Name: בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: חקור שיטת כרומטוגרפיה נוזלית-מסתית לניתוח מטבולומי לא ממוקד בגרעיני חיטה. השיטה משלבת מופז נייד שלישי לזיהוי מטבוליטים רחב יותר ולשיפור הבנת התגובות הביוכימיות ללחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר בתוכנית החקלאות ומלגת המזון של מערב אוסטרליה (המחלקה למשרות, תיירות, מדע וחדשנות, ממשלת אוסטרליה המערבית) וברנש של ראש הממשלה, פרופסור סיימון קוק (המרכז ל החקלאות הדיגיטלית, אוניברסיטת קורטין ואוניברסיטת מרדוק). ניסויים שדה ואוסף לדוגמה דגנים תמכו על ידי הממשלה של התוכנית תמלוגים של אוסטרליה מערב האזורים. אנו מכירים בגראנטלי סטיינר ורוברט פרנץ ' בגין תרומתם לניסויי שדה. הביו-טפסים של אוסטרליה. מודה במימון הציוד

<ol><li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+metabolomics%3A+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li>
<li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype%2C+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+%28Triticum+durum+Desf.%29+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li>
<li>Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li>
<li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li>
<li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li>
<li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li>
<li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li>
<li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li>
<li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li>
<li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72(2018).</li>
<li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboAnalyst+4.0%3A+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li>
<li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li>
<li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li>
<li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423(2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן, אנו מציגים שיטת LC-MS מבוסס טבולומיקס שאינה ממוקדת ניתוח של דגן חיטה. השיטה משלבת ארבעה מצבי רכישה (שלב הפוך ושלב הפוך לשומנים עם אינון חיובי ושלילי) לשני מצבים על ידי החדרת שלב נייד שלישי לתוך הדרגתי שלב היפוך. הגישה המשולבת הניבה כ 500 תכונות רלוונטיות ביולוגית לכל קוטביות יון עם כמחצית כאלה שונים באופן משמעותי באינטנסיביות בין זני חיטה. שינויים משמעותיים בריכוז המטמטוליט בדגן של זנים שונים של חיטה מעיד על ביוכימיה שונה, אשר עשוי להיות מקושר להתנגדות למחלות, עמידות במתח ותכונות פנופאיות אחרות החשובות לאיכות הדגנים...

הבנת האינטראקציות בין הגנים, הסביבה ונוהלי הניהול בחקלאות עלולים לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של תפוקת המוצר ואיכותם. מטבוליטים צמחיים מושפעים גורמים כגון הגנום, הסביבה (אקלים, כמות המשקעים וכו '), ובסביבה החקלאות, הדרך יבולים מנוהלים (כלומר, יישום של דשן, קוטלי פטריות וכו '). בניגוד הגנום, מטאבולזה מושפע כל הגורמים האלה ולכן טבולומיקס נתונים מספק טביעת אצבע ביוכימית של אינטראקציות אלה בזמן מסוים. יש בדרך כלל אחת משתי המטרות למחקר מבוסס טבולומיקס: ראשית, כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של ביוכימיה של האורגניזם ולעזור להסביר את מנגנון התגובה הפרטורציה (abiotic או לחץ ביוטי) ביחס הפיזיולוגיה; ושנית, לחבר בסמנים עם הפרטורציה תחת לימוד. בשני המקרים, התוצאה של הידע הזה היא אסטרטגית ניהול מדויקת יותר כדי להשיג את המטרה של גודל תשואה משופרת ואיכות.
הצמח בתוך המפעל צפוי להכיל אלפי1 של מולקולות קטנות עם תכונות פיסיוכימיקלים מגוונים. כיום, אין פלטפורמות טבולומיקס (בעיקר ספקטרומטר מסה וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית) יכולים ללכוד את המטה כולו בניתוח אחד. פיתוח טכניקות כאלה (הכנה לדוגמה, הפקת מטבוליזם וניתוח), אשר מספקים כיסוי גדול של מטאמיטין ככל האפשר בתוך הפעלה אנליטית אחת, היא מטרה מרכזית עבור חוקרים טבולומיקס. ניתוח טבולומיקס הקודם לא ממוקד של דגנים חיטה יש נתונים משולבים הפרדות כרומטוגרפיות מרובות ומכשור הרכישה ו/או מיכשור עבור כיסוי מטאמיאלי גדול יותר. עם זאת, יש צורך בדוגמאות שניתן להכין ולרכוש בנפרד עבור כל מודאליות. לדוגמה, Beleggia ואח '2 הכין דוגמה ללעג עבור ניתוח GC-ms של אנליטים קוטביים בנוסף לניתוח GC-ms של האנליטים הלא קוטבי. Das et al.3 בשימוש הן GC-ו-LC-MS שיטות כדי לשפר את הכיסוי בניתוח שלהם; עם זאת, גישה זו דורשת בדרך כלל הכנות לדוגמה נפרדת כמתואר לעיל וכן שתי פלטפורמות אנליטיות עצמאיות. ניתוחים קודמים של דגנים חיטה באמצעות GC-ms2,3,4 ו-LC-ms3,5 פלטפורמות הניבו 50 כדי 412 (55 זיהה) תכונות עבור gc-ms, 409 עבור משולב gc-ms ו-LC-ms וכמה אלפי עבור ניתוח LC-ms lipidomics5. על-ידי שילוב לפחות שני מצבים לניתוח אחד, ניתן לשמור על הכיסוי המוארך באופן מתקדם, ולהגדיל את עושרה של פרשנות ביולוגית תוך הנחה גם חיסכון בזמן ובעלות.
כדי לאפשר את ההפרדה היעילה של מגוון רחב של מינים שומנים בדם על ידי כרומטוגרפיה בשלב הפוך, lipidomics המודרנית מתודולוגיות בדרך כלל להשתמש בחלק גבוה של איזופנול ממיסים6, מתן שיעורי השומנים לכיתות שעשויות להיות לא פתורות על ידי הכרומטוגרפיה. עבור הפרדה יעילה השומנים, השלב ההתחלתי הנייד הוא גם הרבה יותר גבוה בהרכב אורגני7 מאשר שיטות היפוך אופייני כרומטוגרפי שלב, אשר לשקול מחלקות אחרות של מולקולות. ההרכב האורגני הגבוה בתחילת מעבר הצבע הופך את השיטות הללו למתאימות פחות למחלקות רבות אחרות של מולקולות. בעיקר, בשלב הפוך כרומטוגרפיה נוזלי מעסיקה מעבר מומס בינארי, החל בהרכב מימית בעיקר והגדלת תוכן אורגני כמו חוזק הכרומטוקציה של הכרומטוגרפיה גדל. לשם כך, ביקשו לשלב את שתי הגישות כדי להשיג הפרדה של שיעורי השומנים וגם לא ליפיד של מטבוליטים בתוך ניתוח אחד.
כאן, אנו מציגים שיטת כרומטוגרפית המשתמשת בשלב הנייד השלישי ומאפשרת שלב היפוך מסורתי משולב וlipidomics-שיטת כרומטוגרפיה מתאימה באמצעות הכנה לדוגמה אחת וטור אנליטי אחד. אימצנו רבות מאמצעי בקרת איכות ושלבי סינון נתונים שיושמו בעבר במחקרים טבולומיקס קליניים בעיקר. גישות אלה שימושיות בקביעת תכונות איתנות עם שימוש ביכולות טכניות גבוהות ורלוונטיות ביולוגית וכוללת את אלה שאינם עומדים בקריטריונים אלה. לדוגמה, אנו מתארים ניתוח חוזר של מדגם qc במאגר8, תיקון QC9, סינון נתונים9,10 והשלכה של תכונות חסרות11.

<table><tbody><tr><td>13C6-סורביטול</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>605514</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoanthracene</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>A38800-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA955-4</td><td>Optima LC-MS כיתה</td></tr><tr><td>פורמט אמוניום</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>516961-100 mL</td><td>>99.995%</td></tr><tr><td>אנליסט TF</td><td>Sciex</td><td></td><td>גרסה 1.7</td></tr><tr><td>תוכנת AnalyzerPro</td><td>ספקטרל וורקס בע"מ</td><td></td><td>תוכנת עיבוד נתונים המשמשת לשלב 7.2. גרסה 5.7</td></tr><tr><td>AnalyzerPro XD sortware</td><td>SpectralWorks Ltd.</td><td></td><td>תוכנת עיבוד נתונים המשמשת לשלב 7.5. גרסה 1.4</td></tr><tr><td>איזון</td><td>Sartorius. דיוק באלאנס בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>d6-חומצה טרנסקינמית</td><td>Isotec</td><td>513962-250 מ"ג</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td><td>A2471-500 מ"ל</td><td></td></tr> <tr><td>מייבש הקפאה 99% (Freezone 2.5 Plus)</td><td>בקבוקי Labconco</td><td>7670031</td><td></td></tr><tr><td>Glass Schott (100 מ"ל, 500 מ"ל, 1 ליטר)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית (2 מ"ל) ומכסי מכסה בורג (חריץ מראש)</td><td>Velocity Scientific Solutions</td><td>VSS-913 (בקבוקונים), VSS-SC91191 (מכסים)</td><td></td></tr><tr><td>ערכת התקנה עבור Sciex TripleToF</td><td>Sciex</td><td>p/n 4456736</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA464-4</td><td>Optima LC-MS כיתה</td></tr><tr><td>מעבדה בלנדר</td><td>Waring דגם מסחרי</td><td></td><td>HGBTWTS3</td></tr><tr><td>לאוצין-אנקפלין</td><td>ווטרס</td><td>p/n 700008842</td><td>כוונון</td></tr><tr><td>פתרון Metaboanalyst</td><td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/ MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td><td></td><td>צינור אנליטי מבוסס אינטרנט עבור מטבולומיקה בתפוקה גבוהה. כלי חינמי מבוסס אינטרנט. גרסה 4.0.</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA456-4</td><td>Optima LC-MS</td></tr><tr><td>Miconazole</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>M3512-1 g</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה (Eppendorf 5415R)</td> <td>Eppendorf (מופץ על ידי Crown Scientific Pty. Ltd.)</td><td></td><td>5426 מס' 0021716</td></tr><tr><td>שפופרות מיקרוצנטריפוגה (2 מ"ל)</td><td>SSIbio</td><td>1310-S0</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td> תוכנת <td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peak View</td><td>Sciex</td><td></td><td>גרסה 1.2 (64 סיביות)</td></tr><tr><td>קצות פיפטה (200 uL, 100 uL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות (200 uL, 1000 uL)</td><td>צינורות צנטריפוגה מפלסטיק ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(15 מ"ל)</td><td></td>תוכנת ניתוח גילוי מולקולות <td>ThermoFisher Scientific</td> NUN339650 <td></td></tr><tr><td>Progenesis QI</td><td>Nonlinear Dynamics</td><td></td><td>Samll. גרסה 2.3 (64 סיביות)</td></tr><tr><td>Sciex 5600 ספקטרומטר מסה משולש ToF</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות ליזה עם מכסה בורג (2 מ"ל) עם חרוזי קרמיקה</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium formate</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>456020-25 גרם</td><td></td></tr><tr><td>ליזזר/הומוגניזר רקמות</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td>0001620 סדרתי</td></tr><tr><td>צלוחיות נפח (10 מ"ל, 50 מ"ל, 100 מ"ל, 200 מ"ל, 1 ליטר)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>IKA Works Inc. (מופץ על ידי Crown Scientific Pty. Ltd.)</td><td></td><td>001722</td></tr><tr><td>Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBW6-4</td><td>Optima LC-MS כיתה</td></tr><tr><td>מערכת Acquity LC של מים מצוידת במשאבות רבעוניות</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 עמודה</td><td>Waters</td><td>p/n 186005614</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

הבנת האינטראקציות בין הגנים, הסביבה והניהול בפרקטיקה החקלאית עלולה לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של תפוקת המוצר ואיכותם. הנתונים הטבולומיקס מספקים הקראה מתוך האינטראקציות הללו ברגע נתון והיא אינפורמטיבית של הסטטוס הביוכימי של האורגניזם. עוד, מטבוליטים בודדים או פאנלים של מטבוליטים ניתן להשתמש כמו סמנים מדויקים עבור תשואה וחיזוי איכות וניהול. הצמח מטביו צפוי להכיל אלפי מולקולות קטנות עם תכונות פיזיקליות מגוונות המספקים הזדמנות התובנה הביוכימי לתוך תכונות פיסיולוגיים גילוי ביואריקר. כדי לנצל את זה, מטרת המפתח עבור החוקרים טבולומיקס היא ללכוד כמה שיותר מגוון פיזיקליים ככל האפשר בתוך ניתוח אחד. כאן אנו מציגים שיטה טבולומיקס מבוססת על בסיס כרומטוגרפיה, מבוסס על מטרה בלתי ממוקדת לניתוח דגן חיטה מצמח. השיטה משתמשת במנהל הממס של הנוזל chromatograph הנוזלי כדי להציג שלב נייד שלישי ומשלבת מעבר מסורתי שלב היפוך עם מעבר שומנים בהדרגה. הכנת תבואה, הפקת מטבוליזם, ניתוח אינסטרומנטלי וזרימות עבודה של עיבוד נתונים מתוארות בפרוטרוט. דיוק המוני והאותות הטובים נצפו והשיטה הניבה כ-500 תכונות רלוונטיות ביולוגית לכל מצב יינון. יתר על כן, המטלוליט שונים באופן משמעותי ואותות תכונה שומנים בין זני חיטה נקבעו.

המפעל מושפע משילוב של הגנום והסביבה שלה, ובנוסף בסביבה חקלאית, משטר ניהול יבול. אנו מדגימים כי הבדלים גנטיים בין זני חיטה ניתן לצפות ברמת מטבוליט, כאן, עם מעל 500 תרכובות נמדד מראה ריכוזים שונים באופן משמעותי בין זנים בלבד בדגן. דיוק המוני טוב (&lt; 10 דפים לדקה שגיאה) ו האות מובחנות (&lt; 20% RSD) של תקנים פנימיים (איור 2) נצפו הן עבור מצבי אינון שלילי וחיובי (שולחן 3). ההכנה לדוגמה המתוארת והניתוח המבוסס על מבוססי כרומטוגרפיה נוזלית הניב &g...

שיטה לניתוח בלתי ממוקד של מטבוליטים דגן חיטה ושומנים מוצג. הפרוטוקול כולל שיטת הפקת מטבוליט מטבוליזם והיפוך נוזל בשלב כרומטוגרפיה מתודולוגיה להמסת המסה, עם רכישת מצבי מגנטי חיובי ושלילי.

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

המטבוליט מושפע מגורמים כגון סביבת הגנום ושיטות הניהול. הבנת האינטראקציות בין גורמים אלה יכולה לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של התשואה והאיכות של המוצר. על ידי שילוב שלב נייד שלישי, ולא שני המסורתיים, טכניקה זו מאפשרת הפרדה וזיהוי של מגוון רחב יותר של מטבוליטים.מטבולומיים יכולים להיות מיושמים על כל תחום של ביולוגיה. ראשית, כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של הביוכימיה של האורגניזם, ולעזור להסביר את תגובתם ללחץ אביוטי או ביוטי ביחס לפיזיולוגיה. שנית, כדי לקשר סמנים ביולוגיים עם הפרעה תחת מחקר.כמו אלכוהול isopropyl הוא ממס צמיג, זה צריך להיות הציג בקצב התלקחות נמוך, מספיק זמן שיווי משקל בשימוש לפני הגדלת הרכב ל 98%צעדים אלה ימנעו את המערכת הגרפית כרומטית מלחץ יתר, החזרת שגיאה, או פוטנציאל נזק לעמודה האנליטית. כדי להתחיל בהכנת הדגנים, השתמש בבלנדר מעבדה כדי לטחון את התבואה. הפעל את הבלנדר במהירות גבוהה במשך 20 שניות ולאחר מכן חזור.מוציאים את צנצנת הבלנדר מהבסיס. הקש על הצד של צנצנת הבלנדר כדי להביא כל תבואה טחון גס על פני השטח של המדגם. ניתן להשליך או לאחסן את התבואה הטחנה גסה.מעבירים את התבואה הטחונה מהלבנדר לצינור מיקרו צנטריפוגה מפלסטיק שני מיליליטר. באותו יום כמו החילוץ, להכין את ממס החילוץ, כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, לשקול 200 מיליגרם של תבואה הקרקע דק לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שני מיליליטר.מוסיפים 500 מיקרוליטרים של ממס מיצוי לתבואה בצינור. בנוסף, להכין ריק על ידי הוספת 500 microliters של ממס החילוץ לצינור ריק. באמצעות homogenizer, להגדיר ב 6, 500 סל"ד, לערבב את הממס ואת התבואה במשך 20 שניות.לאחר מכן, חזור על הפעולה למשך 20 שניות נוספות. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור בארבע מעלות צלזיוס ו 16, 100 פעמים G, במשך חמש דקות. מעבירים את העל-טבעי לצינור פלסטיק של שני מיליליטר ושומרים על גלולה.חזור על תהליך החילוץ על גלולה פעמיים. מערבבים את שלושת העל-טבעיים, מניבים נפח תמצית כולל של כ-1.5 מיליליטר ומערבבים על-ידי מערבולת. כדי להפוך מדגם מאגר של כל תמציות התבואה שישמש לבקרת איכות, להעביר 55 microliters של כל תמצית תבואה לצינור שני מיליליטר ומערבולת.לאחר מכן, להעביר 50 aliquots microliter של מדגם זה מאגר בקבוקונים זכוכית. מעבירים אליקוט של 50 מיקרוליטר של כל תמצית דגימת תבואה לבקבוקוני זכוכית. כמתואר בכתב היד הכתוב, הכינו את הפתרונות שיידרשו לספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית.ביום הניתוח LCMS, להכין 100 מיליליטר של 5%אצטוניטריל, המכיל 200 ננוגרם לכל מיליליטר לאוצין enkephalin. הוסף 950 microliters של פתרון זה בקבוקון זכוכית המכיל את 50 aliquot microliter של תמצית התבואה. מערבבים את התוכן בבקבוקון על ידי מערבולת.ראשית, להגדיר כיול המכשירים כמתואר בכתב היד ואת מדריך המשתמש של היצרן. לאחר מכן, לטהר ולשטוף את מערכת נוזלי LC באמצעות ממסים כיתה LCMS, כולל פאזה ניידת ממיסים לשטוף. לצייד את מערכת LC באמצעות תנאי ההתחלה של שיטת LC, להבטיח כי לחץ העמודה התייצב.כוונן את טבלת רצף הכלים. הזרק נתרן formate בתחילת רצף הדגימה כדי לבדוק את כיול המכשיר. נתח תחילה ריקים ממסים ומיכונים, ואחריו דגימות בקרת איכות ממונפת עבור מיזוג מערכת ולאחר מכן את רשימת הדגימות האקראיות.הפעל דוגמאות בקרת איכות במרווחי זמן קבועים, כשכפולים טכניים. הפעל שתי דגימות בקרת איכות בסוף הרצף. בזמן שהרצף פועל, בדוק את איכות הנתונים, כולל דיוק המסה הסטנדרטי הפנימי וגם את יכולת השכפול של האות.כדי לבדוק את שכפול האות, בדיקה חזותית של ספקטרום מכוסה אמורה להספיק. ארבעה תקנים פנימיים נכללו בתסכה המשמשת להכנת תמציות התבואה. במהלך LCMS, דיוק מסה טוב ושחזור יחיד של תקנים פנימיים נצפו עבור מצבי יינון חיוביים ושליליים.בהתבסס על ניתוח של כדורי סרק, 421 אותות במצב שלילי ו 835 אותות במצב חיובי נשפטו להיות חפצים. אותות אלה היו נוכחים ריקים בעוצמות השוות או יותר מ-5% מהעוצמה הבודדת הממוצעת בדגימות תבואה. לאחר הסרת הממצאים וסינון נוסף של הנתונים, המצב השלילי החזיר 483 תכונות וה במצב החיובי החזיר 523 תכונות.כ-250 מאפיינים היו רלוונטיים מבחינה ביולוגית ושונים משמעותית בעוצמתם בין זני החיטה. אמצעי בקרת האיכות, כגון הכללת ריקים מוכנים, תקנים פנימיים ודגימות מאגר, חשוב לזכור בפרוטוקול זה.

untargeted-liquid-chromatography-mass-spectrometry-based-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (UPLC-MS) היא טכניקה רבת עוצמה לחקירת חילוף החומרים.  מאמר זה מתאר זרימת עבודה טיפוסית המשמשת לפרופיל מטבוליט לא ממוקד של סרום, כולל ארגון והכנת דגימות, רכישת נתונים, ניתוח נתונים, בקרת איכות וזיהוי מטבוליטים.

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של חומר ביולוגי עם רגישות גבוהה, דיוק, ורזולוציה.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

הפרוטוקולים מתארים שיטות כרומטוגרפיה נוזלית בעלות ביצועים גבוהים בשילוב עם אינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה לחקר תגובות מטבוליות במערכות מורכבות המבוססות על ליסאט ללא תאים.

כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לאינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה ליצירת פרופיל מטבוליט במערכות ללא תאים מבוססות ליסאט

מוצג כאן פרוטוקול לקביעת בליעה, טרנסלוקציה והפצה של אימידקלופריד בחיטה בתנאים הידרופוניים באמצעות ספקטרומטריית מסות כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית (LC-MS-MS). התוצאות הראו כי אימידקלופריד יכול להיספג על ידי חיטה, ואימידקלופריד זוהה הן בשורשי החיטה והן בעלים.

קביעת קליטה, טרנסלוקציה והפצה של אימידקלופריד בחיטה

מוצגת שיטה לניתוח מטבולומי של שעורה. השיטה כוללת פיצול ונגזרת של מטבוליטים וניתוחם על ידי כרומטוגרפיה גזית/ספקטרומטריית מסה (GC/MS). ניתן להשתמש בניתוח מטבולומי כדי לקבוע את ההשפעה של גידול משולב ולחץ בצורת על התבואה.

ניתוח מטבולומי של שעורה על ידי כרומטוגרפיה גזית/ספקטרומטריית מסה

פרוטוקול זה מציג שיטת ספקטרומטריית מסה מאומתת של כרומטוגרפיה נוזלית - ניידות יון ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע את נוכחותם של אלקלואידים ארגוט במזון בהתאם לתקנה של הנציבות (EU) 2023/915 שפורסמה לאחרונה.

זיהוי אלקלואידים ארגוטיים מוסדרים במטריצות מזון על ידי ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים בכרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה בזמן טיסה

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת מטבוליטים מ סטפילוקוקוס והניתוח הבא שלהם באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ו ספקטרומטריית מסה.

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

חקור שיטת כרומטוגרפיה נוזלית-מסתית לניתוח מטבולומי לא ממוקד בגרעיני חיטה. השיטה משלבת מופז נייד שלישי לזיהוי מטבוליטים רחב יותר ולשיפור הבנת התגובות הביוכימיות ללחות.

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

גלה סרטונים נוספים