Name: עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV) כדי להעריך ויסות קולטן אזור טגמנטלי גחוני של דופמין פאזי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: חקור ויסות קולטנים באזור טגמנטלי גחוני (VTA) והשפעתם על שחרור דופמין פאזי בגרעין האקומבנס בחולדות. השיטה משלבת עירוי וגירוי עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV) כדי לבחון מנגנוני קולטנים במוח שלם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה על ידי מכללת אליזבתטאון (R.J.W, M.L., ו- L.M.), על ידי מלגת בוגרי NSF (R.J.W. ) ועל ידי בית הספר לרפואה של ייל (N.A.).

כל הניסויים נערכו על פי מדריך המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו הן על ידי מכללת אליזבתטאון והן על ידי אוניברסיטת ייל מוסדית לטיפול בבעלי חיים והוועדה לטיפול בבעלי חיים (IACUC). פרוטוקול זה הוא ספציפי להכנת חולדה מרדים של ניצול CIS-FSCV.
1. הכנות פרסוקרתיות
<ol><li>הכנת פתרון אלקטרודה<ol>
<li>כדי להפוך את פתרון מילוי גב אלקטרודה, להכין פתרון של 4 M אשלגן אצטט עם 140 mM אשלגן כלורי16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת אלקטרודה<ol>
<li>באמצעות שאיבה ואקום, הכנס סיבי פחמן T-650 (7 מיקרומטר קוטר) לתוך נימי זכוכית בורוסיליקט (אורך = 100 מ"מ, קוטר = 1.0 מ"מ, קוטר פנימי = 0.5 מ"מ).</li>
		<li>לאחר סיבי הפחמן הונח בתוך נימי הזכוכית, מניחים את נימי הזכוכית לתוך פולר אלקטרודה אנכי, עם אלמנט החום בערך באמצע הנימי. הגדר את התנור ל 55 עם המגנט כבוי.</li>
		<li>לאחר הנימי נמשך, בזהירות להעלות את מחזיק נימי העליון, כך קצה האלקטרודה אינו מוקף גוף חימום.</li>
		<li>בעזרת מספריים חדים, חותכים את סיבי הפחמן שעדיין מחברים בין שתי חתיכות הנימי. התוצאה תהיה שני מיקרואלקטרודים נפרדים של סיבי פחמן.</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ קל, לחתוך בזהירות את סיבי הפחמן החשופים עם אזמל חד, כך סיבי הפחמן משתרע כ 75-100 מיקרומטר מעבר לסוף הזכוכית.</li>
		<li>באמצעות מיקרוסקופ אור, ודא כי האלקטרודה היא ללא סדקים לאורך נימי. כמו כן, להבטיח כי החותם, שבו סיבי הפחמן יוצא נימי, קשה להבחין ללא סדקים. הערה: חותם טוב יעזור להפחית רעש במהלך ההקלטות. ראה מחקרים שפורסמו17,18,19 לפרוטוקול מפורט יותר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ייצור אלקטרודה ייחוס<ol>
<li>הלחמה סיכת זהב לחוט כסף 5 ס"מ.</li>
		<li>חבר את האנודה למהדק נייר ממתכת או למוליך אחר, הקתודה לסיכה, והחל מתח (~ 2 V) בעוד מהדק הנייר וחוט הכסף שקועים ב- 0.1 M HCl.</li>
		<li>הפסק את המתח ברגע שציפוי לבן (AgCl) מופיע על חוט הכסף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת אלקטרודה להשתלת<ol>
<li>הלחמה סיכת זהב לחוט מבודד דק (אורך ~ 10 ס"מ, קוטר <0.50 מ"מ).</li>
		<li>הסר ~ 5 ס"מ של בידוד מן החוט מול סיכת הזהב.</li>
		<li>מלא את האלקטרודה בערך באמצע הדרך עם פתרון אלקטרודה.</li>
		<li>הכנס חוט מבודד לתוך האלקטרודה. הערה: החוט צריך ליצור קשר עם סיבי הפחמן בתוך האלקטרודה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. השתלות אלקטרודה
<ol><li>תן לחולדות בוגרות, זכריות, ספראג דולי (250−450 גרם) הזרקה תוך-איטרא-איטרציונלית (1.5 גרם/ק"ג או נפח של 1 מ"ל/ק"ג) של 0.5 גרם/מ"ל אורתאן מומס בתמיסת מלח סטרילית. התחל עם מינון הurethane הראשוני של 1.0−1.2 גרם/ק"ג. אם החיה עדיין מגיבה לבדיקת הגירוי הרעיל (צביטת זנב) 20 דקות לאחר מתן השופכה, יש צורך במנה כוללת נוספת של 0.3−0.5 גרם/ק"ג עבור מנה כוללת של 1.5 גרם/ק"ג. הערה: להכנת פתרון אורתאן 0.5 גרם / מ"ל, להוסיף 10 גרם של אורתאן כדי 10 גרם (~ 10 מ"ל) של מלוחים. אורתאן הוא מסרטן ויש לטפל בו בזהירות. אורתאן הוא הרדמה חשובה, כפי שהוא אינו משנה את רמות הדופמין, כמו גם הרדמה אחרת כגון קטמין / קסילאסין וכלורל הידרציה20,21.</li>
	<li>ברגע שהחיה היא מרדימה עמוקה ואינה מגיבה לגירויים מזיקים (למשל, צביטת בוהן), מניחים אותה במסגרת הסטריאוטקסית. יש למרוח חומר סיכה עיניים על כל עין של החולדה. הערה: זהו ניתוח שאינו הישרדות, אך מעודדים טכניקה אספטית טובה.</li>
	<li>נקה את הקרקפת של החולדה באמצעות קרצוף דו-שלבי (כלומר, קרצוף iodopovidone ואחריו קרצוף אתנול 70%; לבצע עם חזרה 3 מחזור).</li>
	<li>חותכים את רקמת הקרקפת באמצעות פינצטה של האף מחט מעוקר ומספריים כירורגיות. הסר כמות משמעותית של רקמה כדי לפנות מקום להשתלות השונות המתוארות להלן.</li>
	<li>יש לנקות בעדינות את משטח הגולגולת באמצעות אפליקטורים מעוקרים של קצה כותנה. לאחר מכן להחיל 2−3 טיפות של 3% מי חמצן כדי לעזור לזהות את lambda ו bregma.</li>
	<li>באמצעות מקדחה סטריאוטקסית או ידנית (1.0 מ"מ, כ-20,000 סל"ד), מקדחים חור בקוטר 1.5 מ"מ בקוטר 2.5 מ"מ, 2.5 מ"מ, לרוחב ברגמה. חלקית (בערך באמצע הדרך, עד שהוא יציב במקום) להשתיל בורג (1.59 מ"מ O.D., 3.2 מ"מ ארוך) בחור זה. מומלץ להשתמש מלוחים סטריליים להשקיה בעת הקידוח כדי למנוע פגיעה תרמית.</li>
	<li>עבור אלקטרודה הייחוס, לקדוח חור בקוטר 1.0 מ"מ 1.5 מ"מ קדמי ו 3.5 מ"מ לרוחב ברגמה, בחצי הכדור השמאלי.</li>
	<li>ביד, להכניס ~ 2 מ"מ של חוט התייחסות לתוך החור הזה, תוך גלישת חוט הייחוס סביב ומתחת לראשו של הבורג המושתל.</li>
	<li>להשתיל את הבורג באופן מלא, מצמיד את אלקטרודה הייחוס במקום.</li>
	<li>בחצי הכדור הימני, לקדוח חור בקוטר 1.5 מ"מ 1.2 מ"מ קדמי ו 1.4 מ"מ לרוחב ברגמה.</li>
	<li>הסר בעדינות את הדורה באמצעות פינצטה.</li>
	<li>עבור האלקטרודה הממריצה, לקדוח חור מרובע (2 מ"מ הקדמי-אחורי, 5 מ"מ מ"מ מנדל-לרוחב) מרוכז 5.2 מ"מ אחורי ו 1.0 מ"מ לרוחב ברגמה.</li>
	<li>באמצעות מוטות הזרוע הסטריאו-פקטיים, הורידו את הצינורית המעוררת/מדריך הדו-קוטבית 5 מ"מ מתחת לדורה. במקרה של דימום במהלך ההשתלה של האלקטרודה, להשתמש צמר גפן סטרילי גזה כדי למזער את הדימום. הערה: האלקטרודה הממריצה הדו קוטבית המשמשת בשיטה זו מותאמת מראש עם צינורית מדריך(טבלת חומרים). הצינורית הפנימית המשמשת עם פריט זה צריך להיות סמוק עם ניחני האלקטרודה מגרה דו קוטבי כאשר מוכנס במלואו לתוך צינורית המדריך. זה יאפשר את הצינורית הפנימית לשבת ישירות בין שני חוד החנית של הממריץ, אשר יושבים על 1 מ"מ זה מזה. פרוטוקול דומה מתואר במקום אחר14.</li>
	<li>באמצעות מוטות הזרוע הסטריאו-טסטרואטקטיים, הורידו את מיקרו-המיקרו-קטרוד של סיבי הפחמן 4 מ"מ מתחת לדורה. מיקום זה נמצא בחלק החלק החלקי ביותר של הסטריאטום.</li>
	<li>חבר את חוט הייחוס וסיבי הפחמן לפוטנציוסטט.</li>
	<li>החל צורת גל משולשת (-0.4−1.3 V, 400 V/s) למשך 15 דקות ב-60 הרץ, ושוב למשך 10 דקות ב-10 הרץ. הערה: בדרך כלל, בעת החלת צורות גל על מיקרו-ectrodes סיבי פחמן במוח, קבוצות תחמוצת מתווספות לפני השטח של סיבי הפחמן. יש להגיע לשיווי משקל של תגובה זו לפני ההקלטה; אחרת סחיפה משמעותיתתתרחש 19. רכיבה על אופניים האלקטרודה בתדרים גבוהים יותר (60 הרץ) מאפשר סיבי הפחמן להשיג שיווי משקל מהר יותר.</li>
</ol>3. אופטימיזציה של סיבי פחמן וממריץ מיקומי צינוריות אלקטרודה/מדריך
<ol><li>הגדר את הממריץ כדי לייצר צורת גל חשמלית דו קוטבית, עם תדר של 60 הרץ, 24 פולסים, זרם 300 μA ורוחב דופק של 2 אלפיות שניים / פאזה.</li>
	<li>הוריד בעדינות את הממריץ במרווחים של 0.2 מ"מ מ-5 מ"מ ל-7.8 מ"מ מתחת לדורה. בכל תוספת, לעורר את VTA. הערה: בעומקים יותר של עור (5−6 מ"מ), גירוי המוח בדרך כלל (~ 80% מהזמן) לגרום לשפם של החולדה להתעוות. בעומקים נוספים, השפם יפסיק עוויתות, אשר מתרחשת בין 7.5−8.2 מ"מ מתחת לדורה. כאשר השפם מפסיק להתעוות, האלקטרודה הממריצה תהיה קרובה או ב- VTA. זה לא יקרה בכל חולדה, וחוסר עוויתות שפם לא צריך להיחשב כסימן כי צינורית אלקטרודה / עירוי מגרה דו קוטבי אינו במקומו. עוויתות שפם לא יכול להתרחש עבור כל ההרדמה (למשל, איזופלוראן).</li>
	<li>המשך להוריד את הצינורית האלקטרודה/מדריך המעוררת הדו-קוטבית עד שגירוי מייצר שחרור DA פאזי במיקרו-קטרודת סיבי הפחמן (שנמצאת כיום בסטריאטום גב). הערה: שחרור DA בסטריאטום גב לא תמיד יתרחש אם האלקטרודה הדו קוטבית מושתלת ב- VTA, אבל התבוננות בשחרור DA בסטריאטום גב על גירוי VTA הוא בדרך כלל סימן טוב כי אות טוב יהיה נצפה בליבת NAc.</li>
	<li>מנמיכים את סיבי הפחמן מיקרו-קטרוד עד שהוא לפחות 6.0 מ"מ מתחת לדורה. זהו החלק הכי גדול של ליבת NAc.</li>
	<li>לעורר את VTA ולתעד את משרעת השיא של שיא DA.</li>
	<li>להנמיך או להעלות את microelectrode סיבי פחמן באתר המייצר את שחרור DA הגדול ביותר.</li>
	<li>ודא כי שיא התגובה DA הוא שיא חמצון ברור ב 0.6 V ושיא הפחתה ב -0.2 V. פסגות אלה מעידות על DA.</li>
</ol>4. שילוב עירוי וגירוי FSCV הקלטה
הערה: איור 1 מציג את ציר הזמן להקלטה לפני ואחרי מיקרו-fusion VTA.
<ol><li>לאחר סיבי פחמן ומיקום צינורית אלקטרודה / מדריך מגרה כבר אופטימיזציה, לעורר במשך ~ 20−30 דקות. הערה: תחת הפרמטרים הגירוי הנוכחי, לא לעורר יותר מפעם אחת בכל 3 דקות, כדי לאפשר טעינה מחדש של כלי רכב22.</li>
	<li>לאחר השגת בסיס יציב (<20% וריאציה על פני חמישה גירויים), בעדינות להוריד את הצינורית הפנימית ביד לתוך צינורית המדריך כי הוא prefitted לתוך ממריץ דו קוטבי.</li>
	<li>קח הקלטות בסיסיות נוספות של 2−3 כדי להבטיח שהכנסת הצינורית עצמה לא גרמה לשינוי באות המעורר. במקרים מסוימים, החדרה והסרה של הצינורית הפנימית יכול לגרום נזק VTA. אם האות משתנה באופן דרסטי במהלך תקופת בסיס זו (>20%), יש לבצע הקלטות נוספות של 3−4 עד לשחזור הבסיס.</li>
	<li>באמצעות משאבת מזרק ומיקרו-מזרק, להחדיר 0.5 μL של פתרון (למשל, 0.9% מלוחים, N-מתיל-D-אספרטט [NMDA], (2R)-אמינו-5-חומצה פוספונובלרית [AP5]) לתוך VTA על פני תקופה של 2 דקות.</li>
	<li>לאחר ההדבקה, להשאיר את הצינורית הפנימית לפחות 1 דקות לפני ההסרה. הערה: תרופות מסוימות עשויות לדרוש עזיבת הצינורית הפנימית במשך זמן רב יותר בהתבסס על קינטיקה סמים, והסרת הצינורית הפנימית עלולה לגרום לתרופה לנסוע בחזרה דרך הצינורית הפנימית. אם יש חשש, אפשר להשאיר את הצינורית הפנימית ב צינורית המדריך במהלך כל ההקלטה. אחרת, ההקלטה יכולה להתחיל לאחר מרווח זמן של דקה אחת.</li>
	<li>המשך להקליט כל 3 דקות כדי למדוד אפקטים לאחר ההנפצה. הערה: אם מחדיר פתרון בקרה, ולא נצפתה השפעה, ניתן להחדיר בפעם השנייה10. אם יש שחרור DA שונה הנגרמת על ידי החדרת צינורית פנימית או עירוי מלוחים, האות בדרך כלל מתאושש לקו הבסיס בתוך 30 דקות.</li>
</ol>5. אימות היסתולוגי של מיקום אלקטרודה
<ol><li>בסוף הניסוי, ליצור נגע קטן באתר ההקלטה באמצעות microelectrode סיבי פחמן.<ol>
<li>אם יש לשמר את האלקטרודה לכיול לאחר הניסיון, השתמש בחוט טונגסטן המוצב בני נימי זכוכית הבולט ~ 100 מיקרומטר מעבר לקצה הנימי. במקרה זה, להעלות את האלקטרודה מהמוח, להחליף את אלקטרודה ההקלטה עם אלקטרודה טונגסטן, ולהוריד אותו לאותה קואורדינטות דורסוונטרליות. הערה: סיבי הפחמן עשויים לשמש נגע גם למוח ויספקו ייצוג מדויק יותר של המיקום של אתר ההקלטה; עם זאת, הנסיין יאבד את היכולת לכייל אלקטרודות אלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לצל את אתר ההקלטה, להחיל מתח באמצעות ספק כוח. התחל ב- 1 V והגדל ב- 1 V כל 10 s עד 10 V.</li>
	<li>המתת חסד החיה באמצעות זריקה תוך-איפריטונית קטלנית של פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג).</li>
	<li>לנטרל את החולדה באמצעות פתרון פורמלין 4%.</li>
	<li>הסר את הראש מן החולדה באמצעות גיליוטינה מחודדת.</li>
	<li>באמצעות rongeurs, להסיר את רקמת החיבור ואת הגולגולת המקיפה את המוח, בעדינות להוציא את המוח מכל רקמה שנותרה.</li>
	<li>לאחסן את המוח ב 4% פורמלין ליום אחד ולאחר מכן להעביר אותו ל 30% סוכרוז. הערה: זלוף עם 4% פורמלין אין צורך לראות את אתר הנגע, אם כי כתרגול הטוב ביותר זה ישפר את השחזור של אתר הנגע.</li>
	<li>צור 30 פרוסות מיקרומטר של המוח באמצעות cryostat.</li>
	<li>הרנו את הפרוסות על שקופיות וכסו במכתר כיסוי.</li>
	<li>ציין את המיקום של נגע microelectrode סיבי פחמן ומעורר דו קוטבי / צינורית עירוי באמצעות מיקרוסקופ אור.</li>
</ol>

<ol><li>Grace, A. A., Bunney, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+firing+pattern+in+nigral+dopamine+neurons%3A+burst+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing.</a> Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).</li>
<li>Lester, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+acetylcholine+and+glutamate+receptors+modulate+accumbal+dopamine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release.</a> Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).</li>
<li>Lodge, D. J., Grace, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laterodorsal+tegmentum+is+essential+for+burst+firing+of+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mu+Opioid+Receptor+Modulation+of+Dopamine+Neurons+in+the+Periaqueductal+Gray%2FDorsal+Raphe%3A+A+Role+in+Regulation+of+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).</li>
<li>Zhang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+functional+cannabinoid+CB2+receptor+in+VTA+dopamine+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats.</a> Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).</li>
<li>Wickham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+studying+phasic+dopamine+signaling+in+brain+reward+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms.</a> Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).</li>
<li>Wightman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+transmitter+metabolites+by+voltammetry+in+cerebrospinal+fluid+following+neural+pathway+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation.</a> Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).</li>
<li>Grace, A. A., Bunney, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+firing+pattern+in+nigral+dopamine+neurons%3A+single+spike+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing.</a> Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).</li>
<li>Mameli-Engvall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+control+of+dopamine+neuron-firing+patterns+by+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors.</a> Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).</li>
<li>Wickham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+tegmental+area+alpha6beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+modulate+phasic+dopamine+release+in+the+nucleus+accumbens+core%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core.</a> Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).</li>
<li>Solecki, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+ventral+tegmental+area+acetylcholine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors+in+cocaine-seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking.</a> Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).</li>
<li>John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohn%2C+CE+%22Electrochemical+Methods+for+Neuroscience%22">Electrochemical Methods for Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).</li>
<li>Rice, M. E., Cragg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+amplifies+reward-related+dopamine+signals+in+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum.</a> Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).</li>
<li>Espana, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocretin+1%2Forexin+A+in+the+ventral+tegmental+area+enhances+dopamine+responses+to+cocaine+and+promotes+cocaine+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration.</a> Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).</li>
<li>Addy, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-type+calcium+channel+blocker%2C+isradipine%2C+attenuates+cue-induced+cocaine-seeking+by+enhancing+dopaminergic+activity+in+the+ventral+tegmental+area+to+nucleus+accumbens+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway.</a> Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).</li>
<li>Hermans, A., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conical+tungsten+tips+as+substrates+for+the+preparation+of+ultramicroelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes.</a> Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).</li>
<li>Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorland%2C+LM+%22Electrochemical+Methods+for+Neuroscience%22">Electrochemical Methods for Neuroscience</a>. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).</li>
<li>Mundroff, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amperometry+and+cyclic+voltammetry+with+carbon+fiber+microelectrodes+at+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells.</a> Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14(2002).</li>
<li>Rodeberg, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitchhiker%27s+Guide+to+Voltammetry%3A+Acute+and+Chronic+Electrodes+for+in+vivo+Fast-Scan+Cyclic+Voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).</li>
<li>Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloral+hydrate+and+ethanol%2C+but+not+urethane%2C+alter+the+clearance+of+exogenous+dopamine+recorded+by+chronoamperometry+in+striatum+of+unrestrained+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats.</a> Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).</li>
<li>Masuzawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentobarbital+inhibits+ketamine-induced+dopamine+release+in+the+rat+nucleus+accumbens%3A+a+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+%26+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study.</a> Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).</li>
<li>Montague, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gain+control+of+dopamine+delivery+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals.</a> Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).</li>
<li>Keithley, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+sensitivity+dopamine+measurements+with+faster-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry.</a> Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).</li>
<li>Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-scan+cyclic+voltammetry+of+5-hydroxytryptamine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine.</a> Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).</li>
<li>Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+comparison+of+norepinephrine+and+dopamine+release+in+rat+brain+by+simultaneous+measurements+with+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry.</a> Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).</li>
<li>Wenzel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasic+Dopamine+Signals+in+the+Nucleus+Accumbens+that+Cause+Active+Avoidance+Require+Endocannabinoid+Mobilization+in+the+Midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain.</a> Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).</li>
<li>Spanos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+Receptor-Dependent+Cholinergic+Modulation+of+Mesolimbic+Dopamine+Cell+Bodies%3A+Neurochemical+and+Behavioral+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).</li>
<li>Cheer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+enhance+subsecond+dopamine+release+in+the+nucleus+accumbens+of+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats.</a> Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).</li>
<li>Melchior, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+versus+electrical+stimulation+of+dopamine+terminals+in+the+nucleus+accumbens+reveals+local+modulation+of+presynaptic+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release.</a> Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).</li>
<li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+Enables+Rapid+and+Specific+Detection+of+Dopamine+in+Flies%2C+Fish%2C+and+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice.</a> Cell. 174 (2), 481-496 (2018).</li>
<li>Robinson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+rapid+chemical+communication+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Monitoring rapid chemical communication in the brain.</a> Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+extracellular+dopamine+regulation+in+the+subregions+of+the+olfactory+tubercle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).</li>
<li>Ganesana, M., Venton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+changes+in+transient+adenosine+during+cerebral+ischemia+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury.</a> PLoS One. 13 (5), e0196932(2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

CIS-FSCV מספק הזדמנות ייחודית לחקור מנגנוני קולטן VTA שבבסיס שחרור DA פאזי. ישנם שני שלבים קריטיים על מנת להבטיח הקלטה נכונה. ראשית, יש להשיג הקלטה בסיסית יציבה, עם מעט סחיפה באות DA המעורר. דרך חשובה להגדיל את הסבירות להקמת הקלטה יציבה היא להבטיח כי האלקטרודה היה מספיק זמן מחזור הן 60 הרץ ו 10 הרץ (בדרך כלל 15 דקות ב 60 הרץ, ו 10 דקות ב 10 הרץ). כמו סיבי הפחמן הוא להיות רכב על אופניים, סיבי הפחמן עצמו מתחמצן, הופך חרוט, הפחתת שטח הפנים אבל לייצר משטח חדש עבור דופמין ספיחה23. זה יכול להוביל לעלייה...

שחרור דופמין פאסיק (DA) מהאזור הטגמנטלי הגחוני (VTA) לגרעין האקומבנס (NAc) ממלא תפקיד חיוני בהתנהגויות הקשורות לתגמול. נוירונים VTA DA לעבור מירי דמוי טוניק (3-8 הרץ) לירי דמוי פרץ (>14 הרץ)1, אשר מייצר שחרור DA פאזי ב- NAc. VTA מבטא מגוון של קולטנים סומטונדריטיים הממוקמים היטב כדי לשלוט על המתג מטוניק לפרץירי 2,3,4,5. זיהוי אילו קולטנים אלה, והתשומות המתאימות להם, שחרור DA פאזי שליטה יעמיקו את הבנתנו כיצד מאורגנים המעגלים הקשורים לתגמול. מטרת המתודולוגיה המתוארת כאן, עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV), היא להעריך במהירות ובחזקה את הפונקציונליות של קולטני VTA בנהיגה שחרור DAphasic.
המונח עירוי וגירוי משולבים (CIS) מתייחס קולטנים מניפולציה פרמקולוגית על קבוצה של נוירונים (כאן VTA) וממריץ נוירונים אלה ללמוד את תפקוד הקולטן. בחולדה המרדים, אנו מעוררים חשמלית את ה- VTA לעורר אות DA פאזי גדול (1-2 מיקרומטר) בליבת NAc, כפי שנמדד על ידי וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (FSCV). חליטות של תרופות פרמקולוגיות (כלומר, אגוניסטים קולטן/אנטגוניסטים) באתר הגירוי ניתן להשתמש כדי למדוד את הפונקציה של קולטני VTA על ידי התבוננות בשינוי הבא בשחרור DA פאזי מעורר. FSCV היא גישה אלקטרוכימית הנהנית הן מרחבית גבוהה (50-100 מיקרומטר) והן רזולוציה זמנית (10 הרץ), ומתאימה היטב למדוד אירועי DA פאזיים הקשורים לתגמול6,7. רזולוציה זו עדינה יותר ממדידות נוירוכימיות אחרות של vivo, כגון מיקרודיאליזה. לכן, יחד, CIS-FSCV מתאים היטב כדי להעריך ויסות קולטן VTA של שחרור דופמין פאזי.
דרך נפוצה אחת לחקור את תפקוד קולטן VTA היא באמצעות שילוב של גישות אלקטרופיזיולוגיות המטפלות באופן שבו קולטנים אלה משנים את קצב הירי של נוירונים1,8. מחקרים אלה הם בעלי ערך רב בהבנת מה קולטנים מעורבים בהנעת DA ירי בעת ההפעלה. עם זאת, מחקרים אלה יכולים רק להציע מה עלול לקרות במורד הזרם במסוף אקסון (כלומר, שחרור של נוירוטרנסמיטר). CIS-FSCV בונה על מחקרים אלקטרופיזיולוגיים אלה על ידי מענה כיצד הפלט של VTA פרץ ירי, שחרור DA פאזי, מוסדר על ידי קולטנים הממוקמים על דנדריטים VTA וגופי תאים. לכן, CIS-FSCV מתאים היטב לבנות על מחקרים אלקטרופיזיולוגיים אלה. כדוגמה, הפעלת קולטן nicotinic יכול לגרום יריפרץב VTA 9 , ו CIS-FSCV בחולדה מרדים שימש כדי להראות כי קולטן אצטילכולין nicotinic (nAChR) הפעלת VTA גם שולט שחרור DA פאזי ב NAc10,11.
בדיקה מכנית של רגולציה DAphasic נלמד גם בדרך כלל באמצעות תכשירי פרוסה יחד עם יישום אמבטיה של תרופות. מחקרים אלה מתמקדים לעתים קרובות ברגולציה presynaptic של שחרור DAphasic מסופי דופמין, כמו גופי התא מוסרים לעתים קרובות מן הפרוסה12. תכשירים אלה הם בעלי ערך לחקר השפעות קולטן presynaptic על מסופי דופמין, בעוד CIS-FSCV מתאים יותר ללמוד השפעות קולטן סומטונדריטי על נוירונים דופמין, כמו גם תשומות presynaptic ל- VTA. הבחנה זו חשובה, כי הפעלת קולטן somatodendritic ב- VTA עשוי להיות השפעה שונה מאשר הפעלת קולטן פרסינפטי NAc. ואכן, חסימת דופאמין presynaptic nAChRs ב NAc יכול להעלות את שחרור דופמין פאזי במהלך פרץ ירי13, ואילו ההפך נכון VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV היא גישה אידיאלית לחקר היכולת של קולטני VTA לווסת את שחרור DA פאזי. חשוב לציין, גישה זו יכולה להתבצע בחולדה שלמה, או מרדים או לנוע חופשי. גישה זו מתאימה למחקרים חריפים, כדי לחקור את תפקוד הקולטן במצב הבסיסי שלה10,14, כמו גם מחקרים ארוכי טווח שיכולים להעריך שינויים תפקודיים קולטן לאחר חשיפה לסמים או מניפולציה התנהגותית11,15.

<table><tbody><tr><td><חזק>פתרון מילוי אלקטרודות / אספקה < / חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשירי דיוק מיקרופיפטה</td><td>עולמיים</td><td>MF286-5 (מד</td><td></td> 28</tr>) <tr><td>אשלגן אצטט</td><td>סיגמא</td><td>236497-100G</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>P3911-25G</td><td></td></tr><tr><td><אספקת אלקטרודות חזקה>< / חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיבי פחמן</td><td>Thornel</td><td>T650</td><td></td></tr><tr><td>חולץ אלקטרודות</td><td>Narishige International</td><td>PE-22</td><td>הערה: ניתן להשתמש גם במושכים אופקיים כמו גם</td></tr><tr><td>במערכות נימי זכוכית A-M</td><td>626000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חוטים מבודדים לאלקטרודות</td><td>חוט וכבל Weico משולבים</td><td>UL 1423</td><td>אורך; 10 ס"מ; קוטר, 0.4 מ"מ; חייב להיות מותאם אישית; חומר מבודד צריך לכסות 5 ס"מ של החוט</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור (לצפייה וחיתוך אלקטרודה)</td><td>Fischer Scientific</td><td>M3700</td><td></td></tr><tr><td>Pin</td><td>Phoenix Enterprises</td><td>HWS1646</td><td>להלחמה על חוט האלקטרודה המבודד ואלקטרודת הייחוס; מתחבר לראש הבמה</td></tr><tr><td>שפכטל</td><td>אלקולין</td><td><a target="_blank" href="https://www.dickblick.com/items/23922-1003/">23922-1003</a></td><td>משמש להנחת אלקטרודה בעת חיתוך סיבי הפחמן</td></tr><tr><td>להב הקרפל</td><td>World Precision Instruments</td><td>500239</td><td>לחיתוך סיבי פחמן באורך המתאים</td></tr> חוט <tr><td>כסף</td><td>סיגמא</td><td>327026-4G</td><td></td></tr><tr><td><חזק>FSCV חומרה/תוכנה </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faraday כלוב</td><td>U-Line</td><td>H-3618 (36 אינץ' x 24 אינץ' x 42 אינץ')</td><td></td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>Univ. of N. Carolina, מתקן</td><td></td><td></td>אלקטרוניקה</tr><tr><td>מגרה אלקטרודה</td><td>PlasticsOne</td><td>MS303/2-A/SPC</td><td>בעת ההזמנה, בקש חיתוך של 22 מ"מ מתחת לכן</td></tr><tr><td>TarHeel HDCV תוכנה</td><td>אוניברסיטת צפון קרוליינה-צ'אפל היל</td><td>-</td><td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank"> https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> להזמנת מידע</td></tr><tr><td>UEI Breakout Box</td><td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td><td></td><td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank">https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> להזמנה מידע</td></tr><tr><td>אספקת חשמל UEI</td><td>אוניברסיטת צפון קרוליינה, מתקן</td><td></td> אלקטרוניקה<td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank">https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> להזמנת מידע</td></tr><tr><td><חזק>חומרת סטימולטור</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבודד גירוי נוירולוג</td><td>דיגיטימר בע"מ</td><td>DS4</td><td>נוירולוג 800A</td></tr><tr><td><חזק>עירוי/גירוי אספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>משאבת עירוי</td><td>משאבת מזרק עידן חדש</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>צינורית</td><td>פנימית פלסטיק One</td><td>C315I/SPC פנימי 33GA</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוליטר מזרק</td><td>המילטון</td><td>80308</td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td>פלסטיק אחד</td><td>C313CT / חבילה צינורות 023 X 050 PE50</td><td></td></tr> <tr><td><חזק>ציוד כירורגי </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחזיק צינורית</td><td>Kopf מכשירים</td><td>1776 P-1</td><td></td></tr><tr><td>כותנה קצה אפליקטורים</td><td>חיוניות רפואית</td><td>806</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק אלקטרודות</td><td>Kopf Instruments</td><td>1770</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>RT-0501</td><td></td></tr><tr><td>Povidone יוד</td><td>Vitality רפואי</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>ברגים ברגי</td> עיגון עצם <td>סטולינג</td><td>/ חבילה של 100</td><td>1.59 מ"מ OD, אורך 3.2 מ"מ</td></tr><tr><td>חוט כסף התייחסות עם AgCl</td><td>InVivo מטרי</td><td>E255A</td><td></td></tr><tr><td>גזה מרובעת</td><td>Vitality Medical</td><td>441408</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax</td><td>Kopf מכשירים</td><td>דגם 902 (מוט זרוע כפול)</td><td></td></tr><tr><td><חזק>אספקה היסטולוגית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פורמולין</td><td>סיגמא</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח</td><td>BK Precision</td><td>9110</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>80497</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-אלקטרודה טונגסטן</td><td>MicroProbes</td><td>WE30030.5A3</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תרופות לעירויים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>((2R)-חומצה אמינו-5-פוספונובלרית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>N-מתיל-D-אספרטט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>מקמילמין הידרוכלוריד (M9020-5 מ"ג)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M9020</td><td></td></tr><tr><td>סקופולמין הידרוברומיד (S0929-1g)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S0929</td><td></td></tr></tbody></table>

עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (cis-fscv) כדי להעריך ויסות קולטן אזור טגמנטלי גחוני של דופמין פאזי

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

שחרור דופמין פאסיק (DA) מהאזור הטגמנטלי הגחוני (VTA) לגרעין האקומבנס ממלא תפקיד מרכזי בעיבוד תגמול ולמידה חיזוק. הבנת האופן שבו התשומות העצביות המגוונות לתוך שחרור DA פאזי של בקרת VTA יכולה לספק תמונה טובה יותר של המעגלים השולטים בעיבוד תגמול ולמידת חיזוק. כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת חליטות צינוריות פנים-VTA של אגוניסטים ואנטגוניסטים רוקח עם שחרור DA פאזי מעורר גירוי (עירוי וגירוי משולב, או CIS) כפי שנמדד על ידי voltammetry מחזורי סריקה מהירה (FSCV). באמצעות CIS-FSCV בחולדות מרדים, תגובת DAphasic יכול להיות מעורר על ידי גירוי חשמלי VTA עם אלקטרודה דו קוטבית מצוידת צינורית תוך הקלטה בליבת גרעין האקומבנס. אגוניסטים רוקח או אנטגוניסטים ניתן להחדיר ישירות באתר הגירוי כדי לחקור תפקידים ספציפיים של קולטני VTA בנהיגה שחרור DAphasic. היתרון העיקרי של CIS-FSCV הוא כי תפקוד קולטן VTA ניתן ללמוד ב vivo, בניית מחקרים במבחנה.

CIS-FSCV שימש כדי ללמוד את הפונקציה של קולטני VTA N-מתיל-D-אספרטט (NMDAR), קולטני אצטילכולין nicotinic (nAChRs), וקולטנים אצטילכולין muscarinic (mAChRs) בנהיגה שחרור DA פאזי בליבת NAc. איור 2 מציג נתונים מייצגים לשליטה שלילית, עירוי של 0.9% תמיסת מלח, לפני (בסיסי) ו-9 דקות לאחר התפוגגות (מלוחים). איור 2 מציג התוויית צבע עם פוטנציאל בציר ה-y, זמן בציר ה-x וזרם (המיוצג כצבע כוזב) בציר z, עקבות נוכחיות לעומת זמן (IvT), וכן וולטמוגרמ...

המטרה של פרוטוקול זה היא לתפעל ישירות קולטני אזור tegmental גחוני ללמוד את תרומתם לשחרור דופמין תת שנייה.

עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV) כדי להעריך ויסות קולטן אזור טגמנטלי גחוני של דופמין פאזי

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...

גישה זו יכולה לעזור להבהיר את התפקיד של אזור טגמנטלי גחוני ספציפי, קולטנים סומטודנדריטים ושחרור דופמין פאזי בגרעין האקומבנס. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שניתן לטפל בשאלות על שליטה בתפקוד הקולטן על שחרור דופמין פאזי במוח השלם. אופטימיזציה של המיקרו-אלקטרודה של סיבי הפחמן ומיקום הממריץ הדו-קוטבי יכולה להיות מאתגרת, וכמה עצות למתחילים הן להתחיל להקליט בסטריאטום הגבי.בשל השימוש והמניפולציה של מספר סוגים של אלקטרודות, כולל הקלטה, התייחסות ואלקטרודות גירוי, מדריך חזותי של מתי והיכן מושתלות אלקטרודות אלו יהיה שימושי. לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושה, נקה את הקרקפת של חולדה מורדמת עם שלושה קרצוף יודופובידון ו-70% אתנול. לאחר השפשוף האחרון, השתמש בפינצטה מעוקרת לאף מחט ובמספריים כירורגיים כדי לחתוך מספיק רקמת קרקפת כדי לפנות מקום לאלקטרודות המושתלות.נקו בעדינות את משטח הגולגולת החשוף בעזרת אפליקטורים מעוקרים מכותנה לפני מריחת שתיים עד שלוש טיפות של מי חמצן 3% כדי לסייע בזיהוי למבדה וברגמה. לאחר מכן, השתמש במקדח מילימטר אחד המוגדר לכ-20,000 סיבובים לדקה כדי ליצור חור בקוטר 1.5 מילימטר, 2.5 מילימטרים קדמיים ו-3.5 מילימטרים לרוחב הברגמה. השתל בורג בקוטר חיצוני של 1.59 מילימטר ובאורך 3.2 מילימטר בערך באמצע הדרך לתוך החור עד שהבורג נמצא במקומו היטב.לאחר מכן, קדחו חור אלקטרודה ייחוס בקוטר מילימטר אחד בחצי הכדור השמאלי, 1.5 מילימטרים קדמיים ו-3.5 מילימטרים לרוחב הברגמה. הכנס כשני מילימטרים של חוט ייחוס לתוך החור תוך כדי עטיפת החוט סביב ומתחת לראש הבורג המושתל. לאחר מכן השתל את הבורג במלואו, והצמד את אלקטרודת הייחוס למקומה.בחצי הכדור הימני, קדחו חור בקוטר 1.5 מילימטר, 1.2 מילימטרים קדמיים ו-1.4 מילימטרים לרוחב הברגמה, והשתמשו בפינצטה כדי להסיר בזהירות את הדורה. עבור האלקטרודה המגרה, קדחו חור מרובע שני מילימטרים קדמי-אחורי וחמישה מילימטרים מדיאליים-רוחביים שבמרכזו 5.2 מילימטרים אחוריים ומילימטר אחד לרוחב הברגמה. בעזרת מוטות זרוע סטריאוטקטיים, הורד את צינורית מוביל האלקטרודה המגרה הדו-קוטבית חמישה מילימטרים מתחת לדורה.בעזרת מוטות הזרוע הסטריאוטקטיים, הורד את המיקרו-אלקטרודה של סיבי הפחמן ארבעה מילימטרים מתחת לדורה בחלק הגבי ביותר של הסטריאטום וחבר את חוט הייחוס וסיבי הפחמן לפוטנציוסטט. לאחר מכן החל צורת גל משולשת של מינוס 0.4 עד 1.4 וולט, 400 וולט לשנייה למשך 15 דקות ב-60 הרץ, ולאחר מכן גירוי של 10 דקות ב-10 הרץ. כדי לייעל את מיקום האלקטרודה המגרה, הגדר את הסטימולטור לייצר צורת גל חשמלית דו-קוטבית בתדר של 60 הרץ, 24 פולסים, זרם של 300 מיקרו-אמפר ורוחב דופק של שתי אלפיות שנייה לכל פאזה.הורד בעדינות את הסטימולטור במרווחים של 0.2 מילימטר מ-5 עד 7.8 מילימטרים מתחת לדורה, ועורר את ה-VTA בכל תוספת. המשך להוריד את צינורית מנחה האלקטרודה המגרה דו קוטבית עד שגירוי מייצר שחרור דופמין פאזי במיקרו-אלקטרודה של סיבי פחמן בתוך הסטריאטום הגבי. לאחר שנצפה שחרור דופמין, הורד את המיקרו-אלקטרודה של סיבי הפחמן עד שהיא נמצאת לפחות שישה מילימטרים מתחת לדורה לחלק הגבי ביותר של ליבת גרעין האקומבנס.כאשר האלקטרודה נמצאת במקומה, יש לעורר את ה-VTA ולרשום את משרעת השיא של שיא הדופמין, ואז להוריד או להעלות את המיקרו-אלקטרודה של סיבי הפחמן לאתר המייצר את שחרור הדופמין הגדול ביותר, ולוודא ששיא תגובת הדופמין מיוצג כשיא חמצון ברור ב-0.6 וולט ושיא הפחתה במינוס 0.2 וולט. לאחר אופטימיזציה של מיקום הצינורית של סיבי הפחמן והאלקטרודה המגרה, גרו את החיה כל שלוש דקות למשך 20 עד 30 דקות. לאחר השגת קו בסיס יציב, הורד בעדינות את הצינורית הפנימית ביד לתוך צינורית ההנחיה המותקנת מראש בסטימולטור הדו-קוטבי וקבל שתיים עד שלוש הקלטות בסיס נוספות כדי לאשר שהחדרת הצינורית לא גרמה לשינוי באות המעורר.לאחר שנקבעה תגובה בסיסית, השתמש במשאבת מזרק ובמיקרו-מזרק כדי להחדיר 0.5 מיקרוליטר מתמיסת התרופה המעניינת ל-VTA במשך תקופה של שתי דקות. לאחר העירוי, השאירו את הצינורית הפנימית במקומה לפחות דקה אחת לפני ההסרה, והמשיכו לתעד את התגובה כל שלוש דקות כדי למדוד את ההשפעות שלאחר העירוי. כפי שמודגם בעלילות הצבע המייצגות הללו, עירוי מי מלח אינו משנה את שחרור הדופמין הפאזי המגורה.עירוי של NMDA מייצר עלייה חזקה בשחרור דופמין פאזי מגורה, בעוד שהאנטגוניסט התחרותי של קולטן NMDA, AP5, מייצר ירידה חזקה. גם אנטגוניסט קולטן אצטילכולין ניקוטיני לא תחרותי מקמילאמין וגם אנטגוניסט קולטן אצטילכולין מוסקריני תחרותי לא סלקטיבי סקופולמין מייצרים ירידה חזקה בשחרור הדופמין הפאזי המגורה. בגרף זה ניתן לראות סיכום של השפעות התרופות שנבדקו לאורך זמן.יש להכניס בזהירות את צינורית העירוי לאלקטרודה המגרה הדו-קוטבית. אחרת, עלול להתרחש נזק מוגזם, מה שמוביל לשינויים מלאכותיים בשחרור הדופמין הפאזי. גישה זו אפשרה לחוקרים לטפל בצורה עדינה יותר במנגנוני הקולטנים הספציפיים שבאמצעותם מווסת שחרור דופמין פאזי in vivo.

combined-infusion-stimulation-with-fast-scan-cyclic-voltammetry-cis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

חדש אמצעים למדוד עצבית אופטית באמצעות תחליפי דופמין ניאון.

שחרור הדופמין ב מסופי Presynaptic הפרט דמיינו עם FFNs

שימוש מהיר סריקה מחזורית voltammetry למדוד עורר חשמלית הדינמיקה דופמין presynaptic ב striatal פרוסות המוח.

דופמין Dynamics Presynaptic בתוך פרוסות המוח striatal עם Voltammetry סריקה מהירה מחזורי

סרטון זה מדגים השתלת אלקטרודות וצינוריות בחולדה מורדמת כדי למדוד שחרור דופמין בגרעין האקומבנס באמצעות פוטנציוסטט ועירוי תרופות לוויסות הפעילות הדופמינרגית באזור הטגמנטל הגחוני.

ניטור שחרור דופמין במודל חולדה באמצעות מניפולציה של קולטן נוירונים דופמינרגיים VTA

תנודות מהירות בדופמין חוץ-תאי (DA) מתווכות הן את עיבוד התגמול והן את ההתנהגות המונעת ביונקים. כתב יד זה מתאר את השימוש המשולב בוולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה (FSCV) ובמתן טסטנט תוך-אוראלי כדי לקבוע כיצד טסטנטים משנים שחרור מהיר של דופמין בחולדות ערות ונעות בחופשיות.

בחינת המהירה דופמין Dynamics עם הסריקה מהירה Voltammetry המחזורי במהלך פנים הפה Tastant מנהל בחולדות ערה

במהירות voltammetry מחזורית לסרוק יכול לפקח על וירו דופאמין נוירוטרנסמינציה בהקשר של סמים, מחלות, מניפולציות ניסיוניות אחרות. עבודה זו מתארת ​​את יישום QNsim1.0, תוכנה לעיצוב תגובות דופמין מגורה חשמלית על פי המודל הנוירוביולוגי כמותי לכמת הערכות של שחרור דופאמין ודינמיקה reuptake.

דוגמנות מהירה סריקה מחזורית Voltammetry נתונים מ חשמלית חשמלית דופמין ניטור נתונים באמצעות QNsim1.0

במאמר זה, נבחן את המתודולוגיה שיקולים רלוונטיים שילוב של TMS ו-fMRI לבחון את ההשפעות של גירוי המוח ברשת מחדל.

שילוב של גירוי מגנטי fMRI Transcranial ולבחון את רשת מצב ברירת מחדל

במאמר זה, נבחן את ההשפעות של גירוי TMS תטא-Burst על הפלסטיות קליפת המוח אצל אנשים הסובלים מתסמונת ה-X השביר ויחידים על הספקטרום האוטיסטי.

TMS: שימוש בפרוטוקול תטא-Burst לחקור Mechasnism של פלסטיות של אנשים עם תסמונת X שביר אוטיזם ו

ממשק האלקטרודה, רקמות של אלקטרודות הקלטה עצביים ניתן לאפיין עם ספקטרוסקופית עכבה חשמלית (EIS) ו voltammetry מחזורית (CV). יישום יכולת הקלטה מתח הטיית שינויים במאפייני אלקטרוכימיים של ממשק אלקטרודה-רקמות והוא יכול להשתפר. מתח הטיית, EIS, קורות חיים, הקלטות עצביים משלימים.

הטיית מתח, Voltammetry מחזורי, &amp; ספקטרוסקופיה חשמל התנגדות עבור ממשקי עצביות

טכניקת amperometric מודדת שחרור דופאמין מתא בודד על ידי גילוי נוכחי חמצונים המיוצרים על ידי חמצון דופמין ספונטני. מהדק המתח סימולטני ומתודולוגיה amperometry לחשוף את מערכת היחסים בין מכניסטית "הפעילות" הכוללת של טרנספורטר דופאמין ותפקיד הרגולציה של פעילות זו על ההובלה ההפוכה של דופמין.

מדידת תא בודדה של שחרור דופמין במתח-clamp וAmperometry סימולטני

דופאמין הוא מוסדר בבירור בגרעין המוח התיכון, אשר מכילים תאים הגופות דנדריטים של נוירונים דופאמין. כאן נתאר את הגישה לנתיחה ו מדגם הטיפול על מנת למקסם את התוצאות, ולכן מסקנות ותובנות, על ויסות הדופמין בגרעין המוח התיכון של nigra substantia (SN) ואזור tegmental הגחוני (VTA) במכרסמים.

פרופיל מקיף של הסדרת substantia nigra הדופמין ואזור Tegmental הגחון

חקור ויסות קולטנים באזור טגמנטלי גחוני (VTA) והשפעתם על שחרור דופמין פאזי בגרעין האקומבנס בחולדות. השיטה משלבת עירוי וגירוי עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV) כדי לבחון מנגנוני קולטנים במוח שלם.

עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV) כדי להעריך ויסות קולטן אזור טגמנטלי גחוני של דופמין פאזי

גלה סרטונים נוספים