד של מלכודות תלת תאיות נויטרופילית פקקת חתולים. זיהוי של מלכודות תלת-תאיות נויטרופיליות על ידי שפעת חיסונית ברקמה קבועה ומוטמעת בפרפין, עדיף על סטנטים היסטולוגיים קונבנציונליים כמו HNE, מכיוון שהוא מאפשר זיהוי בו זמני של דנ"א בטוח יותר וחלבונים חוץ-תאיים. פרוטוקול זה יכול לשמש בסוג אחר של טרומבי ובמין וטרינרי אחר.

זיהוי של מלכודות חוץ תאיות נויטרופילים בתוך פקקת עורקים חתוליים להציע כי הם עשויים לשחק תפקיד פקקת בחתולים. הפרוטוקולים המוצגים כאן הם קווים מנחים. אנו ממליצים בחום לחוקרים להתאים את משך התנאים של תהליך אחזור אנטיגן להניב אות משביע רצון.

כדי להשתמש במערכת אוטומטית כדי לבצע deparaffinization ו הידרציה מחדש של החלקים על מגלשות זכוכית, למקם את שקופיות הזכוכית במדפים. להיכנס לחלוטין ב 100 אחוז מלוחים במשך שלוש דקות. חזור על שלב זה פעמיים.

אין לשטוף בין השלבים. שקועים לחלוטין בהפחתת ריכוזי אתנול בטמפרטורת החדר שלוש פעמים במשך שלוש דקות כל אחד. טביעה לחלוטין במים deionized במשך שתי דקות ולחזור על פעם אחת יותר.

לאחר הטיפול ב- TBST, מלאו את המאגר במים שעברו דה-יונון המחוממים ל-100 מעלות צלזיוס. אפשר לתא הקיטור לצייד במשך 20 דקות. על צלחת חום, מחממים את פתרון אחזור האנטיגן הזמין מסחרית המכיל את טריס ו- EDTA ב- pH 9.0 עד 95 עד 97 מעלות צלזיוס.

ודא כי הוא לא רותח. לתסיר את השקופיות לחלוטין בתתור אחזור אנטיגן מחומם ולהמשיך את היישום של חימום חיצוני באמצעות ספינת הקיטור במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם TBST במשך חמש דקות.

כעת, מקם את המקטעים במאגר חסימה 1. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר תחת נדנדה עדינה בין 30 ל 50 סל"ד. ללא שטיפה, יש למרוח מיד 100 מיקרוליטרים של נוגדן histone H3 מרובל ארנבים מדולל, היסטון H3, ישירות על המגלשה.

מניחים תלוש כיסוי על כל קטע כדי לאפשר חלוקה שווה של תערובת הנוגדנים. דגירה במשך 12 עד 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם TBST במשך חמש דקות בכל פעם.

כדי להחיל נוגדן, השתמש בצינור והפץ באופן שווה 100 מיקרוליטרים של נוגדן נגד ארנב עזים גדום לאלקסה פלואור 488. מכסים את השקופיות בנייר כסף ומדרגים את השקופיות במשך שעה בטמפרטורת החדר תחת נדנדה עדינה. לאחר שטיפה עם TBST על פי כתב היד, דגירה את החלקים בחסימת חיץ 2 לילה בארבע מעלות צלזיוס תחת נדנדה עדינה.

הגן מפני האור. לשטוף עם TBST שלוש פעמים במשך חמש דקות בכל פעם. חסום את המקטעים בחסימת חיץ 3 כפי שנעשה בעבר בטמפרטורת החדר במשך שעתיים תחת נדנדה עדינה.

הדגירה את החלקים עם ביוטין נער ארנב תכסיס אנטי אדם נויטרופילים אלסטאז נוגדן בארבע מעלות צלזיוס במשך 12 עד 16 שעות כפי שתואר קודם לכן. לאחר שטיפה עם TBST דגירה את המגלשות עם אלקסה פלואור 594 סטרפטבידין Conjugate במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף עם TBST פעם אחת במשך חמש דקות.

החל 100 microliters של תערובת פתרון מרווה Autofluorescense ישירות על החלקים במשך דקה אחת כפי שהורה על ידי היצרן. מיד לשטוף את השקופיות עם TBST שש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם. לכסות כל שקופית עם 100 microliters של 300 DAPI ננו-מולאר במשך חמש דקות בחושך.

לאחר מכן לשטוף עם TBST חמש פעמים במשך שלוש דקות בכל פעם. החל טיפה של אמצעי הרכבה נגד חיטוי ישירות על מגלשת הזכוכית המקיפה את המקטע. מניחים חלק כיסוי בעדינות על החלק מבלי ליצור בועות.

אפשר לדגימות לרפא בן לילה בחושך בארבע מעלות צלזיוס. כדי לאתר thrombi, לסרוק באופן cranially כדי caudally לאורך אבי העורקים, bifurcation אבי העורקים וכל עורק הירך באמצעות מיקרוסקופיה ניגוד פאזה עם מטרה 10x. תחילה לבחון את הסעיפים עבור DNA ללא תאים באמצעות ערוץ DAPI עם העירור ב 357 ו 44 ננומטר.

זהה אלסטאז נויטרופילים חוץ-תאיים והיסטון H3 עם הדר בת תעלות החלבון הפלואורסצנטיות האדומות והירוקות של טקסס בהתאמה. שמרו על זמן חשיפה עקבי ורווחים של כל ערוץ לאורך כל רכישת התמונות כדי למנוע רוויה בעוצמת הפיקסלים. מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות מזוהות על בסיס לוקליזציה של אלסטאז נויטרופילים, היסטון H3 עם הדרים ודנ"א נטול תאים.

באמצעות המטוקסילין וכתם אאוסין, ומיקרוסקופיה בהירה, טרומבי עורקי חתולי מורכב מתאים אדומים, לויקוציטים, פיברין וטסיות דם. NETs הופיעו כרשתות של חוטים סגולים עמוקים באורכים שונים המקיפים אריתרוציטים ולוקציטים סמוכים. באמצעות פרוטוקול זה, מיקרוסקופיה immunofluorescence גילה אגרגטים גדולים של NETs מורכב DNA ללא תאים, היסטון H3 הירולית חוץ תאית ואלסטאז נויטרופילים.

תחת ניגודיות פאזה במיקרוסקופיה חיסונית, טרומבוס התאפיין כמבנה תיחום היטב בתוך מרחב כלי הדם. עם זאת, טרומבי לא זוהו באף אחת מדגימות הבקרה. נתון זה מדגים שפעת אוטומטית עמוקה של יסודות קריש כמו אריתרוציטים כאשר הם דימוי באורך הגל של 488 ננומטר.

מרווה אוטופלואורסצנטיות קצרה לאחר אימונולאבלום הגבירה באופן משמעותי את הרגישות של לוקליזציה של חלבונים וזיהוי נטו אפילו באזורים עם שפע של אריתרוציטים. משך קיבעון משפיע על האימונואקטיביות של אנטיגנים מסוימים. אנו ממליצים על קיבעון לא יותר מ 24 שעות נקוב התייבשות הטבעה פרפין.

לחלופין, ניתן להשתמש בפרפורמלדהיד ללא מתנול כדי להגביל את החפץ על ידי חומצה פורמית ו קטונים מחמצון של פורמלדהיד. כדי למנוע הפרעות בעת שימוש בנוגדנים ראשוניים שמקורם באותו מין, כללנו צעד חסימה נוסף כדי להרוות את כל אתרי הכריכה הנותרים בנוגדנים המשניים. החוקרים חייבים לכלול בקרות שליליות המורכבות מנוגדני isotype, הדרה של נוגדנים ראשוניים וצעד תיוג חיסוני ובקרות ביולוגיות של חתולים ללא פקקת.

שפעת אוטומטית של מגבלות רקמות של טרומבי יכול פטיש זיהוי מיקרוסקופי של מלכודות נויטרופילים חוץ תאיים. החוקר יכול למזער את הפלואורסצנטיות על ידי שימוש בפליאורופורים אדומים רחוקים. טכניקה זו יכולה להיות כלי רב ערך לחקר מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיים במינים וטרינריים אחרים.

זה יכול לספק הבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה של פקקת.