Name: ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות Kinesin Gliding (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: למד לייצר רשתות ננו-צינוריות ליפידים בקנה מידה גדול באמצעות תנועתיות Kinesin Gliding. שיטה זו מאפשרת הרכבה עצמית מקבילית לחקר דינמיקת ממברנות ותהליכים תאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מחלקת האנרגיה של ארה"ב, המשרד למדעי האנרגיה הבסיסיים, המחלקה למדעי החומרים וההנדסה (BES-MSE). סינתזת קינסין ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית בוצעו באמצעות פרויקט משתמש (ZIM) במרכז לננו-טכנולוגיה משולבת, מתקן משתמשים של משרד המדע המופעל עבור משרד המדע האמריקאי (DOE).

<ol><li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li>
<li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li>
<li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li>
<li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotubes%2C+exosomes%2C+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells%3A+implications+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li>
<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li>
<li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li>
<li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li>
<li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li>
<li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li>
<li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li>
<li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li>
<li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li>
<li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+diagram+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579(1994).</li>
<li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li>
<li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+of+Chemistry+Advances%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li>
</ol>

המעבדות הלאומיות של סנדיה היא מעבדה רב-משימתית המנוהלת ומופעלת על ידי פתרונות טכנולוגיה והנדסה לאומיים של Sandia, LLC., חברת בת בבעלות מלאה של Honeywell International, Inc., עבור מינהל הביטחון הגרעיני הלאומי של ארה"ב DOE תחת חוזה DE-NA-0003525. מאמר זה מתאר תוצאות טכניות אובייקטיביות וניתוח. כל השקפה או דעה סובייקטיבית שעשויה לבוא לידי ביטוי בעיתון אינה מייצגת בהכרח את דעות משרד האנרגיה האמריקאי או של ממשלת ארצות הברית.

רשתות LNT הן כלי שימושי למחקרים במבחנה לתכונות הממברנה ולהובלת ביומולקולות כגון חלבוני טרנס-ממברנה. יתר על כן, שימוש בפורמולות ליפידים מורכבות לייצור רשתות LNT מאפשר מחקרים רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית. מחקרי ייצור אחרים השתמשו ב-1) ניסוחי ליפידים פשוטים ושלפוחיות מולטי-למלר או 2) טכניקות תנועתיות מסורבלות יותר לייצור רשתות מ-GUVs המורכבים מנוסחמות שומנים מורכבות. השיטה המתוארת כאן מאפשרת ייצור יעיל של רשתות LNT בקנה מידה גדול מפורמולציות שומנים ו- GUVs מורכבים ושימוש בריאגנטים וציוד זולים. ככזו, מתודולוגיה זו מציעה את...

ייצור רשתות ננו-צינוריות שומנים (LNT) מעורר עניין גובר בבדיקה חוץ גופית של מבנים שומניים ללא שיווי משקל 1,2,3. תאים משתמשים בצינוריות ליפידים להובלה מפוזרת של חלבונים4 וחומצות גרעין5, כמו גם תקשורת בין תאים לתא 6,7. הרשתית האנדופלסמית ומנגנון גולג'י מעניינים במיוחד, שכן אברונים אלה הקשורים לממברנה הם המיקומים העיקריים לסינתזת שומנים וחלבונים, כמו גם להובלה של ביומולקולות אינטגרליות אלה בתוך הציטופלסמה של תא 8,9. הממברנות של אברונים אלה מורכבות ממיני שומנים מרובים כולל ספינגולפידים, כולסטרול ופוספוליפידים10 שבסופו של דבר עוזרים להגדיר את הפונקציונליות שלהם. לפיכך, כדי לשכפל ולחקור בצורה הדוקה יותר את האברונים הללו, יש לייצר LNTs במבחנה משלפוחית עם נוסחאות שומנים מורכבות יותר ויותר11.
בועיות חד-שכבתיות ענקיות (GUVs) משמשות באופן נרחב לחקר התנהגות קרום השומנים מכיוון שניתן לסנתז אותן באופן אמין עם פורמולציות מורכבות הכוללות כולסטרול, פוספטידילכולין (PC), פוספטידיל-ילתנולמין (PE), פוספטידיל-סרין (PS) ופוספטידילינוזיטול (PI)12,13. מתוארת כאן שיטה לייצור LNTs מ- GUVs עם נוסחאות ליפידים משתנות באמצעות בדיקת תנועתיות גלישה (GMA), שבה LNTs מובלטים על סמך העבודה המבוצעת על ידי מנועי קינזין וחוטים מיקרוטובולים הפועלים על גבי GUVs. במערכת זו, חלבונים מוטוריים של קינסין נספגים אל פני השטח מניעים מיקרוטובולים שעברו ביוטינילציה, וממירים אנרגיה כימית מהידרוליזה של ATP לעבודה שימושית (במיוחד, שחול של LNTs משלפוחיות ביוטינילציה)11. רשת LNT המתקבלת מספקת פלטפורמת מודל לחקר ההשפעות של ההבדלים בשלבי השומנים על שינויים במורפולוגיה של LNT.
בקצרה, חלבונים מוטוריים של קינזין מוכנסים לתא זרימה בתמיסה המכילה קזאין, המאפשרת את ספיגת המנועים על פני הזכוכית של התא. לאחר מכן, מיקרוטובולים שעברו ביוטינילציה בתמיסה המכילה ATP זורמים דרך התא ומותר להם להיקשר למנועי הקינזין ולהתחיל בתנועתיות. לאחר מכן מכניסים תמיסת סטרפטווידין לתוך התא ומאפשרים לה להיקשר באופן לא קוולנטי למיקרוטובולים. לבסוף, GUVs המכילים שומנים ביולוגיים מוכנסים לחדר ונקשרים למיקרוטובולים המצופה סטרפטווידין, ולאחר מכן מוציאים LNTs ליצירת רשתות בקנה מידה גדול במהלך 15-30 דקות. שיטה זו מייצרת רשתות LNT גדולות ומסועפות באמצעות ציוד מעבדה וריאגנטים סטנדרטיים בעלות נמוכה11.

<table><tbody><tr><td>100x/1.4 צמצם מספרי טבילה שמן מטרה</td><td>אולימפוס</td><td>1-U2B836</td><td>אולימפוס UPlanSApo 100x/1.40 שמן אובייקט אינסוף מתוקן, RMS חוט מרחק עבודה 0.12 מ"מ</td></tr><tr><td>3.0 ND מסנן</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>צפיפות ניטרלית מסנן</td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2647</td><td>(&beta;,&gamma;-imidoadenosine 5&prime;-triphosphate)</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>אדנוזין 5'-טריפוספט מלח דיסודיום הידרט BioXtra</td></tr><tr><td>Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 סט מסננים</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td><td> סט מסנני BrightLine Pinkel, מותאם ל-DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 ואחרים כמו פלואורופורים, מוארים במקורות אור מבוססי LED</td></tr><tr><td>קזאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>22090</td><td>קזאין הידרוליזט למיקרוביולוגיה</td></tr><tr><td>קטלאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C9322</td><td>קטלאז מכבד בקר</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>288306</td><td>כלורופורם נטול מים מכיל 0.5-1.0% אתנול כמייצב</td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>Avanti</td><td>700000P</td><td>כולסטרול (צמר בקר, >98%) (אבקה)</td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7021</td><td>D-(+)-אבקת גלוקוז, BioReagent, מתאים לתרבית תאים, מתאים לתרבית תאי חרקים, מתאים לתרבית תאי צמחים, &ge; 99.5%</td></tr> <tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375C</td><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (בכלורופורם)</td></tr> <tr><td>DOPE-ביוטין</td><td>Avanti</td><td>870282C</td><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (מלח נתרן)</td></tr> <tr><td>DPPC</td><td>Avanti</td><td>850355P</td><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (אבקה)</td></tr> <tr><td>DPPE-ביוטין</td><td>Avanti</td><td>870285P</td><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (מלח נתרן)</td></tr> <tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>DL-Dithiothreitol Solution 1 M</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA, חומצה אגטזית, אתילן-ביס(אוקיאתילנניטרילו)חומצה טטראצטית, גליקול אתר דיאמין, חומצה טטראצטית,</td></tr><tr><td>גלוקוז אוקסידאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G6125</td><td>גלוקוז אוקסידאז מ-Aspergillus niger סוג II, &ge; 10,000 יחידות/גרם מוצק (ללא תוספת חמצן)</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר</td><td>G33</td><td>גליצרול (מאושר ACS), פישר כימיקל</td></tr><tr><td>GTP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8877</td><td>גואנוזין 5&פריים;-טריפוספט נתרן מלח הידרט</td></tr><tr><td>IX-81 מיקרוסקופ אולימפוס</td><td>אולימפוס</td><td>N/A</td><td>IX81 מיקרוסקופ הפוך מבית אולימפוס</td></tr><tr><td>KOH</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1050121000</td><td>אשלגן הידרוקסיד</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1028</td><td>1.00 M תמיסת מגנזיום כלוריד</td></tr><tr><td>אורקה פלאש 4.0 מצלמה דיגיטלית</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td>ORCA-Flash 4.0 V3 מצלמת CMOS דיגיטלית</td></tr><tr><td>אורגון ירוק-DHPE</td><td>Invitrogen</td><td>O12650</td><td>אורגון ירוק 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td></tr><tr><td>Paclitaxel ThermoFisher</td><td></td><td>P3456</td><td>פקליטקסל (שווה ערך לטקסול) - לשימוש במחקר בלבד</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>חומצה סיגמא-אולדריץ</td>' <td>P6757</td><td>1,4-פיפרזיןדיאטנאנסולפונית, פיפרזין-1,4-ביס(חומצה 2-אתנסולפונית), פיפרזין-N,N&פריים;-ביס(חומצה 2-אתנסולפונית)</td></tr><tr><td>טקסס אדום-DHPE</td><td>Invitrogen</td><td>T1395MP</td><td>טקסס אדום 1,2-דיהקסדקנויל-sn-גליצרו-3-פוספואתנולמין, מלח טריאתילאמוניום</td></tr><tr><td>טרולוקס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>238813</td><td>(&plusmn;)-6-הידרוקסי-2,5,7,8-טטרמתילכרומן-2-חומצה קרבוקסילית</td></tr><tr><td>טובולין, שלד ציטוטיני ביוטין</td><td></td><td>T333P</td><td>חלבון טובולין (ביוטין) מוח חזירי</td></tr><tr><td>טובולין, Hy-Lite 488</td><td>שלד ציטו</td><td>TL488M</td><td>חלבון טובולין (פלואורסצנטי HiLyte 488) מוח חזירי</td></tr><tr><td>טובולין, ללא תווית</td><td>שלד ציטו</td><td>T240</td><td>חלבון טובולין מוח חזירי</td></tr></tbody></table>

ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות kinesin gliding

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

רשתות ננו-צינוריות ליפידים (LNT) מייצגות מערכת מודלים חוץ גופית לחקר הובלה מולקולרית וביופיסיקה של שומנים עם רלוונטיות לצינוריות השומנים הנמצאות בכל מקום בתאים אאוקריוטים. עם זאת, LNTs in vivo הם מבנים מאוד לא שיווי משקל הדורשים אנרגיה כימית ומנועים מולקולריים כדי להרכיב, לתחזק ולארגן מחדש. יתר על כן, ההרכב של LNTs in vivo הוא מורכב, ומורכב ממספר מיני שומנים שונים. שיטות אופייניות להבלטת LNTs הן עתירות זמן ועבודה, והן דורשות פינצטה אופטית, מיקרובים ומיקרופיפטים כדי למשוך בכוח ננו-צינוריות מבועיות ליפידים ענקיות. מוצג כאן פרוטוקול לבדיקת תנועתיות הגלישה (GMA), שבה רשתות LNT בקנה מידה גדול נוצרות במהירות מבועיות ענק חד-שכבתיות (GUVs) באמצעות תנועתיות מיקרוטובולים המופעלות על ידי קינזין. באמצעות שיטה זו, רשתות LNT נוצרות ממגוון רחב של פורמולציות שומנים המחקות את המורכבות של LNTs ביולוגיים, מה שהופך אותן לשימושיות יותר ויותר למחקרים חוץ גופיים של ביופיסיקה של שומנים ותחבורה הקשורה לממברנה. בנוסף, שיטה זו מסוגלת לייצר באופן אמין רשתות LNT בזמן קצר (<30 דקות) באמצעות ציוד מעבדה נפוץ. מאפייני רשת LNT כגון אורך, רוחב ומחיצות שומנים ניתנים גם לכוונון על ידי שינוי הרכב השומנים של ה- GUVs המשמשים לייצור הרשתות.

רשתות LNT (איור 4) יוצרו באמצעות הפרוטוקול המתואר, המשתמש בעבודה המבוצעת על ידי הובלת קינסין של מיקרוטובולים כדי להוציא LNTs מ-GUVs. בקצרה, GUVs הוכנו באמצעות התייבשות ג'ל אגרוז באמצעות תמיסת סוכרוז, ומיקרוטובולים פוזלו בתמיסת GPEM והתייצבו ב- BRB80T. לאחר מכן, מנועי קינסין הוכנסו לתא זרימה היוצרים שכבה פעילה של מנועים על פני השטח של הכיסוי. לאחר מכן הוכנסו מיקרוטובולים והווספה תמיסת סטרפטווידין, מה שאיפשר קשירת קשר בין השומנים הביוטינילטיביים לבין ה-GUVs (שהוכנסו לאחר מכן).
<p class="jo...

פרוטוקול זה מתאר תהליך לייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים באמצעות תנועתיות קינזין גולשת בשילוב עם שלפוחיות ליפידים חד-שכבתיות ענקיות.

ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות Kinesin Gliding

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

פרוטוקול זה מאפשר יצירה פשוטה של רשתות ננו-צינוריות ליפידיות בקנה מידה גדול שבהן הננו-צינוריות הבודדות מציגות התנהגות הפרדת פאזות דומה לזו של שלפוחית האב. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שאנו בוחרים במשותף את העבודה שנעשתה על ידי המנועים המולקולריים כדי להרכיב את עצמן של הננו-צינוריות השומנים באופן מקביל ביותר וללא התערבות אנושית. כדי להגדיר בדיקת תנועתיות גלישה, ראשית, הצמידו שלושה סטים של רצועות סרט דו-צדדיות על מגלשת זכוכית במרחק של חמישה מילימטרים זה מזה.לחץ בעדינות על החלקת כיסוי על הקלטת והוסף 30 מיקרוליטרים של תמיסת קינסין של מיקרומולר אחד לתוך תא הזרימה המוכן. לאחר חמש דקות, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת מיקרוטובול של 10 מיקרוגרם/מיליליטר לתוך התא, תוך לחיצה על מגבון מעבדה בעדינות כנגד הקצה הנגדי של תעלת הזרימה כדי להקל על חילופי התמיסות. לאחר דגירה נוספת של חמש דקות, שטפו את התא פעם עד שלוש פעמים עם 50 מיקרוליטרים של תמיסת תנועתיות בטמפרטורת החדר לכל שטיפה לפני שתוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת סטרפטווידין 10 מיקרוגרם/מיליליטר לתא הזרימה.לאחר 10 דקות, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת GUV 10X לדגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של תמיסת AMP-PNP של 100 מילימולרי וסגרו את התא עם חומר איטום. העבר את תא הזרימה למיקרוסקופ הפוך להדמיה ובחר את ערכת המסנן המתאימה.השתמש במטרת שמן 100X כדי למקד תחילה את פני השטח של החלקת הכיסוי לפני שתרכוש תמונה של רשת מעניינת. לאחר מכן פתחו את התמונה ב-ImageJ ולחצו על 'תמונה', 'צבע' ו'קומפוזיט' כדי לכסות את הערוצים האדומים והירוקים כדי ליצור תמונה מורכבת. לאחר ההדמיה, פתח את התמונה המעניינת ולחץ על נתח והגדר קנה מידה כדי לכייל את קנה המידה עבור המיקרוסקופ.מלא את הפיקסלים למקדם ההמרה של המיקרומטר ולחץ על אישור. השתמש בכלי הקו הרב-נקודתי כדי לעקוב אחר הננו-צינוריות החל מ-GUV האב ולחץ והחזק את Control ו-M כדי למדוד את האורך. כלי עיבוד התמונה ישמור כל מדידה חדשה בחלון התוצאות. לאחר שנמדדו כל הצינורות, בחר תמונה, כוונן וסף ולחץ על החל כדי להחיל את הסף.לאחר מכן, ציירו מלבן באורך ידוע מעל הצינור הרצוי. כדי למדוד את הצפיפות המשולבת של האזור, לחץ על נתח ומדוד כדי לקבוע את חלוקת השומנים בצמתי הננו-צינוריות הנוזליות, השתמש בכלי הקו כדי לצייר קו מעל צומת העניין ולמדוד את עוצמת הצומת הן בערוצים הירוקים והן בערוצים האדומים. בניתוח מייצג זה, רשתות ננו-צינוריות נוזליות יוצרו כפי שהוכח כי הן יוצרות פאזות עם הפרעות נוזלים וסודרות, כמו גם שלפוחיות מופרדות פאזה.לדוגמה, שלפוחיות המסונתזות עם 45% שומנים רוויים ו-55% שומנים בלתי רוויים גורמות לשלפוחיות המפרידות לפאזות דו-קיום של הפרעות נוזליות ומוצקות. עם זאת, אם הכולסטרול נכלל, ניתן להבחין בדו-קיום נוזלי-נוזלי, מה שיוצר GUVs המפרידים לשלבים דו-קיום של סידור נוזלי והפרעות נוזליות. יתר על כן, צמתים ניתן לראות בתוך תערובות מופרדות פאזה.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא לבחור את זמן החשיפה המתאים ואת סט המסנן ND כדי להיות מסוגל לדמיין את הננו-צינוריות השומנים מבלי להלבין את הפלואורופורים. התאמת הרכב התנהגות הפאזה של הננו-צינוריות השומנים מאפשרת לנו להשתמש במערכת מודל מינימליסטית כדי להתחיל לחקור את הביופיזיקה של הננו-צינוריות המתעלות המחברות תאים.

fabricating-multi-component-lipid-nanotube-networks-using-gliding

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

ההסעות מולקולרית המורכבת microtubules פונקציונליות מחליק על פני השטח, דבק kinesin חלבונים המנוע יכול לשמש כמערכת הובלה הננומטרי. הנה, הרכבה של מערכת הסעה טיפוסית מתואר.

המטען טוען על הסעות Kinesin מולקולרית מופעל

בסרטון זה, אנו מבצעים בדיקת תנועתיות חוץ גופית כדי לנתח את אינטראקציות אקטין מיוזין. תנועת הגלישה של חוטי אקטין על מולקולות מיוזין משותקות מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

The Gliding Actin Filament Assay: An In Vitro Motility Assay to Study Translocation of Actin Filaments on Immobilized Myosins

שיטה למדידת אורך ההתמדה או קשיחות כפיפה של biopolymers מתוארת. השיטה משתמשת assay גלישת microtubule kinesin מונע בניסוי כדי לקבוע את אורך ההתמדה של microtubules הבודד וניתנת להתאמה למבחני גלישה יקטין מבוססים.

מדידות קשיחות כפיפה של Biopolymers שימוש במבחני דאייה

אנו מדווחים על יישום חכם של ננו-צינורות פחמן לייצוב קינטי של חלקיקי שומנים המכילים ננו-מבנים בהרכבה עצמית בליבותיהם. הכנת חלקיקי שומנים דורשת ריכוזים נמוכים למדי של ננו-צינורות פחמן המאפשרים את השימוש בהם ביישומים ביו-רפואיים כגון מתן תרופות.

הכנה קלילה של פנימית עצמית התאספו חלקיקים ליפידים מיוצב על ידי פחמן

נתמכת solid, נטול חלבון, כפול פוספוליפיד bilayer ממברנות (DLBM) יכולה להיהפך מורכב ודינמי, השומנים nanotube רשתות, יכול לשמש מלמטה למעלה 2D, דגמי רשתית תוך-פלזמית.

היווצרות ספונטנית ו שחלוף של השומנים מלאכותי Nanotube רשתות כמודל מלמטה למעלה על רשתית תוך-פלזמית

אנו מציגים את פרוטוקול לבנות מעבורות מולקולרית, היכן חלבונים מנוע קינזין דבקה משטח להניע microtubules צבען מתויג. אינטראקציות חלשות של kinesins עם המשטח מאפשר ההחזקה הפיך שלהם אליו. זה יוצר מערכת ננו אשר מוצגים דינמי הרכבה ופירוק של מרכיביו תוך שמירה על הפונקציונליות שלו.

הרכבת המעבורות מולקולרי מופעל על ידי הפיכה מצורף Kinesins

המטרה של פרוטוקול זה היא טופס הרכבים של מנועים מולקולריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים ולהתבונן ההרכב לתנועתיות באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ קרינה.

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

קינסין-5 Cin8 המיטוטי הדו-כיווני מצטבר באשכולות המתפצלים ומתמזגים במהלך תנועתיותם. הצטברות באשכולות משנה גם את המהירות והכיווניות של Cin8. כאן מתואר פרוטוקול לבדיקות תנועתיות עם Cin8-GFP מטוהר וניתוח תכונות תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8.

תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של קינסין-5 Cin8 דו-כיווני מטוהרים מתאי S. cerevisiae

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

מאמר זה מציג פרוטוקולים להנדסה ולאפיון רשתות תלת-ממדיות מרוכבות הניתנות לכוונון של חוטי אקטין ומיקרו-טובולים המסתבכים. חומרים מרוכבים עוברים ארגון מחדש אקטיבי ותנועה בליסטית, מונעים על ידי מנועי מיוזין II וקינסין, ומכוונים על ידי הריכוזים היחסיים של אקטין, מיקרוטובולים, חלבונים מוטוריים וקרוסלינקרים פסיביים.

שחזור ואפיון מרוכבים של אקטין-מיקרוטובול עם דינמיקה ומכניקה מונעות מנוע ניתנות לכוונון

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

למד לייצר רשתות ננו-צינוריות ליפידים בקנה מידה גדול באמצעות תנועתיות Kinesin Gliding. שיטה זו מאפשרת הרכבה עצמית מקבילית לחקר דינמיקת ממברנות ותהליכים תאיים.

ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות Kinesin Gliding

גלה סרטונים נוספים