פשוט ליתוגרפיה-ללא מיקרוהדפס תא יחיד באמצעות סטנסילים לייזר לחתוך

נתאר שיטת מיקרופטרן חד-תאית נטולת סטנסיל, המתגברת על מכשולים רבים הקשורים לפוטוליתוגרפיה וליתוגרפיה רכה. סטנסילים הם לשימוש חוזר ואת התהליך הוא זול להתאמה אישית. שיטה זו פתחה שדרה חדשה לחוקרים שאינם מהנדסים לחקור את צורת התא ואת mechanotransduction הנגרמת על ידי האזור בהקשרים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים.

יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר micropatterning של אלפי תאים אשר ניתן להשתמש בהם עבור הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה ומידול מחלות בצלחת. הדגמה חזותית תקל על ההשתלה של שני שלבים מכריעים: ניתוק של כיסוי מהידרוגל, ייבוש הידרוג'ל מספיק לפני הנחת הסטנסיל. הכינו את פתרון ההידרוגל פוליאקרילמיד בצינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר כפי שמתואר בכתב היד.

לאחר מכן, כדי להכין את הפתרון פוטואיניטאטור 5%, להמיס את החומרים 700 microliters של 100% אתנול. המרכיבים אינם מסיסים במים ולכן הקפד להתמוסס לחלוטין על ידי מערבולת. הוסף 300 microliters של PBS עבור נפח סופי של מיליליטר אחד.

עבודה על קרח, לדלל את פתרון מלאי חלבון מטריצת קרום המרתף עם קר כקרח DMEM F12 מדיה או 1X PBS ליחס דילול אופטימיזציה. שמור על קרח לשימוש מאוחר יותר. כאשר עובדים עם מטריצת קרום מרתף, הקפד תמיד לעבוד על קרח ולהשתמש פתרונות קרים כקרח טיפים צינורות מצוננים.

מניחים מנורת ספסל UV במכסה בטיחות ביולוגי. לאחר מכן, מקם את סרטי הפרפין הסטריליים שהוכנו בעבר. אם סרטי הפרפין אינם יבשים לחלוטין, השתמשו במערכת שאיפת ואקום להסרת כל נוזל שיורית.

באמצעות מלקחים autoclaved, למקם שישה כיסויים autoclaved על הסרט פרפין שש בכל צלחת פטרי. כדי להכין את הפתרון הסופי פוליאקרילמיד UV cross-linkable, לדלל את פתרון photoinitiator עם פתרון מבשר הידרוג'ל polyacrylamide. לעקר את הפתרון באמצעות יחידת סינון 50 מיליליטר עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.

ואז לוותר על 200 microliters של פתרון סופי פוליאקרילמיד UV cross-linkable על כל אחד מששת כיסויי זכוכית במנות פטרי. באמצעות מלקחים אוטומטיים, מכסים בזהירות כל כיסוי עם כיסוי שני לוכד שכבה של הפתרון בין שני כיסויים. מניחים את מנות פטרי המכילות את הכיסויים מתחת למנורת ספסל UV עם המכסה לא סגור.

הכיסוי של נייר לבן על המשטח הלא לבן חשוב כדי למזער את אובדן עוצמת UV. להגנה מפני קרינת UV, לכסות את המנורה עם רדיד אלומיניום. צלם את הפוליאקרילמיד הידרוג'ל במשך חמש דקות.

השתמש בסכין גילוח כדי להפריד בזהירות כל זוג כיסויים. מלאו את המאגר המכיל שישה מרוכבים של כיסויי הידרוג'ל עם PBS. לאחר שטיפה במשך חמש דקות, להחזיר את מרוכבים מכסה הידרוג'ל לסרט פרפין בצלחת פטרי.

להשיג צינור של סולפו-SANPAH מאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. מוסיפים לצינור 1,200 מיקרוליטר של PBS מקורר מראש ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. לוותר על 200 מיקרוליטרים של סולפו-SANPAH מדולל על סרט הפרפין בצלחת פטרי.

מניחים כיסוי רחפת מרוכב מעל סולפו-SANPAH עם הידרוג'ל יצירת קשר עם Sulfo-SANPAH. לאחר מכן, מניחים את מרוכבים מכסה הידרוג'ל מתחת למנורת UV ולחשוף אותם במשך חמש דקות כדי להפעיל את Sulfo-SANPAH. אם Sulfo-SANPAH הופך מכתום לחום המציין הפעלה ושילוב מוצלחים, המשך לשלבים הבאים תוך 10 דקות.

לחדש את מאגר פוליפרופילן חד פעמי עם PBS טרי. מעבירים את מרוכבי ההידרוגל המופעלים למאגר ושטיפתם לזמן קצר כדי להסיר סולפו-SANPAH לא מאוגד. מניחים את מרוכבים מכסה הידרוג'ל על סרט פרפין במנות פטרי בזהירות לטבול אותם עם מגבונים סטריליים ללא מוך.

מניחים שבלון על גבי כל מרוכב כיסוי הידרוג'ל. כדי להבטיח אטם הדוק בין הסטנסיל לבין מרוכבים, להסיר לחות עודפת על ידי dabbing עם מגבונים אוטומטיים ללא מוך. מחלקים בזהירות את פתרון חלבון מטריצת הממברנה המדולל במרתף ומניחים 200 מיקרוליטרים על גבי כל מרוכב כיסוי הידרוג'ל.

דגירה המבנים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, להעביר את המשולבים לצלחת שש בארות. חותם הדוק בין הידרוג'ל לסטנסיל יכול להיות מאומת בקלות על ידי התבוננות אם פתרון חלבון מטריצה נשמר על גבי הסטנסיל.

כישלון ליצור חותם הדוק מוביל לדליפה מהירה של פתרון החלבון דרך החורים. טבילה מלאה של המרוכבים ב- PBS. באמצעות פינצטה אוטוקלאבת, נתק בזהירות את ההידרוגלים מבלי לקרוע את ההידרוגלים.

הסר את ה- PBS מה בארות ומילוי מחדש של בארות עם DMEM. דגירה הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הצלחת מהחממה, בדקו את ה- DMEM.

אם ה- DMEM אינו מעונן, מרוכבים מכסה הידרוג'ל מוכנים לשימוש עבור ציפוי תאים. סטנסילים היו מפוברקים המכילים מערכים של ריבועים ומלבנים. מצעים הידרוג'ל micropatterned נוצרו מן stencils ואיים של חלבון מטריקס הושגו.

כמו כן הושגו איים סלולריים. לדוגמה, איים של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם. ריכוז חלבון מטריקס שיחק תפקיד חיוני ביצירת דפוסים נאותים.

ריכוז אופטימלי הוביל להפצה הומוגנית של חלבונים. ריכוזי תמצית חלבון מטריצה תת אופטימלית הובילו לדפוסים תת-אופטימליים. זה קריטי להשתמש בצד הקדמי של הסטנסיל.

אם נעשה שימוש בצד האחורי של הסטנסיל, גודל איי החלבון מטריקס עולה בשל הכיוון של חיתוך הלייזר. בעוד שהשימוש בצד האחורי של הסטנסיל לא השפיע באופן משמעותי על רוחב הדפוסים המלבניים, הגובה גדל באופן משמעותי והוביל לירידה ביחס הגובה-רוחב המיועד. תבנית מבוססת סטנסיל הוחלה על מצעי אלסטומר סיליקון.

קרדיומיוציטים בדוגמת על מצעים אלסטומר סיליקון היו דמיינו על ידי אימונוציטוכימיה של טרופונין לב T בהגדלה נמוכה ועל ידי חלבון סרקומרי אלפא-actinin בהגדלה גבוהה. התבניות המבוססות על סטנסיל הוחלו גם על תבנית שני קרדיומיוציטים זה לצד זה על הידרוג'לים עם נוקשות שונה. הגילוי של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם ופרוטוקולי בידול תואמים הפכו את זה למודל אנושי במבחנה אידיאלי לחקר אונקוגנזה ופתוגנזה.

עם זאת, מגבלה עיקרית של שימוש במערכת IPS היא היעדר מבנה למיקרו-וירוס שיש לו הרכב ביוכימי מסוים ונוקשות לאינטראקציה עם תאים. התבניות יכולות להיות משולבות עם מיקרוסקופ כוח המתיחה ו בדיקות אימונוציטוכימיה כדי לאפיין את המבנה והתפקוד של הקרדיומיוציטים. ניתוח של סוגי תאים שמקורם ב- IPS, במקרה שלנו קרדיומיוציטים, במורפולוגיה פיזיולוגית יותר פותח הזדמנויות ללמוד קרדיומיוציטים מאתגרים בצלחת התרבות.

הטכניקה יכולה להיות מיושמת גם על מערכות רבות אחרות כגון לוחות הקרנה תוכן גבוה. ניתן להתאים את הצורה והמצע בקלות ליישום.