עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV) כדי להעריך ויסות קולטן אזור טגמנטלי גחוני של דופמין פאזי
23 באפריל 2020
המטרה של פרוטוקול זה היא לתפעל ישירות קולטני אזור tegmental גחוני ללמוד את תרומתם לשחרור דופמין תת שנייה.
גישה זו יכולה לעזור להבהיר את התפקיד של אזור טגמנטלי גחוני ספציפי, קולטנים סומטודנדריטים ושחרור דופמין פאזי בגרעין האקומבנס. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שניתן לטפל בשאלות על שליטה בתפקוד הקולטן על שחרור דופמין פאזי במוח השלם. אופטימיזציה של המיקרו-אלקטרודה של סיבי הפחמן ומיקום הממריץ הדו-קוטבי יכולה להיות מאתגרת, וכמה עצות למתחילים הן להתחיל להקליט בסטריאטום הגבי.
בשל השימוש והמניפולציה של מספר סוגים של אלקטרודות, כולל הקלטה, התייחסות ואלקטרודות גירוי, מדריך חזותי של מתי והיכן מושתלות אלקטרודות אלו יהיה שימושי. לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושה, נקה את הקרקפת של חולדה מורדמת עם שלושה קרצוף יודופובידון ו-70% אתנול. לאחר השפשוף האחרון, השתמש בפינצטה מעוקרת לאף מחט ובמספריים כירורגיים כדי לחתוך מספיק רקמת קרקפת כדי לפנות מקום לאלקטרודות המושתלות.
נקו בעדינות את משטח הגולגולת החשוף בעזרת אפליקטורים מעוקרים מכותנה לפני מריחת שתיים עד שלוש טיפות של מי חמצן 3% כדי לסייע בזיהוי למבדה וברגמה. לאחר מכן, השתמש במקדח מילימטר אחד המוגדר לכ-20,000 סיבובים לדקה כדי ליצור חור בקוטר 1.5 מילימטר, 2.5 מילימטרים קדמיים ו-3.5 מילימטרים לרוחב הברגמה. השתל בורג בקוטר חיצוני של 1.59 מילימטר ובאורך 3.2 מילימטר בערך באמצע הדרך לתוך החור עד שהבורג נמצא במקומו היטב.
לאחר מכן, קדחו חור אלקטרודה ייחוס בקוטר מילימטר אחד בחצי הכדור השמאלי, 1.5 מילימטרים קדמיים ו-3.5 מילימטרים לרוחב הברגמה. הכנס כשני מילימטרים של חוט ייחוס לתוך החור תוך כדי עטיפת החוט סביב ומתחת לראש הבורג המושתל. לאחר מכן השתל את הבורג במלואו, והצמד את אלקטרודת הייחוס למקומה.
בחצי הכדור הימני, קדחו חור בקוטר 1.5 מילימטר, 1.2 מילימטרים קדמיים ו-1.4 מילימטרים לרוחב הברגמה, והשתמשו בפינצטה כדי להסיר בזהירות את הדורה. עבור האלקטרודה המגרה, קדחו חור מרובע שני מילימטרים קדמי-אחורי וחמישה מילימטרים מדיאליים-רוחביים שבמרכזו 5.2 מילימטרים אחוריים ומילימטר אחד לרוחב הברגמה. בעזרת מוטות זרוע סטריאוטקטיים, הורד את צינורית מוביל האלקטרודה המגרה הדו-קוטבית חמישה מילימטרים מתחת לדורה.
בעזרת מוטות הזרוע הסטריאוטקטיים, הורד את המיקרו-אלקטרודה של סיבי הפחמן ארבעה מילימטרים מתחת לדורה בחלק הגבי ביותר של הסטריאטום וחבר את חוט הייחוס וסיבי הפחמן לפוטנציוסטט. לאחר מכן החל צורת גל משולשת של מינוס 0.4 עד 1.4 וולט, 400 וולט לשנייה למשך 15 דקות ב-60 הרץ, ולאחר מכן גירוי של 10 דקות ב-10 הרץ. כדי לייעל את מיקום האלקטרודה המגרה, הגדר את הסטימולטור לייצר צורת גל חשמלית דו-קוטבית בתדר של 60 הרץ, 24 פולסים, זרם של 300 מיקרו-אמפר ורוחב דופק של שתי אלפיות שנייה לכל פאזה.
הורד בעדינות את הסטימולטור במרווחים של 0.2 מילימטר מ-5 עד 7.8 מילימטרים מתחת לדורה, ועורר את ה-VTA בכל תוספת. המשך להוריד את צינורית מנחה האלקטרודה המגרה דו קוטבית עד שגירוי מייצר שחרור דופמין פאזי במיקרו-אלקטרודה של סיבי פחמן בתוך הסטריאטום הגבי. לאחר שנצפה שחרור דופמין, הורד את המיקרו-אלקטרודה של סיבי הפחמן עד שהיא נמצאת לפחות שישה מילימטרים מתחת לדורה לחלק הגבי ביותר של ליבת גרעין האקומבנס.
כאשר האלקטרודה נמצאת במקומה, יש לעורר את ה-VTA ולרשום את משרעת השיא של שיא הדופמין, ואז להוריד או להעלות את המיקרו-אלקטרודה של סיבי הפחמן לאתר המייצר את שחרור הדופמין הגדול ביותר, ולוודא ששיא תגובת הדופמין מיוצג כשיא חמצון ברור ב-0.6 וולט ושיא הפחתה במינוס 0.2 וולט. לאחר אופטימיזציה של מיקום הצינורית של סיבי הפחמן והאלקטרודה המגרה, גרו את החיה כל שלוש דקות למשך 20 עד 30 דקות. לאחר השגת קו בסיס יציב, הורד בעדינות את הצינורית הפנימית ביד לתוך צינורית ההנחיה המותקנת מראש בסטימולטור הדו-קוטבי וקבל שתיים עד שלוש הקלטות בסיס נוספות כדי לאשר שהחדרת הצינורית לא גרמה לשינוי באות המעורר.
לאחר שנקבעה תגובה בסיסית, השתמש במשאבת מזרק ובמיקרו-מזרק כדי להחדיר 0.5 מיקרוליטר מתמיסת התרופה המעניינת ל-VTA במשך תקופה של שתי דקות. לאחר העירוי, השאירו את הצינורית הפנימית במקומה לפחות דקה אחת לפני ההסרה, והמשיכו לתעד את התגובה כל שלוש דקות כדי למדוד את ההשפעות שלאחר העירוי. כפי שמודגם בעלילות הצבע המייצגות הללו, עירוי מי מלח אינו משנה את שחרור הדופמין הפאזי המגורה.
עירוי של NMDA מייצר עלייה חזקה בשחרור דופמין פאזי מגורה, בעוד שהאנטגוניסט התחרותי של קולטן NMDA, AP5, מייצר ירידה חזקה. גם אנטגוניסט קולטן אצטילכולין ניקוטיני לא תחרותי מקמילאמין וגם אנטגוניסט קולטן אצטילכולין מוסקריני תחרותי לא סלקטיבי סקופולמין מייצרים ירידה חזקה בשחרור הדופמין הפאזי המגורה. בגרף זה ניתן לראות סיכום של השפעות התרופות שנבדקו לאורך זמן.
יש להכניס בזהירות את צינורית העירוי לאלקטרודה המגרה הדו-קוטבית. אחרת, עלול להתרחש נזק מוגזם, מה שמוביל לשינויים מלאכותיים בשחרור הדופמין הפאזי. גישה זו אפשרה לחוקרים לטפל בצורה עדינה יותר במנגנוני הקולטנים הספציפיים שבאמצעותם מווסת שחרור דופמין פאזי in vivo.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול למניפולציה של רצפטורים באזור הטגמנטלי הגבאי (VTA) על מנת לחקור את תפקידם בשחרור דופמין בטווח של פחות משנייה. המיקוד הוא בהבנת רצפטורים סומטודנדריטיים ספציפיים והשפעתם על שחרור דופמין פאזי בתוך הגרעין האקומבנס. גישה זו מאפשרת בחינה של תפקוד רצפטורים במודל של מוח שלם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- מדעי המוח
- סיגנלינג של דופמין
רקע
- האזור הטגמנטלי הגבאי (ventral tegmental area) חיוני לוויסות שחרור דופמין.
- הבנת מנגנוני הקולטנים היא מפתח להבהרת התנהגויות הקשורות לדופמין.
- המחקר שואף לבצע מניפולציה של קולטנים כדי להעריך את תפקודם in vivo.
- אתגרים במיקום ובקונפיגורציה של האלקטרודות מוכרים.
מטרת המחקר
- לבחון את תפקידם של רספטורים ספציפיים ב-VTA בדינמיקת שחרור הדופמין.
- לספק תובנות לגבי תפקוד הרספטורים בתוך סביבה של מוח שלם.
- לדייק את השיטות לאופטימיזציה של מיקום האלקטרודות לצורך גרייה והקלטה יעילות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות מיקרו-אלקטרודות מסיב פחמן במודלים של חולדות.
- המחקר משתמש בהשתלה של אלקטרודות הקלטה וגירוי ב-VTA ובאזורים סביבו.
- שלבים חשובים כוללים פרוצדורות כירורגיות קפדניות כדי למזער נזק לרקמת המוח.
- פרוטוקולי הגירוי פורטו, תוך התמקדות בצורות גל ובתדרים חשמליים לצורך מדידת שחרור דופמין.
תוצאות עיקריות
- נצפתה שחרור דופמין פאזי, אשר הושפע ממניפולציה של רצפטורים.
- עירוי של NMDA הגביר את שחרור הדופמין, בעוד שנוגדים (antagonists) כגון AP5 ו-mecamylamine הפחיתו אותו.
- הוקלטו שיאים (spikes) כמותיים ברורים בתגובת הדופמין, המאפיינים השפעות ספציפיות לרצפטור.
- המחקר מתקף את השיטה למניפולציה ותצפית יעילה של דינמיקת הדופמין.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק מסגרת להערכת השפעות קולטנים על שחרור דופמין in vivo.
- הוא משפר את ההבנה של המכניזמים הנוירונליים העומדים בבסיס איתות הדופמין.
- להשלכות על חקר ההתמכרויות והנוירופרמקולוגיה יש משמעות ניכרת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת בחינה ישירה של הבקרה המתווכת-רצפטורים על שחרור דופמין פאזי in vivo, ובכך מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית לתיקוף מטרות בתגליות של תרופות נוירו-פסיכיאטריות. על ידי קישור תפקוד הרצפטורים ב-VTA לדינמיקה מדידה של דופמין בגרעין האקומבנס (nucleus accumbens), היא תומכת בביטחון חיזוי בבדיקת השערות טיפוליות בשלבים מוקדמים. הגישה מגשרת בין פרמקולוגיה של רצפטורים in vitro לבין פיזיולוגיה של מוח שלם, ובכך משפרת את הרצף התרגומי עבור מטרות במסלול התגמול.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את הבקרה של רצפטורים סומטודנדריטיים על שחרור פאזי של דופמין כדי לתקף מטרות טיפוליות in vivo.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית ספציפית לרצפטור באמצעות אגוניסטים ואנטגוניסטים פרמקולוגיים במעגלי מוח שלמים.
- ערך ניבוי: מכמת שינויים בשחרור דופמין כדי לתמוך בביטחון במטרה ובקבלת החלטות לגבי תיעדוף הפורטפוליו.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות המשך, תוך שימוש בשחרור דופמין המושרה על ידי גירוי כמדד כמותי.
- ערך תפעולי: ביסוס תנאי הקלטה הניתנים לשחזור המבוססים על אלקטרודות, להערכה עקבית של תרכובות בין מחקרים שונים.
- סקילביליות (יכולת הרחבה): תמיכה בשימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת מודולטורים של קולטנים מרובים באותו מודל חיה.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: מקשרת בין תיקוף רספטורים בשלב הגילוי לרציפות פרה-קלינית באמצעות סיגנלינג דופמין פאזי רלוונטי למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהירה את התרומות הספציפיות של רספטורים לשחרור דופמין, ובכך מפחיתה את העמימות לגבי מנגנון הפעולה של המטרה.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת מידע להחלטות go/no-go בהתבסס על השפעות מתווכות רספטורים על דינמיקת דופמין פאזית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל, על ידי אספקת תוצאות פונקציונליות של פעילות הקולטן על שחרור דופמין.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקוד קולטנים בבקרת דופמין פאזית באמצעות הזרקה וגירוי ישירים ל-VTA.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות תגובות דופמין בקו בסיס יציב והשפעות ניתנות לכימות לאחר ההזרקה.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של אמפליטודת שיא הדופמין ושיאי חמצון-חיזור כתוצרים כמותיים להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מתחבר לעבודה פרה-קלינית על ידי תיקוף מנגנוני קולטנים במודלים של מוח שלם הרלוונטיים לעיבוד תגמול.
- שימוש חוזר ארגוני: מציב את מערך השתלת האלקטרודות וההקלטה כיכולת ניתנת לשימוש חוזר עבור מספר מטרות של קולטנים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזויי בתיקוף המטרה על ידי קישור מניפולציה של רצפטורים לדינמיקת שחרור דופמין.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות אופטימיזציה של מיקום האלקטרודות ופרוטוקולי הגירוי.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכונים מכניסטית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על השפעות ספציפיות לרצפטור על איתות דופמין פאזי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח סטריאוטקטי, אלקטרופיזיולוגיה וטיפול במיקרו-אלקטרודות מסיבי פחמן.
- תלוי בפוטינציוסטט, מוטות של זרוע סטריאוטקטית ומשאבת מיקרו-מזרק לבקרת עירוי וגירוי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של קואורדינטות השתלת האלקטרודות ופרמטרי הגירוי.
- כולל שיקולי התאמה למיקוד בתתי-אזורים שונים של המוח מעבר למסלול VTA-nucleus accumbens.
- מוגבל על ידי נזק רקמתי פוטנציאלי כתוצאה ממניפולציה של האלקטרודות, שעלולה לשנות באופן מלאכותי את אותות הדופמין אם לא תבצע אופטימיזציה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Electrode Implantation
3:12
Carbon Fiber and Stimulating Electrode/Guide Cannula Location Optimization
4:26
Combination Infusion and Stimulation Fast-Scan Cyclic Voltammetry (FSCV) Recording
5:18
Results: Representative Analyses of Stimulation-Evoked Phasic Dopamine Release
6:03
Conclusion
