אימות הגנום השלם רצף Nanopore, באמצעות וירוס אוסוטו כדוגמה
11 במרץ 2020
בעבר שאנו אימות פרוטוקול עבור amplicon מבוסס הגנום השלם וירוס אוסוטו (אוסווי) רצף על פלטפורמת רצף nanopore. כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות בפירוט רב יותר ולקבוע את קצב השגיאה של תא הזרימה nanopore R10.
אנו משתמשים ברצף גנטי של וירוסים כדי לנסות ולהבין מהיכן מגיעים וירוסים וכיצד הם מתפשטים. ועל מנת להשתמש בנתונים אלה בזמן אמת, למשל במהלך התפרצות, עלינו להבין בדיוק עד כמה מדויקים הנתונים שאנו מספקים. היתרונות העיקריים של טכניקות אלה הם שזה זול יחסית, זה מהיר, וזה מאפשר קידוד בסיס בזמן אמת אשר יכול לשמש רצף בשטח.
שיטה זו יכולה לשמש עבור הדור בזמן של נתוני רצף אשר, למשל, ניתן להשתמש כדי לקבוע את המקור של שפע של פתוגנים. טכניקה זו יכולה להיות מורכבת עבור משתמשים בפעם הראשונה וידע בסיסי יוניקס נדרש. במיוחד להתקנת חבילות התוכנה השונות.
הפריט החזותי של שיטה זו יסייע למשתמשים לקבוע את קצב השגיאה של פרוטוקולי רצף ספציפיים שלהם. ולענות על שאלות מחקר. הפעלת הרצף מתחילה במיניון המחובר ל- MinIT.
לאחר ביצוע רצף מראש על פלטפורמת Nanopore, לטעון את עומס הנתונים לתוך Porechop. כדי למנוע זיהום ולשפר את הדיוק, השתמש במקף התחתון שתיים, סמן ברקודים במקף תחתון והזן את הפקודה כמצוין. לאחר ביטול מולטיפלקסינג, השתמש cutadapt כדי להסיר רצפים ורצפים פריימר עם אורך קצר מ 75 נוקלאוטידים באמצעות הפקודה כפי שצוין.
השתמש ב- Minimap2 כדי למפות קריאות רצף דה-מולטיפלקס מול החלונית של זנים שונים של ייחוס באמצעות Minimap2. ולהשתמש Samtools כדי ליצור רצף קונצנזוס. עבור יישורים מבוססי התייחסות, חיוני ליצור מראש פיצוץ ולחפש עם רצף הקונצנזוס שנוצר כדי לזהות את זן הייחוס הקרוב ביותר.
לאחר מכן חזור על היישור המבוסס על הפניה עם זן ההפניה הקרוב ביותר כהפניה. כדי לקבוע את כיסוי הקריאה הנדרש כדי לפצות על פרופיל השגיאה ברצף Nanopore, בחר את מיפוי הרצף לאמפליקון אחד ולהשתמש ב- Minimap2 כדי למפות את קריאות Nanopore נגד אמפליקון זה. השתמש Samtools כדי לבחור רק את מיפוי קריאות Amplicon26 כדי להמיר את קובץ bam לתוך fastq באמצעות הפקודות כפי שצוין.
בחר באופן אקראי קבוצות משנה של, לדוגמה, 200 קריאות רצף אלף פעמים. כל קריאות הרצף שנבחרו באופן אקראי מיושרות ל- Amplicon26. השתמש ב- KMA כדי למפות את קריאות הרצף ולהפיק מיד רצף קונצנזוס באמצעות ההגדרות הממוטבות עבור רצף Nanopore כפי שצוין על ידי דגל הננו BC.
כדי לבדוק את רצפי הקונצנזוס שנוצרו, השתמש בפקודות כמצוין. כדי להציג את קצב השגיאות ב- txt של נקודות הסטטיסטיקה מתחת לכותרת, קצב השגיאות אינו תואם לבסיסים הממופים, השתמש בפקודה כמצוין. כדי להציג את מספר ה- indels מוצג תחת הכותרת indels לכל מחזור השתמש בפקודה כמצוין.
שימוש בתא הזרימה החדש בשילוב עם כפכף צבע הבסיס, כיסוי קריאה של פי 40 מביא לתוצאות זהות בהשוואה לריווח Illumina. כיסוי קריאה של 30 פעמים גורם לקצב שגיאות של 0.02%, התואם לשגיאה אחת בכל רצף של 585,000 נוקלאוטידים. בעוד כיסוי קריאה של 20 פעמים תוצאות שגיאה אחת בכל 63, 529 נוקלאוטידים רצף.
כיסוי קריאה של 10 פעמים גורם לשגיאה אחת בכל רצף של 3, 312 נוקלאוטידים. כלומר, מעל 3 נוקלאוטידים לכל ארבעה גנום וירוס Usutu נקראים לא בסדר. עם כיסוי קריאה מעל 30 פעמים, לא נצפו כופרים.
כיסוי קריאה של 20 פעמים גורם לגילויים של עמדה אחת indel בעוד כיסוי קריאה של 10 פעמים תוצאות indels ב 29 עמדות. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא, אם כי לא תמיד נראה לעין, עדכונים בתוכנה מתרחשים לעתים קרובות והוא יכול להשפיע על התוצאות. קיימות מספר אפשרויות לשימוש בתוכנות.
הדגמנו את התוכניות הנפוצות ביותר. אבל תוכנה שונה וגירסאות שונות של תוכנות אלה עלול לגרום לתוצאות שונות. הראינו לך דוגמה לאופן שבו אנו בודקים את איכות נתוני הרצף שאנו מייצרים.
וזה קריטי לתמיכה אמינה בהתפרצות.
סקירה כללית
מחקר זה מפרט פרוטוקול מתוקף לריצוף גנומי מלא של נגיף Usutu (USUV) מבוסס-אמפליקון באמצעות פלטפורמת ריצוף nanopore. השיטות מתוארות בפירוט, תוך התמקדות בקביעת שיעור השגיאות הקשור לתא זרימה (flow cell) מסוג R10 של nanopore.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- וירולוגיה
- גנומיקה
- טכנולוגיית ריצוף
רקע
- הבנת מקורות הנגיפים והפצתו באמצעות ריצוף גנטי.
- חשיבות של דיוק בנתונים במהלך התפרצויות.
- יתרונות של ריצוף nanopore: יעילות כלכלית ומהירות.
- מורכבות עבור משתמשים בפעם הראשונה הדורשת ידע בסיסי ב-Unix.
מטרת המחקר
- מתן מתודולוגיה מפורטת לריצוף של USUV.
- הערכת שיעורי השגיאה של ריצוף nanopore.
- שיפור הדיוק של פרוטוקולי ריצוף.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש ב-MinION וב-MinIT לצורך ריצוף.
- עיבוד נתונים באמצעות Porechop ו-cutadapt להסרת פריימרים.
- מיפוי רצפים באמצעות Minimap2 ויצירת רצפי קונסנסוס באמצעות Samtools.
- הערכת שיעורי שגיאה ומיקומי indel בהתבסס על כיסויי קריאה משתנים.
תוצאות עיקריות
- כיסוי קריאה של 30 פעמים מניב שיעור שגיאות של 0.02%.
- כיסוי גבוה יותר (מעל 30 פעמים) אינו מראה indels.
- כיסוי נמוך יותר גורם לעלייה בשגיאות וב-indels.
- עדכוני תוכנה עשויים להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הריצוף.
מסקנות
- ריצוף Nanopore הוא שיטה ישימה לתמיכה בזמן אמת בהתמודדות עם התפרצויות של מחלות.
- הבנת שיעורי השגיאה היא קריטית להפקת נתונים מהימנים.
- גרסאות תוכנה שונות עשויות להניב תוצאות משתנות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ריצוף מדויק של הגנום הנגיפי חיוני למענה בזמן אמת להתפרצויות ולמדעי האפידמיולוגיה הגנומית. הבנת שיעורי השגיאה הספציפיים לפלטפורמה מאפשרת הפקה אמינה של נתונים לצורך קבלת החלטות בתחום בריאות הציבור. תיקוף של ריצוף nanopore אל מול פלטפורמות מבוססות מבטיח ביטחון במעקב אחר פתוגנים ובניתוח תהליכי הדבקה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מקורות נגיפיים ומסלולי הדבקה באמצעות ריצוף גנומי ברמת דיוק גבוהה.
- ערך תפעולי: תומך בבדיקה מהירה של היפותזות במהלך התפרצויות בזכות יכולות ריצוף ניידות בזמן אמת.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים לריצוף גנום ויראלי מבוסס-אמפליקון עם הערכה כמותית של שיעור השגיאות.
- ערך תפעולי: מקל על שחזור הבדיקה באמצעות ספי סקרים (coverage) מוגדרים ואופטימיזציה של פרמטרי התוכנה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מייצר רצפי קונסנסוס המתאימים למחקרים תפקודיים המשכיים ולאפיון אנטיגני.
- ערך תפעולי: מאפשר קווי ייצור (pipelines) של ריצוף הניתנים להרחבה וניתנים להתאמה לאיומים ויראליים מתהווים עם תשתית מינימלית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה לגילוי נגיפים, מזיהוי ראשוני ועד לאפיון גנומי, ותומכת בזיהוי מועמדים מובילים לפיתוח תרופות אנטי-ויראליות באמצעות מעקב מדויק אחר זנים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת זיהוי מדויק של זנים ויראליים ומעקב אחר מוטציות לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות טיפוליות.
- סריקה: מספקת נתוני גנום כמותיים הניתנים לשחזור, המתאימים להערכת השפעות של תרכובות אנטי-ויראליות על האבולוציה הוויראלית.
- אנליטיקה: מייצרת מדדי שיעורי שגיאה ותדירויות של indel המשמשים לקביעת ספי השגות על איכות הנתונים לצורך קבלת החלטות go/no-go.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות מזיהוי התפרצות ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות אספקת נתונים עקביים של שושלות ויראליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת רצף ניידת הישמה על פני מספר משפחות של נגיפים ורשתות מעקב גיאוגרפיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרי אבולוציה נגיפית באמצעות ריצוף קונסנזוס עם תיקון שגיאות.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה בין מעבדות באמצעות כיסוי קריאה מוגדר (30x) ופרוטוקולי תוכנה לדיוק עקבי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go בפיתוח תרופות אנטי-ויראליות על ידי אספקת רקע גנומי מהימן על זנים במחזור.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מותאם סיכון המבוסס על אפידמיולוגיה נגיפית מאומתת גנטית.
שיקולי יישום
- נדרשת מיומנות בסיסית ב-Unix לצורך התקנת התוכנה והרצת פקודות בשורת הפקודה.
- תלוי בחומרת MinION/MinIT ובגישה לפאנלים של זני ייחוס לצורך יישור (alignment).
- מחייב תמיכת ביו-אינפורמטיקה רב-צוותית לצורך סטנדרטיזציה של זרימת העבודה ובקרת גרסאות של התוכנה.
- יש להביא בחשבון עדכוני תוכנה תכופים שעשויים לשנות את פרופילי השגיאות ואת תוצאות הקונסנזוס.
- היעילות מותנית בשמירה על כיסוי קריאה מינימלי (30x) כדי לדכא indels ולהשיג דיוק שווה ערך לזה של Illumina.
