המיקרוגל והפלואורופפור-טירמידה לשימוש בחומרים מדומים על העכבר באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין מארח

כשל חיסוני נמצא בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כדי לזהות את המיקום של חלבון מעניין. מולטיפלקס immunostaining יכול לזהות מטרות מרובות על אותה מדגם באמצעות נוגדנים ראשוניים שונים. היתרון של שיטה זו הוא השימוש במאגרים הזמינים בדרך כלל כדי למנוע תגובתיות צולבת נוגדנים המאפשרת כשל חיסוני באמצעות שני נוגדנים ראשוניים או יותר ללא תריס מאותו מין מארח.

הדגמת ההליך תהיה סופיה ז'נג, סטודנטית לתואר שני, וצ'יונגשיה ליו, חוקרת אורחת במעבדה שלי. לפני הכתמה, דה-שעווה ו rehydrate פורמלין קבוע פרפין מוטבע שקופיות עם חמש דקות טבילה בכל פתרון כפי שצוין. לאחר טבילת המים המזוקקת השנייה, מניחים את המגלשות ב-275 מיליליטר של תווי נתרן ציטראט רותחים בתחתית קופסת טיפים עם מכסה ומכניסים את התיבה למיקרוגל של 700 ואט בהספק של 75% למשך שמונה דקות.

בסוף הטיפול, פתח את המכסה ואפשר לפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שטיפת המגלשות עם שלוש שטיפות של חמש דקות של PBST טרי בצנצנת קופלין. כדי לחסום אתרי איגוד לא ספציפיים, לאחר הכביסה האחרונה לנער את PBST עודף מכל שקופית ולכסות את השקופיות עם נפח מספיק של פתרון חסימה מתאים. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח, לנער את פתרון חסימה עודף מכל שקופית ולהוסיף 250 microliters של הנוגדן העיקרי הראשון של עניין לכל מדגם.

כדי למנוע התייבשות של דגימות, השקופיות עשויות להיות מכוסות על-ידי פיסת סרט פרפין. לאחר דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס בתא לח, לשטוף את המגלשות שלוש פעמים עם PBST טרי במשך חמש דקות לכל לשטוף. לנער את PBST עודף ואז לכסות במהירות כל שקופית עם 250 microliters של פתרון נוגדנים משני מתאים עבור דגירה של שעה אחת בתא לח בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST טרי כפי שהודגם ולהוסיף 250 microliters של חזרת סטרפטבידין טרי peroxidase לכל שקופית. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את המגלשות שלוש פעמים PBST טרי. לאחר מכן לנער את PBST עודף לכסות כל שקופית עם 250 microliters של פתרון פלואורופור-טיראמיד מוכן טרי.

דקה לאחר מכן, הטביעו את השקופיות ב- PBST טרי ואחריו שלוש שטיפות של שתי דקות ב- PBST טרי. לאחר הכביסה האחרונה, יש למרוח כמה טיפות של פתרון גליצרול-ל-PBS אחד לאחד על החלקים ולבדוק נוכחות של אות פלואורסצנטי על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כדי להסיר את קומפלקס הנוגדנים הראשון, מניחים את הנוגדן שכותרתו מגלשות ב 275 מיליליטר של פתרון ציטראט נתרן רותח לפחות שמונה דקות כפי שהוכח.

בסוף הטיפול, לפתוח את המכסה ולתת את הפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שטיפת השקופיות שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות לכל לשטוף. כדי להכתים את חלבון היעד השני של עניין, לאחר חסימה עבור כריכה לא ספציפית כפי שהודגם, תווית כל מדגם עם 250 microliters של הנוגדן העיקרי השני של עניין בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות PBST טרי לכל לשטוף לפני כיסוי כל שקופית עם 250 microliters של פתרון נוגדנים משני מתאים עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST טרי כפי שהודגם ולהוסיף 250 microliters של חזרת סטרפטבידין טרי peroxidase לכל שקופית. כדי לפתח את האות לחלבון היעד השני של עניין, לאחר שלוש שטיפות PBST, לטפל בשקופיות עם טיראמיד פלואורופור משותף בספקטרום פלואורסצנטי שונה. כדי לעצור את התפתחות האותות של טירמיד, הפוך את השקופיות ל- PBST.

ואז להכתים את הדגימות עם צבע גרעיני מתאים. להדמיה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הר כל צבע גרעיני שכותרתו שקופית עם טיפה של מדיום הרכבה מתאים בכיסוי. השתמש במטרה 4X כדי לאתר את הרקמה על השקופית.

עבור למטרה 10X להדמיה והתאם את זמן החשיפה ל- 100 עד 400 אלפיות השניה עם מקור האור בין 40% ל- 80%. לאחר מכן השג תמונות בכל ערוץ מבלי להזיז את הבמה. ניתן למזג את התמונות מכל ערוץ כדי ליצור תמונה פלואורסצנטית מרובת-ערוצים.

ללא הפשטה בין כתמי הנוגדן הראשון והמשני, הכתם השני של טירוסין הידרוקסילאז יהיה להרים אותות מחלבון היעד הראשון של עניין וכתוצאה מכך הכתמת טירוסין הידרוקסילאז חיובי כוזב, למשל מדגם זה בתוך קליפת יותרת הכליה. כדי להסיר את תגובתיות צולבת הנוגדן peroxidase חזרת מן הכשל החיסוני הראשון, דקה אחת ושמונה דקות מיקרוגל מתווך הפשטה יכול להתבצע וכתוצאה מכך תוצאות כתם כפול נקי. לא נאסף אות משמעותי בדגימות בקרה שליליות.

הפשטה של שמונה דקות במאגר ציטראט רותח מספיקה גם כדי למנוע תגובתיות צולבת נוגדנים עבור נוגדנים רבים הנפוצים בלוטת יותרת הכליה. במקרים מסוימים, אות חיובי כוזב חלש עדיין ניתן לגילוי, עם זאת, עלייה של 20 דקות לטיפול במיקרוגל עדיין לא יכול להסיר לחלוטין את תגובתיות צולבת הנוגדן. במהלך הדמיה פלואורסצנטית, חשוב לא להזיז את הבמה בעת החלפת ערוצים.

עם זאת, ייתכן שיהיה צורך לשנות את המיקוד כדי לקבל תמונות ברורות של כל ערוץ. עבור כל ערוץ, הקפד להתאים את זמן החשיפה כדי להבטיח שה אותות ייחשפו כראוי ללא פיקסלים או אזורים שנחשפו יתר על כן בתמונות. במהלך הליך הכתמים, חשוב לשמור על השקופיות hydrated מן de-waxing ואת השקופיות ניתן להסיר באמצעות אותן שיטות הפשטה מספר פעמים כדי לאפשר כתמים מולטיפלקס.