דגימה וניתוח של אותות ריח בעלי חיים

פיתחנו מתודולוגיה יעילה לדגימה וניתוח של אותות ריח כדי להבין כיצד ניתן להשתמש בהם בתקשורת בין בעלי חיים. במיוחד, אנו משתמשים במיקרו-אינטרנצ'רציה מוצקה של מרחב הראש יחד עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה כדי לנתח את הרכיבים הנדיפים של ריחות בעלי חיים וסימוני ריח.

התפקיד שמילא הריח בתקשורת בין בעלי חיים אינו מוערך כיום כראוי ולכן לא מוערך כראוי. בפרט מעט מאוד ידוע על השינויים הכימיים העומדים ביסוד אותות הריח בבעלי חיים כולל בני אדם. ואלה נובעים גם מאתגרים מתודולוגיים, הקלטה וכימות של תרכובות כימיות של ריחות המשמשים בעלי חיים לתקשר.

ישנם מספר אתגרים פוטנציאליים בעת עבודה עם תערובות כימיות מורכבות מאוד ואלה כוללים גם בעת דגימה וניתוח דגימות הריח. אנו מבצעים ניתוח של ריחות המשמשים בעלי חיים כדי להבין כיצד הם עשויים לשמש אותם כאשר הם מתקשרים זה עם זה. שילבנו ציטוכימיה עם אנדוקרינולוגיה ביו-אקולוגית וציטולוגיה כדי לשפר את הבנתנו את התפקיד שמילא הריח בתקשורת בין בעלי חיים.

עבור המתודולוגיה הנוכחית שלנו בוולברהמפטון, אימצנו את הטכניקה של מיקרו-מבנה פאזה מוצק Headspace בשילוב עם ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית גז, שנבנתה על ובלתי נראה של המתודולוגיה משמשים בעבר. ריחות לדוגמה נאספים באחת מהדרכים הבאות. אחד, שוחרר באופן ספונטני ריחות מדגם מנבדקים מחקריים רגילים.

לדוגמה, פרימטים גן החיות לאסוף הפרשות ריח ריח בלוטה על ידי סימון ריח על נייר מסנן סטרילי או דגימות שתן ישירות לתוך בקבוקונים. שתיים, לאחר אימון נושאי המחקר באמצעות חיזוק חיובי לאסוף הפרשות ריח על ידי שפשוף מבט ריח עם ספוגיות כותנה סטרילית. שלוש, לאחר sedation של נושאי המחקר לאסוף הפרשות ריח על ידי שפשוף בלוטות ריח עם ספוגיות כותנה סטרילית, על ידי דגימות לתוך בורג סטרילי 10 מיליליטר כתרים, בקבוקוני זכוכית ברורים לאטום עם כובעים מצופים בורג שילוב P T F E מגזר סיליקון.

מיד לאחסן את הבקבוקונים במינוס 20 מעלות צלזיוס. הערה, חיוני כי ציוד מגן אישי נקי כגון כפפות ניטריל משמש במהלך הדגימה. החלף כפפות לעתים קרובות להימנע ממגע עור ישיר עם דגימות בקבוקונים.

עדיף להשתמש בבקבוקונים חדשים לגמרי. עם זאת, במקרה של בקבוקונים משומשים, חיוני לנקות מראש את הבקבוקונים, ולאחר מכן להשתמש באותו פרוטוקול. קח כדורי סרק סביבתיים בכל פעם שסימני ריח נאספים.

עשה זאת על ידי חשיפת נייר סינון שאינו בשימוש או צמר גפן ובקבוקונים לסביבה תוך כדי דגימה. דגימות מוכנות בשטח. עבור נייר מסנן מסומן ריח לחתוך מרובע כ 10 מילימטר מהנייר ומניחים לתוך בורג 10 מיליליטר עקף בקבוקון שטח הראש.

עבור ספוגית, לחתוך את ראש ספוגית בקצה מאוד של פיר ספוגית ומניחים לתוך בקבוקון חלל הראש. לאחר כל דגימה הוכן להיפטר או לנקות את השימוש בלהב כדי לחתוך את מדיית הדגימה, עם ניגוב אנטיבקטריאלי מתאים או אלכוהול ויובש ביסודיות. אחסן את כל הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס.

הערה, דגימות צריך להיות מאוחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס עם זאת, במאגר השדה הנמוך ביותר הוא הטמפרטורה האפשרית ולהעביר מינוס 20 מעלות צלזיוס בהזדמנות הראשונה. לפני הניתוח להסיר דגימות מהמקפיא מותר ללכת באופן טבעי לטמפרטורת החדר לפחות שעה אחת. הגדר את השיטות האנליטיות ב- GCMS כדלקמן עבור תנאי ניתוח SPMS בהתאם להוראות היצרן כדי להתנות סיבי SBME לפני השימוש הראשון.

חיוני שהרכבת SBME תותקן כראוי בדוגמת הרכב ושהוא מיושר ליחידת מיזוג הסיבים של מגשי הדגימה האוטומטיים וליציאת הכניסה של GC. יישור שגוי עלול לגרום נזק או הרס של סיבי Sbme. ודא שאספקת הגז ליחידת מיזוג הסיבים מופעלת.

כדי לשפר בין עקביות זמן שמירה לדוגמה, השיטה האנליטית נעולה בזמן שמירה להוסיף את הבקבוקונים לדוגמה למגש המדגם האוטומטי למקם בקבוקון שטח ראש ריק לפעול כמערכת ריקה במיקום הראשון של מגש המדגם האוטומטי. מקם את הריק הסביבתי במיקום השני ולאחר מכן מקם את כל הדגימות הנותרות לניתוח במיקומים הבאים של מגש הדגימה האוטומטית. צור רצף אנליטי כדי לנתח כל דגימה בתוך המגש לדוגמה.

במסך הבית של צייד ההמונים, בחר רצף עבור שורת התפריטים ולאחר מכן טען רצף מהתפריט הנפתח. טבלת רצף ריקה תוצג להשלים את טבלת הרצף עבור כל הריקים והדוגמאות על-ידי הוספת המידע המתאים לשמור כטבלת רצף שהושלמה. שים לב, המידע המדויק עבור טבלת הרצף יהיה תלוי בעיצוב המעבדות של הטבלה.

מידע מינימלי יכלול בדרך כלל שם לדוגמה של סוג לדוגמה, מיקום קובץ ושיטת ניתוח מספרים ומיקום קובץ נתונים והקצאת שמות של שם קובץ נתונים התואם לשם לדוגמה של עיבוד נתונים עתידי בגילאים. ניתן להוסיף דגימות נוספות לרצף במהלך הניתוח. הפעל את הרצף על-ידי בחירת רצף מתוך שורת התפריטים ולאחר מכן הפעל רצף.

לאחר הניתוח החזיר דגימות למקפיא בהקדם האפשרי. שים לב, ייתכן שניתן יהיה לאכוך מחדש דגימות. אבל יש לציין כי כמה רכיבים נדיפים אולי שחולצו לחלוטין במהלך הניתוח הראשוני וכמה תרכובת אולי עברו פירוק תרמי חיידקי ב 40 מעלות צלזיוס.

לכן, התוצאה כרומטוגרמה לא יכול להיות מייצג ביסודיות של סימון הריח המקורי. ניתוח נתונים ראשוני כולל שילוב של כרומטוגרמות כדי להשיג זמן שמירה ונתוני אזור שיא יחד עם זיהוי זמני של פסגות באמצעות תוכנת תחנת פקה ומסדי נתונים ספקטרליים מסה קן. ניתוח נתונים יכול להתבצע באופן ידני או באמצעות שיטה אוטומטית למחצה.

אם השיטה האוטומטית למחצה משמשת אז זה לפעמים מועיל לבצע מידה מסוימת של ניתוח נתונים ידני כדי לאמת זיהויים מהוססים. כדי להתחיל ניתוח נתונים לפתוח את קובץ הנתונים על ידי לחיצה על הקובץ המתאים בסרגל הניווט השמאלי. סך כרומטוגרמה יון TIC יוצג בחלון העליון של מסך ניתוח הנתונים.

כדי לשלב את ה- TIC באמצעות האינטגרטור RTE, בחר תחילה כרומטוגרמה מתוך שורת התפריטים ולאחר מכן בחר אינטגרטור מהתפריט הנפתח תיבה נפתחת ובחר באינטגרטור RTE. חזור לתפריט הכרומטוגרמה וכעת בחר שלב. כדי להתאים פרמטרי שילוב כך שישולבו פסגות או יותר מפי שלושה מרעש בסיסי, בחר שוב כרומטוגרמה משורת התפריטים ולאחר מכן פרמטרים של שילוב MS Signal מהתפריט הנפתח.

בתיבה הנפתחת, התאם את אזור השיא המינימלי בהתאם ל- 1.0 המתאים והפיק תוצאות מקובלות בדוגמאות שלנו. כדי לזהות פסגות וליצור דוח סיכום, בחר יצא דוחות מ שורת התפריטים ולאחר מכן חפש דוחות תוצאות חיפוש בספריה ל- XLS. שים לב, הספריות הספקטרליות שיש לחפש יחד עם מספר התאמות הספריה שיוצגו צריכות להיות מוגדרות מראש בתוכנה לפני שניתן יהיה לבצע חיפוש בספריה.

דוח הגיליון האלקטרוני המתקבל מכיל נתוני שילוב עבור כל שיא והתאמה לא סופית של ספריה ספקטרלית להקצאת זהות. בדרך כלל איכות הספריה או התאמת הספריה צריכות להיות גדולות מ- 80 כדי לקבל את הזיהוי הלא סופי. שמור את הגיליון האלקטרוני.

כדי לזהות שיא ישירות מ- TIC, בחר את שיא העניין. אם השיא הוא הגדלה קטנה על-ידי ציור תיבה מסביב לשיא, על-ידי החזקת לחצן העכבר השמאלי למטה למתוח את התיבה מעל הפסגה ולשחרר את לחצן העכבר. מקם את קו הסמן כך שיהיה בנקודה הגבוהה ביותר של הפסגה או מיד לאחר מכן.

לחיצה כפולה, לחצן העכבר הימני וספקטרום המסה לשיא יופיעו בחלון הנמוך של מסך ניתוח הנתונים. כדי לחפש בספריה ספקטרלית, הזז את הסמן למקום כלשהו בחלון הספקטרלי ולחץ פעמיים על לחצן העכבר הימני שתוצאות החיפוש בספריה יופיעו בחלון חדש. כדי להסיר תחילה את רעשי הרקע מקשת מעניינת, לחץ פעמיים על לחצן העכבר הימני בשיא המדובר ולאחר מכן לחץ על לחצן העכבר הימני באזור ללא פסגות מיד לפני שיא הריבית לחץ על לחצן ההפחתה ברצועת התפריט או בחר כרומטוגרמה לשורת התפריט ולאחר מכן הפחת ספקטרום מהתפריט הנפתח.

ספקטרום מופחת יוצג בחלון התחתון של מסך ניתוח הנתונים ויציג מקף לצד נתוני הסריקה בכותרת החלון. בעקבות פרוטוקול זה, זיהינו באופן לא סופי סך של 32 תרכובות כימיות נדיפות מניתוח של 14 סימני ריח של איברי המין שפורסמו באופן ספונטני על נייר סינון על ידי למורים אדומי וולאנים והשווינו פרופילי ריח עם תכונות של האיתות תרכובות נדיפות המתרחשות באופן טבעי כגון פחמימנים, טרפנים, אלכוהול טורפין וקטונים היו נוכחים בתוך פרופילים אלה וכוללים את התרכובות שנמצאו בעבר לשמש הורמוני מין ורמזים לכושר במינים אחרים של בעלי חיים. התרכובות שזוהו באופן לא סופי מפורטות בטבלה הראשונה.

כרומטוגרמות מייצגות אחת מבקר ואחת מסימן ריח לימה מוצגות באיור הראשון. מספרם ושפעם היחסי של הרכיבים נעו מדגם לדגימה על פני נושאי מחקר שונים. עם זאת, שש תרכובות שכותרתו A עד F על הכרומטוגרמה היו נוכחים בכל הדגימות.

תרכובות אלה היו בהתאמה מתכופף לגובה לאי של E אחד paracrystal הקסטל שש paramentha שני שמונה לצבוע אחד שני אורן ארבעה ו pentodecane. התוצאות ממחקר זה הראו כי למורים אדומי וולאנים משתמשים בסימון שנשלח כדי להעביר מידע על מין וגיל נקבה ללא סימון איברי המין לשחק תפקיד בתקשורת מינית סוציו. תוצאה מייצגת נוספת בעקבות השימוש בפרוטוקול זה הייתה המחקר שלנו של פרסומת פוריות על ידי בבונים זית נקבה.

זיהינו בסך הכל 74 תרכובות נדיפות מהניתוח של 395 דגימות ריח וגינאלי בבון נקבה. אלה כללו מגוון של תרכובות נדיפות ריח טבעי כגון קטונים, אלכוהול, אלדהידים, טרפנים, חומצות שומן נדיפות ופחמימנים. כרומטוגרמות טיפוסיות משמשות להשוואת דגימות ריח נרתיקי של טרול ריק ונקבות בבון מתקופות פוריות ולא פוריות מוצגות באיור 2.

אנו בוחנים את היחסים בין פרופילי ריחות וגינאליים לבין קליטה מינית של בבונים נשיים. התוצאות שלנו הראו כי הכמות הכוללת של ריח הנרתיק שונה עם פוריות עולה כי ריח עשוי לשחק תפקיד איתות פוריות הבבון הנשי. מצאנו גם הבדלים בריח הנרתיק בין סוגי קבוצות, אך לא יכולנו להבחין בין ההשפעות של הרכב הקבוצה, חוסר ההגינות בגיל הנשי.

זהו היתרונות המשולבים של הדגימה והשימוש ב- GCMS. אז באמצעות שטח הראש מוצק פאזה מיקרו החילוץ מאפשר מגוון רחב של דגימות שונות להיות מנותח באמצעות GCMS. אנחנו מסוגלים להפריד את הרכיבים של הסימונים המורכבים האלה ואז לזהות כל אחד מהרכיבים הבודדים האלה באמצעות ספקטרומטר המסה.

ואז, אז כל הטכניקה המשולבת היא חזקה מאוד ונותנת לנו הרבה מידע על סימוני ריח אלה, אשר בעבר היה הרבה מיצוי הכנה מדגם נדרש כדי להיות מסוגל להשיג את התוצאות.