בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

המטבוליט מושפע מגורמים כגון סביבת הגנום ושיטות הניהול. הבנת האינטראקציות בין גורמים אלה יכולה לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של התשואה והאיכות של המוצר. על ידי שילוב שלב נייד שלישי, ולא שני המסורתיים, טכניקה זו מאפשרת הפרדה וזיהוי של מגוון רחב יותר של מטבוליטים.

מטבולומיים יכולים להיות מיושמים על כל תחום של ביולוגיה. ראשית, כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של הביוכימיה של האורגניזם, ולעזור להסביר את תגובתם ללחץ אביוטי או ביוטי ביחס לפיזיולוגיה. שנית, כדי לקשר סמנים ביולוגיים עם הפרעה תחת מחקר.

כמו אלכוהול isopropyl הוא ממס צמיג, זה צריך להיות הציג בקצב התלקחות נמוך, מספיק זמן שיווי משקל בשימוש לפני הגדלת הרכב ל 98%צעדים אלה ימנעו את המערכת הגרפית כרומטית מלחץ יתר, החזרת שגיאה, או פוטנציאל נזק לעמודה האנליטית. כדי להתחיל בהכנת הדגנים, השתמש בבלנדר מעבדה כדי לטחון את התבואה. הפעל את הבלנדר במהירות גבוהה במשך 20 שניות ולאחר מכן חזור.

מוציאים את צנצנת הבלנדר מהבסיס. הקש על הצד של צנצנת הבלנדר כדי להביא כל תבואה טחון גס על פני השטח של המדגם. ניתן להשליך או לאחסן את התבואה הטחנה גסה.

מעבירים את התבואה הטחונה מהלבנדר לצינור מיקרו צנטריפוגה מפלסטיק שני מיליליטר. באותו יום כמו החילוץ, להכין את ממס החילוץ, כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, לשקול 200 מיליגרם של תבואה הקרקע דק לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שני מיליליטר.

מוסיפים 500 מיקרוליטרים של ממס מיצוי לתבואה בצינור. בנוסף, להכין ריק על ידי הוספת 500 microliters של ממס החילוץ לצינור ריק. באמצעות homogenizer, להגדיר ב 6, 500 סל"ד, לערבב את הממס ואת התבואה במשך 20 שניות.

לאחר מכן, חזור על הפעולה למשך 20 שניות נוספות. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור בארבע מעלות צלזיוס ו 16, 100 פעמים G, במשך חמש דקות. מעבירים את העל-טבעי לצינור פלסטיק של שני מיליליטר ושומרים על גלולה.

חזור על תהליך החילוץ על גלולה פעמיים. מערבבים את שלושת העל-טבעיים, מניבים נפח תמצית כולל של כ-1.5 מיליליטר ומערבבים על-ידי מערבולת. כדי להפוך מדגם מאגר של כל תמציות התבואה שישמש לבקרת איכות, להעביר 55 microliters של כל תמצית תבואה לצינור שני מיליליטר ומערבולת.

לאחר מכן, להעביר 50 aliquots microliter של מדגם זה מאגר בקבוקונים זכוכית. מעבירים אליקוט של 50 מיקרוליטר של כל תמצית דגימת תבואה לבקבוקוני זכוכית. כמתואר בכתב היד הכתוב, הכינו את הפתרונות שיידרשו לספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית.

ביום הניתוח LCMS, להכין 100 מיליליטר של 5%אצטוניטריל, המכיל 200 ננוגרם לכל מיליליטר לאוצין enkephalin. הוסף 950 microliters של פתרון זה בקבוקון זכוכית המכיל את 50 aliquot microliter של תמצית התבואה. מערבבים את התוכן בבקבוקון על ידי מערבולת.

ראשית, להגדיר כיול המכשירים כמתואר בכתב היד ואת מדריך המשתמש של היצרן. לאחר מכן, לטהר ולשטוף את מערכת נוזלי LC באמצעות ממסים כיתה LCMS, כולל פאזה ניידת ממיסים לשטוף. לצייד את מערכת LC באמצעות תנאי ההתחלה של שיטת LC, להבטיח כי לחץ העמודה התייצב.

כוונן את טבלת רצף הכלים. הזרק נתרן formate בתחילת רצף הדגימה כדי לבדוק את כיול המכשיר. נתח תחילה ריקים ממסים ומיכונים, ואחריו דגימות בקרת איכות ממונפת עבור מיזוג מערכת ולאחר מכן את רשימת הדגימות האקראיות.

הפעל דוגמאות בקרת איכות במרווחי זמן קבועים, כשכפולים טכניים. הפעל שתי דגימות בקרת איכות בסוף הרצף. בזמן שהרצף פועל, בדוק את איכות הנתונים, כולל דיוק המסה הסטנדרטי הפנימי וגם את יכולת השכפול של האות.

כדי לבדוק את שכפול האות, בדיקה חזותית של ספקטרום מכוסה אמורה להספיק. ארבעה תקנים פנימיים נכללו בתסכה המשמשת להכנת תמציות התבואה. במהלך LCMS, דיוק מסה טוב ושחזור יחיד של תקנים פנימיים נצפו עבור מצבי יינון חיוביים ושליליים.

בהתבסס על ניתוח של כדורי סרק, 421 אותות במצב שלילי ו 835 אותות במצב חיובי נשפטו להיות חפצים. אותות אלה היו נוכחים ריקים בעוצמות השוות או יותר מ-5% מהעוצמה הבודדת הממוצעת בדגימות תבואה. לאחר הסרת הממצאים וסינון נוסף של הנתונים, המצב השלילי החזיר 483 תכונות וה במצב החיובי החזיר 523 תכונות.

כ-250 מאפיינים היו רלוונטיים מבחינה ביולוגית ושונים משמעותית בעוצמתם בין זני החיטה. אמצעי בקרת האיכות, כגון הכללת ריקים מוכנים, תקנים פנימיים ודגימות מאגר, חשוב לזכור בפרוטוקול זה.