דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף

אנו מתארים שיטה יעילה של טיהור ותרבות של תאי שושלת אוליגודנדרוליאליים. זה מאפשר לטפל במנגנונים המולקולריים השולטים בידול אוליגודנדרוציטים והאינטראקציות שלהם עם נוירונים במהלך תהליך ההיסוס. טכניקת טלטול זו אינה יקרה והיא אופטימלית להשגת כמות גבוהה של אוליגודנדרוציטים.

תרבויות כאלה מאפשרות את הייצור של oligodendrocyte מותנה בינוני ותרבויות שיתוף של אוליגודנדרוציטים עם נוירונים. טרשת נפוצה היא מחלה הנגרמת על ידי דה-מיאלינציה מוקדית במערכת העצבים המרכזית, משנית לאובדן אוליגודנדרוציטים. תרבות אוליגודנדרוציטים מספקת כלי להבנה טובה יותר כיצד לקדם מייאלציה מחדש.

רק תרבות התאים האוליגודנדרוליאלית יכולה לספק תובנות על מנגנונים פנימיים המסדירים התפתחויות וביולוגיה של אוליגודנדרוציטים. תרבויות שיתוף עם נוירונים מאפשרים לקבל תובנה לגבי ההשפעות שלהם על הפיזיולוגיה העצבית. כדי להתחיל, השתמש במקלעות מעוגלים כדי לשמור על ראש החיה ברמת העיניים.

השתמש במספריים כירורגיים קטנים כדי לבצע חתך קטן בבסיס הגולגולת לחתוך את הגולגולת בעקבות קו האמצע של המוח. השתמש מדפים בעדינות לקלף את שני החלקים של הגולגולת מקו האמצע. השתמש בכף כירורגית קטנה כדי להסיר את המוח מחולל הראש.

שים את המוח בצלחת פטרי 60 מילימטר המכיל קרח קר PBS גלוקוז על קרח. צפייה תחת מיקרוסקופ סטריאו, להשתמש במטסים עדין כדי להסיר את המוח הקטן, גזע המוח, ואת נורות הריח מן ההמיספרות המוחיות. השתמש במטסים עדין כדי להפריד בין שתי ההמיספרות המוחיות.

השתמש מטסים בסדר לקלף את קרום ההריון. שים את קליפת המוח בצלחת פטרי 60 מ"מ על קרח. במכסה המנוע לזרימת למינאר, השתמש באזמל חד כדי לקצוץ דק את קליפות המוח.

מעבירים את הרקמה הטחון לצינור 50 מיליליטר המכיל מדיום עיכול אנזימים. אינקובט במשך 30 דקות באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי להסיר בעדינות את מדיום עיכול האנזים תוך הקפדה כי רקמת קליפת המוח נשאר בתחתית הצינור.

השתמש במיקרופיפט P1000 כדי להוסיף מיליליטר אחד של סרום עגל עוברי DMEM 10% ולתפור בעדינות את הרקמה. השתמש במסנן 70 מיקרון ובוכנה של מזרק של מיליליטר אחד כדי לסנן את רקמת קליפת המוח לצינור של 50 מיליליטר. יש לשטוף את שאריות הרקמה על קיר הצינור הפנימי של הצינור בן 50 המיליליטר מספר פעמים עם סרום עגל עוברי DMEM 10%.

מלאו את הצינור של 50 מיליליטר בסרום עגל עוברי DMEM 10%. צנטריפוגה ב 423 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא עם שני מיליליטר של DMEM 10% נסיוב עגל עוברי.

בעדינות triturate גלולת התא עם micropipette P1000 ולאחר מכן, עם מיקרופיפט P200. לדלל את ההשעיה התא עם אמצעי האחסון המתאים של DMEM 10%סרום עגל עוברי. צלחת חמישה מיליליטר של ההשעיה התא על בקבוק T-150 בצפיפות של אחד פעמים 10 לתאים החמישי לס"מ מרובע.

הוסיפו 20 מיליליטר של סרום עגל עוברי DMEM חם 10% לכל בקבוק T-150. דגירה באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לאחר טלטול המדגם לילה ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס, לקצור את העל טבעי בבקבוק המכיל בעיקר תאי שושלת oligodendrocyte, אלא גם, כמה תאים microglial, צלחת אותו על מנות פטרי מצופה 100 מילימטר.

הדגירה את מנות פטרי במשך 15 דקות באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. זה מאפשר הסרה של תאים microglial באמצעות הידבקות מהירה דיפרנציאלית על פני המנה. בינתיים, מלאו כל בקבוק T-150 ב-25 מיליליטר של מדיום תרבות חם ומוכן טרי ודגירה באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני עד לרעידות השניות.

לאחר מכן, מעבירים את העל-טבעי ממנות פטרי למנות פטרי חדשות שאינן מצופות באורך 100 מ"מ כדי לאפשר הידבקות בתאי מיקרו-גליאליים שיורית. הדגירה את מנות פטרי במשך 15 דקות באינקובטור לח ב 37 צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. מוציאים את העל-טבעי מכל שתי מנות פטרי, המכילות תאי שושלת אוליגודנדרוציטים שאינם חסידים, ומעבירים אותו לצינור של 50 מיליליטר.

השליכו את מנות פטרי מצופות במיקרוגליה. צנטריפוגה הצינורות במשך חמש דקות ב 423 פעמים g. בזהירות להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא עם מיליליטר אחד של מדיום בוטנשטיין-סאטו.

בריכת כל כדורי בצינור 50 מיליליטר משותף ולהתאים את עוצמת הקול ל 20 או 30 מיליליטר בהתאם לצפיפות התא עם מדיום Bottenstein-Sato. צלחת שתיים או שלוש מנות פטרי 100 מ"מ מראש עם 10 מיליליטר של ההשעיה התא. דגירה באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני.

שעתיים לאחר מכן, נקה את הפסולת ממנות פטרי על ידי רענון כל מדיום בוטנשטיין-סאטו. אינקובט במשך יומיים במדיום באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לאחר יומיים, לבחון את התרבות תחת מיקרוסקופ.

במכסה המנוע לזרימה למינארית, בתנאים סטריליים, לחדש את מדיום התרבות עם 10 מיליליטר של MPB-27 בינוני חם. אינקובט במשך יומיים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. כדי לקצור את OCM, לאסוף את העל טבעי המכיל אוליגודנדרוציטים מופרש גורמים.

המסנן מעקר את ה- OCM באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. בפרוטוקול זה, תאי שושלת אוליגודנדרוציטים טוהרו מתרבויות גליה על ידי טלטול אסטרוציטים ומיקרוגליה. ניתוח של הביטוי של סמנים שונים הצביע על כך שתרבויות אוליגודנדרוציטים היו בעיקר טרום אוליגודנדרוציטים עם 90 פלוס או מינוס 4% של תאים חיוביים O4, 85 פלוס או מינוס 7%NG2 תאים חיוביים, ו 4.7 פלוס או מינוס 2.1% של תאים חיוביים PLP, בעוד 7.2 פלוס או מינוס 2.5% מהתאים היו אסטרוציטים חיוביים GFAP.

OCM המיוצר מתרבויות כאלה נוספו בשלושה ימים במבחנה לתרבויות נוירון ההיפוקמפוס מטוהרים. טיפול זה מקדם קיבוץ של חלבונים לנטל. מיאלינציה של נוירונים בהיפוקמפוס נחקרו באמצעות תוספת של אוליגודנדרוסטיות ב 14 ימים במבחנה.

בין 20 ל -24 ימים במבחנה, כתמים חיסוניים של סמני מיאלין, כגון חלבון בסיסי מיאלין, אפשרו הדמיה של מקטעי מיאלין וצמתים של Ranvier. Core PBS חשוב להסרת קרום ההת קרום. ניקוי מהיר הוא קריטי עבור oligodendroctyes הכדאיות ומימוש החוזקות של הזרימה להחיל עם פיפטה.

מדיום מותנה אוליגודנדרוציטים ניתן להוסיף תרבויות עצביות כדי לקבל תובנה על ההשפעה של oligodendroctyes מופרש גורמים על פיזיולוגיה עצבית. תרבויות שותף של אוליגודנדרוסטיות עם נוירונים יכולות להתבצע גם כדי ללמוד את תהליך ההיריון.