הרכבה ואפיון של מטלות מורכבות פוליאלקטרוליט
2 במרץ 2020
אנו מספקים פרוטוקולים ונתונים מייצגים עבור עיצוב, הרכבה, ואפיון מיקרו מורכבות מורכבים, חלקיקים ליבה פגז שנוצרו על ידי פוליאלקטרוליטים וטעונה הידרופילי מחויב לחסום הסופולימרים.
שיטה זו מתארת את הנתיב המלא של העיצוב, ההרכבה והאפיון של מיקלים מורכבים פוליאלקטריטיים שהם חלקיקים שנוצרו מהרכבה עצמית של פולימרים טעונים הפוך. כמה אתגרים עיקריים עם הרכבה עצמית polyelectrolyte הם הימנעות מלכודות קינטיות ואפיון חלקיקים. טכניקת חישול המלח שאנו מתארים מאפשרת הרכבה חוזרת של micelles עם פיזור נמוך הן בגודל והן בצורה ואנחנו מתארים שיטות אפיון כולל פיזור אור, פיזור רנטגן בזווית קטנה, מיקרוסקופ אלקטרונים.
אספקת חומצות גרעין טיפוליות היא אתגר ארוך שנים עבור ננו-רפואי. מיצלים מורכבים פוליאלקטרוליט אלה מנצלים את המטען השלילי החזק של חומצת הגרעין כדי לרווח אותם בליבת המקל שבו קורונה פולימרית ניטרלית מגנה עליהם מפני גרעינים ותגובה חיסונית. שיטת ההרכבה צריכה להיות ישימה לכל סוג של פולימרים טעונים.
בדקנו אותם עם כמה פוליאנים ופוליאקציות ושיטת האפיון צריכה להיות ישימה לכל חלקיקים בהרכבה עצמית כולל חלקיקים פעילי שטח ומערכות אחרות מונחות הידרופוביות. התחל על ידי דגירה פתרון oligonucleotide ב 70 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, לקרר אותו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי anneal תרמית את חומצות הגרעין, ולאחר מכן להוסיף 40 microliters של 20 מילימולאר טעון ריכוז diblock copolymer.
Vortex הפתרון באופן מיידי להדרגר אותו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כדי לבצע את המלח anneal, להוסיף פתרון נתרן כלורי תספורת oligonucleotide לריכוז סופי של טוחנת אחת ומערבולת זה במשך 10 שניות במהירות המרבית. הדגירה את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להמשיך עם טעינת אותו לתוך מחסנית דיאליזה.
לפני הטעינה, מחסניות תווית עם סמן קבוע להשרות אותם במאגר לפחות שתי דקות כדי לחות את הממברנות. הסר את המכסה על ידי פיתול נגד כיוון השעון וטען את הדגימה באמצעות קצה צינור טעינת ג'ל. לסחוט בעדינות את הממברנה כדי להסיר אוויר עודף ולהחליף את המכסה.
שים את המחסניות לתוך 1X PBS 0.5 דיאליזה נתרן כלורי טוחנת לוודא שהם צפים עם שני הממברנות חשופים לאמבטיה. לאחר 24 שעות, מעבירים את המחסניות ל-PBS 1X ומשרים אותן למשך 24 שעות נוספות. לאחר הדיאליזה הסופית, לשחזר את הדגימה על ידי הסרת המחסניות מהאמבטיה, הסרת המכסה והסרת המדגם עם קצה פיפטה טעינת ג'ל.
מניחים את הדגימה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי 1.5 מיליליטר ומקררים אותו עד מוכן לשימוש. הכן את המדגם בכלי DLS בהתאם לכיווני כתב היד, ולאחר מכן רכוש נתונים למשך דקה אחת לפחות כדי לוודא שקצב הספירה קבוע לאורך כל זמן הרכישה. בדוק את נתוני התיקון האוטומטי.
בסיס הזמן הארוך צריך להיות שטוח ועקומות התיקון האוטומטי צריכות להיות חלקות עם פיזור מינימלי. ניתן לשפר את הרעש בנתונים על-ידי השגת נתונים נוספים. כדי לבצע הפחתת נתונים וניתוח באמצעות אירנה, התחל על-ידי ייבוא מיקלה בערכות נתונים ברקע.
התווה את הדוגמה והרקע יחד בסולם יומן רישום ושכפל את המדגם ליחס רקע ואמת את האסימפטוטה הגבוהה של Q. מחשב את היחס הממוצע בטווח Q זה ולהשתמש במאקרו טיפול בנתונים כדי לשנות את קנה המידה של הרקע עם היחס המחושב. לאחר מכן התווה את האות המחסיר ברקע על Q ושמור את הנתונים בשם חדש כדי לוודא שלא להחליף את הנתונים המקוריים.
פתח את מאקרו מידול ולאחר מכן טען והתוות את הנתונים המופחתים ברקע. כדי למצוא מודל משוער עבור המשטח החיצוני של micelle מורכב polyelectrolyte, או PCM, בחר זרימה לטווח Q מתון בפקדי הנתונים הקפדה לכלול תנודות אם הם קיימים. בפקדי מודל, בחר את האוכלוסיה המתפזרת הראשונה וודא שהיא היחידה בשימוש.
בחר התפלגות גודל עבור מודל, בחר את סוג ההפצה הרצוי ובחר את מ פקטור הטופס. דוגמה זו היא עבור גליל גמיש אשר יש להוסיף באופן ידני תחת גורם הטופס של המשתמש. הורד והוסף את גורם הצורה הגמיש של הצילינדר, ולאחר מכן הזן את שמות הפונקציות והערכים ההתחלתיים עבור פרמטרים 1 ו- 2 התואמים לאורך הצילינדר ואורך קון בהתאמה.
צילינדרים אלה ארוכים יותר ממה שניתן לפתור על ידי SAXS כך הפרמטר אורך הצילינדר קבוע בערך גדול. הגדר פרמטרים התחלתיים עבור החיפוש על-ידי הזנת ערכים בשדות קנה המידה, הגודל הממוצע והרוחב. לאחר מכן לחץ על חשב מודל כדי לצייר את גורם הצורה שנוצר.
לאחר שנמצאו פרמטרים סבירים, לחץ על התאם מודל כדי לבצע ריבועים פחות ליניאריים המתאימים לנתונים. לאחר מכן, דגם את פיזור הפולימרים הבודדים בליבת PCM. התאם את פקדי הנתונים כדי לבחור את טווח ה- Q שבו מתרחש פיזור עודף שהוא בדרך כלל בטווח בינוני עד גבוה.
הוסף אוכלוסייה פיזור שנייה וודא שהוא היחיד בשימוש. בחר רמה מאוחדת עבור המודל, התאם את גורמי GDA G ו- RG כדי להבטיח שהמודל לא ינבז פיזור מוגזם ב- Q נמוך וישתמש במאקרו PB מתאים בין סמנים כדי לקבל ניחוש ראשוני עבור פרמטרים אלה. באשר למדרגת הטופס, בצע התאמה לא ליניארית עבור מודל הרמה המאוחדת.
אם קיים שיא דיפוזיה, הוסף דגם שלישי עבור שיא ההיפזרות בטווח הריבית Q. לאחר שהושגו ערכי התאמה משוערים עבור אוכלוסיות פיזור בודדות, הפעל את כל השלושה יחד וייעל את הערכה המשולבת. לבסוף, ודא שכל ערך נשאר סביר פיזית ושמור את החנות בתיקיה.
התוצאה של הליך זה צריכה להיות מודל מורכב המתאר את זווית רנטגן קטנה פיזור נתונים היטב על פני מגוון גדול של סולמות גודל. פרוטוקול זה שימש לתכנן, להרכיב, ולאפיין חומצת גרעין polyelectrolyte מורכב micelles או PCMs. גודל הליבה Micelle מונע בעיקר על ידי אורך הבלוק טעון של קופולימר בלוק והוא עצמאי במידה רבה של אורך homopolymer.
נתוני פיזור אור דינמי נרכשו עבור PCMs כדוריים שנוצרו מ copolymers בלוק ארוך יחסית ב אוליגונוקלאוטידים חד-תקע קצר. פונקציית התיקון האוטומטי נרקבה לערך שטוח כאשר סרגל הזמן הבודד גרם לשיא הגודל הבודד בהתפלגות גודל repIS. פיזור רנטגן מלאך קטן מורכב או ספקטרום עוצמת SAXS יכול להיות מתאים במדויק על ידי שילוב מודלים עבור מתאמים מרחביים מרובים הקיימים פיזור אור multiangle יכול לשמש כדי להרחיב את מדידות פיזור קשקשים באורך ארוך יותר.
PCMs של מורפולוגיה משתנה ניתן גם לדמיין עם מיקרוסקופ אלקטרונים כדי לוודא כי רדיוי הליבה והצורה עולים בקנה אחד עם הערכים המתקבלים התאמת נתוני SAXS. בעת התאמת נתוני SAXS, חשוב לקחת בחשבון כל תכונת פיזור ולהשתמש בשיטות משלימות כמו TEM כדי לוודא שאתה משתמש במגורם הצורה הנכון.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקולים לתכנון, הרכבה ואפיון של מיצלות קומפלקס פוליאלקטרוליט (polyelectrolyte complex micelles), שהן ננו-חלקיקים הנוצרים מפולימרים בעלי מטענים מנוגדים. המחקר עוסק באתגרים של הרכבה עצמית ואפיון, ומספק שיטות להשגת פיזור נמוך בגודל ובצורה של המיצלות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- הנדסת ננו-חלקיקים
- כימיה של פוליאלקטרוליטים
- ננו-רפואה
רקע
- מיצלות של קומפלקס פוליאלקטרוליט נוצרות באמצעות הרכבה עצמית של פולימרים טעונים.
- אפיון ננו-חלקיקים אלו הוא קריטי עבור יישומם בהולכת תרופות.
- תהליך ההרכבה עלול להימנע עקב מלכודות קינטיות.
- חישול במלח (Salt annealing) מוצג כטכניקה לשיפור תוצאות ההרכבה.
מטרת המחקר
- מתן שיטה מהימנה להרכבת מיצלות של קומפלקס פוליאלקטרוליט.
- אפיון יעיל של הננו-חלקיקים המתקבלים.
- שיפור ההובלה של חומצות גרעיניות טיפוליות באמצעות מיצלות אלו.
שיטות שהשתמשו בהן
- טכניקת חישול במלח להרכבת מיצלות.
- פיזור אור לאפיון הגודל.
- פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה לניתוח מבני.
- מיקרוסקופיה אלקטרונית לאפיון ויזואלי של מיצלות.
תוצאות עיקריות
- שיטת ההרכבה מניבה מיצלות בעלות פיזור נמוך בגודל ובצורה.
- טכניקות אפיון מאששות את ההיווצרות המוצלחת של ננו-חלקיקים.
- מיצלות סוגרות ביעילות חומצות גרעין ומגנות עליהן מפני פירוק.
- השיטה ישימה עבור פולימרים טעונים שונים.
מסקנות
- ניתן להרכיב ולאפיין מיצלות של קומפלקס פוליאלקטרוליטים באופן מהימן.
- גישה זו מבטיחה שיפור בהובלה טיפולית של חומצות גרעין.
- ניתן להתאים את הטכניקות המתוארות לסוגים שונים של פולימרים טעונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיצלות של קומפלקס פוליאלקטרוליט (PCMs) מציעות ננו-פלטפורמה חסונה לכליאה ולהגנה של אוליגוניוקלאוטידים טיפוליים, ובכך הן נותנות מענה לאתגרי הובלה מרכזיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה. פרוטוקולי הפירוק והחיבור במלח (salt annealing) והאפיון המתוארים מאפשרים הרכבה הדירה של ננו-חלקיקים בעלת פולידיספרסיות נמוכה, ובכך תומכים בקשרי מבנה-תכונה ניבויים, החיוניים לננו-רפואה תרגומית. התקדמויות אלו מקלות על הערכה מהימנה של מועמדים להטיפול ועל הפחתת סיכונים בממשק שבין שלב הגילוי לפיתוח הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה שיטתית של אינטראקציות פוליאלקטרוליטיות הרלוונטיות להולכה של חומצות גרעיניות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מנגנוני כליאה והגנה של ננוחלקיקים.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בתכנון נשאים ננומטריים עבור תרופות מבוססות אוליגוניוקלאוטידים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פרוטוקולים סטנדרטיים להרכבת ננו-חלקיקים עם גודל ופיזור מבוקרים.
- מאפשר אפיון הדיר בשימוש בפיזור אור, SAXS ומיקרוסקופיה אלקטרונית.
- תומך בהערכה כמותית של תכונות ננו-חלקיקים עבור תהליכי סינון המשכיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את תכנון הננוחלקיקים לאתגרי ההובלה הרלוונטיים למחלה עבור חומצות גרעיניות.
- מבטיח רציפות מאפיון פיזיקו-כימי ועד למחקרי הובלה בתוך הגוף (in vivo).
- מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות לניתוחים חסונים ומאומתים באופן צולב של ננו-חלקיקים.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מתודולוגיה זו משלבת בין ממשקי ביולוגיה של גילוי, סריקה והערכה פרה-קלינית, ובכך תומכת במעבר מתכנון המועמד להערכה תרגומית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות בנוגע להרכבת ננו-חלקיקים וכמיסה של חומצות גרעיניות.
- סריקה: מספקת אפיון כמותי וניתן לשחזור של ננו-חלקיקים לצורך מיון מועמדים.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות רב-מודאליות (DLS, SAXS, EM) לצורך ניתוח השוואתי של מערכות ננו-חלקיקים.
- מחקר תרגומי: תומכת בהתאמת תכונות הננו-חלקיקים לדרישות ההולכה וההגנה של אוליגנוקלאוטידים טיפוליים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פרוטוקול בעל יישום רחב עבור מערכות פולימרים טעונים שונות ומודליות של ננו-חלקיקים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במערכות היחסים בין מבנה לתפקוד של ננו-חלקיקים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי ההרכבה והאפיון לצורך הדירות בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go עבור מועמדים לננו-רפואה בהתבסס על אנליטיקה חסונה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של פלטפורמות הובלה עבור תרופות המבוססות על חומצות גרעיניות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרכבת ננו-חלקיקים, פיזור אור, SAXS ומיקרוסקופיה אלקטרונית.
- מחייב גישה למכשור אנליטי ותוכנות למידול נתונים לצורך אפיון רב-ממדי (multi-modal).
- מצריך סטנדרטיזציה של הפרוטוקול בין צוותים שונים כדי להבטיח הדירות ויכולת השוואה.
- ניתן להתאמה למגוון של כימיות של פולימרים טעונים ומורפולוגיות של ננו-חלקיקים.
- תלוי בבחירה קפדנית של מודל ובתיקוף שלו לצורך פרשנות מדויקת של נתוני SAXS.
