ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות Kinesin Gliding
26 ביולי 2021
פרוטוקול זה מתאר תהליך לייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים באמצעות תנועתיות קינזין גולשת בשילוב עם שלפוחיות ליפידים חד-שכבתיות ענקיות.
פרוטוקול זה מאפשר יצירה פשוטה של רשתות ננו-צינוריות ליפידיות בקנה מידה גדול שבהן הננו-צינוריות הבודדות מציגות התנהגות הפרדת פאזות דומה לזו של שלפוחית האב. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שאנו בוחרים במשותף את העבודה שנעשתה על ידי המנועים המולקולריים כדי להרכיב את עצמן של הננו-צינוריות השומנים באופן מקביל ביותר וללא התערבות אנושית. כדי להגדיר בדיקת תנועתיות גלישה, ראשית, הצמידו שלושה סטים של רצועות סרט דו-צדדיות על מגלשת זכוכית במרחק של חמישה מילימטרים זה מזה.
לחץ בעדינות על החלקת כיסוי על הקלטת והוסף 30 מיקרוליטרים של תמיסת קינסין של מיקרומולר אחד לתוך תא הזרימה המוכן. לאחר חמש דקות, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת מיקרוטובול של 10 מיקרוגרם/מיליליטר לתוך התא, תוך לחיצה על מגבון מעבדה בעדינות כנגד הקצה הנגדי של תעלת הזרימה כדי להקל על חילופי התמיסות. לאחר דגירה נוספת של חמש דקות, שטפו את התא פעם עד שלוש פעמים עם 50 מיקרוליטרים של תמיסת תנועתיות בטמפרטורת החדר לכל שטיפה לפני שתוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת סטרפטווידין 10 מיקרוגרם/מיליליטר לתא הזרימה.
לאחר 10 דקות, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת GUV 10X לדגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של תמיסת AMP-PNP של 100 מילימולרי וסגרו את התא עם חומר איטום. העבר את תא הזרימה למיקרוסקופ הפוך להדמיה ובחר את ערכת המסנן המתאימה.
השתמש במטרת שמן 100X כדי למקד תחילה את פני השטח של החלקת הכיסוי לפני שתרכוש תמונה של רשת מעניינת. לאחר מכן פתחו את התמונה ב-ImageJ ולחצו על 'תמונה', 'צבע' ו'קומפוזיט' כדי לכסות את הערוצים האדומים והירוקים כדי ליצור תמונה מורכבת. לאחר ההדמיה, פתח את התמונה המעניינת ולחץ על נתח והגדר קנה מידה כדי לכייל את קנה המידה עבור המיקרוסקופ.
מלא את הפיקסלים למקדם ההמרה של המיקרומטר ולחץ על אישור. השתמש בכלי הקו הרב-נקודתי כדי לעקוב אחר הננו-צינוריות החל מ-GUV האב ולחץ והחזק את Control ו-M כדי למדוד את האורך. כלי עיבוד התמונה ישמור כל מדידה חדשה בחלון התוצאות. לאחר שנמדדו כל הצינורות, בחר תמונה, כוונן וסף ולחץ על החל כדי להחיל את הסף.
לאחר מכן, ציירו מלבן באורך ידוע מעל הצינור הרצוי. כדי למדוד את הצפיפות המשולבת של האזור, לחץ על נתח ומדוד כדי לקבוע את חלוקת השומנים בצמתי הננו-צינוריות הנוזליות, השתמש בכלי הקו כדי לצייר קו מעל צומת העניין ולמדוד את עוצמת הצומת הן בערוצים הירוקים והן בערוצים האדומים. בניתוח מייצג זה, רשתות ננו-צינוריות נוזליות יוצרו כפי שהוכח כי הן יוצרות פאזות עם הפרעות נוזלים וסודרות, כמו גם שלפוחיות מופרדות פאזה.
לדוגמה, שלפוחיות המסונתזות עם 45% שומנים רוויים ו-55% שומנים בלתי רוויים גורמות לשלפוחיות המפרידות לפאזות דו-קיום של הפרעות נוזליות ומוצקות. עם זאת, אם הכולסטרול נכלל, ניתן להבחין בדו-קיום נוזלי-נוזלי, מה שיוצר GUVs המפרידים לשלבים דו-קיום של סידור נוזלי והפרעות נוזליות. יתר על כן, צמתים ניתן לראות בתוך תערובות מופרדות פאזה.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא לבחור את זמן החשיפה המתאים ואת סט המסנן ND כדי להיות מסוגל לדמיין את הננו-צינוריות השומנים מבלי להלבין את הפלואורופורים. התאמת הרכב התנהגות הפאזה של הננו-צינוריות השומנים מאפשרת לנו להשתמש במערכת מודל מינימליסטית כדי להתחיל לחקור את הביופיזיקה של הננו-צינוריות המתעלות המחברות תאים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מאפשר יצירה פשוטה של רשתות ננו-צינורות ליפידיים בהיקף רחב באמצעות תנועת גלישה של קינזין. ננו-הצינורות הבודדים מראים התנהגות של הפרדת פאזות הדומה לזו של הוזיקולות המקוריות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביולוגיה של התא
רקע
- ננו-צינורות ליפידיים חשובים לחקר דינמיקת ממברנות.
- מנועי קינזין מקלים על הרכבה עצמית של מבני ליפידים.
- הפרדה פאזית במערכות ליפידיות יכולה לחשוף תובנות לגבי תהליכים תאיים.
- שיטה זו משפרת את יכולת ההרחבה (scalability) של ייצור ננו-צינורות.
מטרת המחקר
- ליצור רשתות של ננו-צינורות ליפידיים באופן יעיל.
- להשתמש במנועים מולקולריים להרכבה עצמית ללא התערבות אנושית.
- לבחון את התנהגות הפאזה של ננו-צינורות ליפידיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של בדיקת ניידות החלקה (gliding motility assay) באמצעות קינזין ומיקרוטובוליים.
- שימוש בסרט דבק דו-צדדי ליצירת תא זרימה (flow cell) על עלית זכוכית.
- הוספה רצופית של תמיסות קינזין ומיקרוטובוליים.
- שטיפה והוספת סטרפטאווידין כדי לסייע ביצירת ננו-צינורות.
תוצאים עיקריים
- יצירה מוצלחת של רשתות ננו-צינוריות ליפידיות.
- הדגמה של התנהגות הפרדת פאזות בתוך הננו-צינוריות.
- יכולת הרחבה (scalability) גבוהה של השיטה הודות לשימוש במנועים מולקולריים.
- יישומים פוטנציאליים בחקר דינמיקת ממברנות ותהליכים תאיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לייצור ננו-צינורות ליפידיים.
- שימוש במנועי קינזין מאפשר הרכבה עצמית יעילה.
- גישה זו יכולה לקדם את המחקר בביולוגיה של ליפידים ובדינמיקה של ממברנות.
שאלות נשאלות שכיחויות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
ייצור מהיר של רשתות ננו-צינורות ליפידיים מרובי-רכיבים באמצעות בדיקת ניידות קינזין בגלישה מאפשר יצירת מודלים in vitro ניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב לתחבורה הקשורה לממברנה ולביופיזיקה של ליפידים. גישה זו תומכת בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת מערכות ניתנות לכיוונון ובעלות רלוונטיות ביולוגית המדמות את המורכבות של צינורות ליפידיים תאיים. השיטה מגבירה את רמת הוודאות החזויה עבור מחקרים מכניסטיים ותיעדוף תיקי פיתוח במחקרים של טיפולים המכוונים לממברנה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני הובלה בממברנה במערכת נשלטת וניתנת לכיוונון.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות מולקולריות המעורבות בדינמיקה ובהובלה של ליפידים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מידול של הפרדת פאזות והתנהגויות של חלוקת ליפידים.
- מספק פלטפורמה לבדיקת השערות לגבי אינטראקציות ליפיד-חלבון הרלוונטיות למסלולי מחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק הכנה הדירה וניתנת להרחבה של רשתות ננו-צינורות ליפידיים עבור בדיקות המשך.
- מאפשר מדידה כמותית של אורך, רוחב וחלוקה ליפידית של הננו-צינורות לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר יצירה מהירה של מערכות ליפידיות מורכבות באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.
- תומך בסקרינג של תרכובות המשפיעות על מבנה הממברנה או על תהליכי הובלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספק מודל רלוונטי למחלה לצורך חקר צינורות ננו-מנהרה (tunneling nanotubes) המעורבים בתקשורת בין-תאית.
- מתכתב עם גילוי סממנים ביולוגיים תרגומיים על ידי מתן אפשרות לניתוח התנהגות פאזות ליפידיות וחלוקה ביניהן.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות המכוונות לממברנה.
- מפחית עמימות ביולוגית בבחירת מודלים פרה-קליניים עבור תרכובות הפעילות על ממברנות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרים מכניסטיים מוקדמים ועד לפיתוח מודלים פרה-קליניים עבור מטרות הקשורות לממברנה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים של הובלה ואיתות המתווכים על ידי ליפידים.
- סריקה: מספקת רשתות ננו-צינורות ליפידיים הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה, בעלות תכונות ניתנות לכיוונון.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של ממדי הננו-צינורות ושל חלוקת ליפידים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשרי בין תובנות מכניסטיות in vitro לתופעות ממברנה הרלוונטיות למחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה, הניתנת להתאמה למספר תוכניות מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי ביולוגיה של ממברנות.
- ערך תפעולי: מייעל את הייצור, הסטנדרטיזציה והשחזור של מערכות ליפידיות מורכבות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון עבור פורטפוליו המכוון לממברנות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מועמדים טיפוליים הפעילים על ממברנות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביופיזיקה של ליפידים ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך ניתוח כמותי.
- נשמר צורך בציוד מעבדה סטנדרטי להרכבת תא זרימה (flow cell) ולהדמיה.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי ההדמיה והמדידה.
- ניתן להתאמה למגוון הרכבי ליפידים ומערכות מודל לצורכי מחקר שונים.
- תלוי בבקרה קפדנית של פרמטרי ההדמיה כדי למנוע פוטובליצ'ינג (photobleaching) של הפלואורופור.
