Name: דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: למד שיטה יעילה לטיהור תאי אוליגודנדרוציטים וייצור תרבית מותנית לחקר מנגנוני מיאלינציה ואינטראקציות עם נוירונים. שיטה זו תורמת להבנת תהליכי שיקום מיאלין במחלות דמיאלינציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לרמי רוננזנו על עצתו הנבונה בעריכת כתב היד. עבודה זו ממומנת על ידי ICM, INSERM, מענק הקרן ARSEP כדי NSF, ו-Bouvet-Labruyère מחיר.

הטיפול והשימוש בחולדות בניסוי זה תואמים למדיניות ולהנחיות המוסדיים (UPMC, INSERM, והוראת מועצת הקהילה האירופית 86/609/EEC). הפרוטוקול הבא מבוסס על המלטה הסטנדרטית של 12 גורים.
1. הכנת מבחנות (~ 5 דקות)
הערה: בצע את השלבים הבאים ביום שלפני הניתוח בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
<ol><li>מעיל 150 ס"מ2 מבחנות (T150) עם כובע מסנן (1 בקבוקון עבור 2 גורים) באמצעות 5 מ ל פוליאתילן (פיי, 100 Mg/L, ראה פרוטוקול בקובץ משלים 1).</li>
	<li>לאחסן את מבחנות ב 4 ° c בלילה.</li>
	<li>לשטוף צלוחיות מצופה 3 פעמים עם מים מזוקקים סטרילי ביום של ניתוח.</li>
</ol>2. הכנת מדיה (~ 10 דקות)
הערה: בצע את השלבים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
<ol><li>להכין 500 mL של בינוני התרבות, המורכב של מדיום שונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום עגל עוברי (FCS) ו פניצילין-סטרפטומיצין (100 IU/mL).</li>
	<li>להכין 20.6 ml של העיכול האנזים בינוני בצינור 50 ml, המורכב 20 מ ל של dmem, 200 μl של dnase (50 μg/ml), 200 μl של פפאין (30 U/ml) ו-200 μl של l-cysteine (0.24 mg/ml).</li>
	<li>סינון-לחטא את המדיה באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.</li>
	<li>השאר את המדיה במכסה הזרימה הלבינארי בטמפרטורת החדר (RT) עד לחיתוך.</li>
</ol>3. הכנה לחיתוך (~ 10 דקות)
הערה: בצע את השלבים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
<ol><li>הכינו 100 מ"ל של תמיסת מלח מוזרמת פוספט ללא סידן ומגנזיום (PBS; 1x). סינון מסננים באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.</li>
	<li>להכין 50 mL של הקרח קר 1x PBS הפתרון שיושלם עם 750 μL של 45% גלוקוז. סינון מסננים באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.</li>
	<li>ממלאים צלחת פטרי 100 מ"מ עם PBS 1 x עבור כלי ניקוי ו 3 60 מ"מ מנות פטרי עם הקרח קר PBS-גלוקוז לקצירת רקמות. שימי את צלחות הפטרי. על הקרח עד לניתוח</li>
</ol>4. חיתוך והרכבה
הערה: הניתוח מבוצע מפני כלבלבים של גברים ונשים ביום אחרי הלידה (P) 2.
<ol><li>על מנת לספק סביבה סטרילית, ודא לנקות את הספסל עם 100% אתנול. לחטא את כל כלי הניתוח עם 100% אתנול.</li>
	<li>בעדינות לרסס את הצוואר של הגור עם 70% אתנול.</li>
	<li>השתמש במספריים כירורגיים גדולים כדי לערוף את ראשו של בעל החיים ולהניח את הראש בצלחת פטרי בגודל 100 מ"מ, המכילה קרח קר-מסוכר-PBS.</li>
	<li>השתמש מלקחיים מעוקל כדי לשמור על ראש החיה בגובה העיניים. השתמש במספריים כירורגי קטן כדי ליצור חתך קטן בבסיס הגולגולת לחתוך את הגולגולת בעקבות המוח באמצע הקו.</li>
	<li>השתמש מלקחיים כדי לקלף בעדינות את שני חלקי הגולגולת מאמצע הקו.</li>
	<li>השתמשו בכפית כירורגית קטנה כדי להסיר את המוח מחלל הראש. הכניסו את המוח לצלחת פטרי ב60 מילימטר המכילה את הקרח הקר-גלוקוז על הקרח.</li>
	<li>הצגת תחת steromicroscope, השתמש מלקחיים עדינים כדי להסיר את המוח העורקי, את המוח ואת נורות הריח מהמיאונות מוחין.</li>
	<li>השתמש מלקחיים עדינים כדי להפריד בין שתי אונות המוח. השתמש בלקחיים עדינים. כדי לקלף את הקרום שימו את מערבולות המוח. בצלחת 60 מ"מ בקרח הערה: הקרח הקר PBS הוא קריטי להסרת הקרומי הקרום הנכון.</li>
</ol>5. הדיסוציאציה מרקמת
הערה: בצע את השלבים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
<ol><li>השתמש באזמל חד כדי לקצוץ. את מסדר המוח להעביר את הרקמה הטחון לתוך צינור 50 mL המכיל מדיום העיכול האנזים.</li>
	<li>דגירה של 30 דקות בתוך מחולל לחות בחממה ב 37 ° c תחת 5% CO2.</li>
	<li>השתמש p1000 מיקרופיפטה כדי להסיר בעדינות את המדיום עיכול האנזים תוך כדי לוודא כי רקמת קליפת העור נשאר בתחתית הצינור 50 mL.</li>
	<li>השתמש p1000 מיקרופיפטה כדי להוסיף 1 מ ל של dmem-10% fcs ובעדינות קצוצות את הרקמה.</li>
	<li>השתמש מסנן 70 יקרומטר ובוכנה של מזרק 1 mL כדי לסנן את רקמת הקליפת העור לתוך צינור 50 mL. הערה: ניתן לשטוף שרידי רקמות על קיר הצינור הפנימי מספר פעמים עם DMEM-10% FCS.</li>
	<li>מלאו את צינור 50 mL עם DMEM-10% FCS. צנטריפוגה ב 423 x g עבור 5 דקות ב RT. בזהירות להסיר supernatant והשהה מחדש את הגלולה תא עם 2 מ ל-10% fcs.</li>
	<li>בעדינות הטריטורטה עם כp1000 מיקרופיפטה ולאחר מכן עם מיקרופיפטה p200. דלל את ההשעיה של התא בנפח המתאים של DMEM-10% FCS. הערה: שני מוחות = 1 T150 = 5 מ ל של DMEM-10% FCS.</li>
	<li>צלחת 5 מ ל של השעיה התא על T150 בצפיפות של 1 x 105 תאים/ס"מ2. הוסף 20 מ ל של DMEM חם-10% FCS לכל T150. מודטה באינקובטור מחולל לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2.</li>
	<li>לחדש את המחצית של מדיום התרבות לאחר 6 ימים ב-"מתורבת" (DIV) עם DMEM חם 10% FCS.</li>
</ol>6. הכנה לטלטול
<ol><li>לבצע הכנה לרעוד ביום לפני לרעוד בתוך מכסה זרם למינארי בתנאים סטרילי.</li>
	<li>לחדש מחצית מדיום התרבות על-ידי הוספת מדיום חדש לתרבות חם לתוך הבקבוקון ואת הדגירה ב 37 ° c תחת 5% CO2.</li>
</ol>7. טלטול
<ol><li>מעיל 3 100 מ"מ מנות פטרי עם פיי. אחסן אותם ב -4 ° c בלילה.</li>
	<li>לכסות את כובע מבחנות עם סרט פרפין ולשים את צלוחיות לתוך שקית ניילון. לנער מבחנות המכילות תאים גליה לילה ב 250 rpm ב 37 ° c. הערה: הטלטול הראשון מבוצע ב-8 DIV ואחד יכול לבצע עד שלושה מלכים שונים (ראה איור 1 לתזמון).</li>
</ol>8. OL תאים השושלת קצירת ותרבות
הערה: יש לבצע צעדים אלה בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
<ol><li>ביום שלאחר הטלטול, הכינו את המדיום בונשטיין-סאטו (BS) לפי שולחן 1.</li>
	<li>שוטפים מנות פטרי מצופות 3 פעמים עם מים מזוקקים סטרילי.</li>
	<li>מבחנות הקציר ' supernatant המכיל בעיקר OL השושלת תאים אבל גם כמה תאים microglial ולוחית אותו על שאינם מצופים 100 mm מנות פטרי. הערה: שלב זה מאפשר הסרה של תאים microglial דרך הדבקה מהירה דיפרנציאלית על משטח המנה.</li>
	<li>מכבית את מנות פטרי במשך 15 דקות באינקובטור מחולל ב37 ° c תחת 5% CO2.</li>
	<li>למלא כל T150 בקבוקון עם 25 מ ל של מדיום התרבות חם טרי מוכן מודטה בחממה מחולל לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2 עד הרעד השני.</li>
	<li>העבירו את הסופרנטאנט מצלחות פטרי לתוך מנות פטרי חדשות שאינן מצופות 100 מ"מ כדי לאפשר הדבקה של תאי microglial שיורית.</li>
	<li>מכבית את מנות פטרי במשך 15 דקות באינקובטור מחולל ב37 ° c תחת 5% CO2.</li>
	<li>הסר את הסופרנטאנט, המכיל תאי שושלת היוחסין של OL שאינו חסיד, והעבר אותו לצינורות 50 mL (סופרנטאנט מ -2 מנות פטרי לצינור 50 mL). התעלם מצלחות פטרי מצופה microglia.</li>
	<li>צנטריפוגה את הסופרנטאנט במשך 5 דקות ב 423 x g. הסר בזהירות את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה עם 1 mL של BS בינונית. הבריכה כל כדורי בצינור 50 mL משותף ולהתאים את עוצמת הקול ל 10 mL עם BS בינונית.</li>
	<li>קביעת צפיפות התא לספירת תאים תחת מיקרוסקופ. הערה: יש להשיג צפיפות תא בין 3 x 105/ml ו-5 x 105/ml.</li>
	<li>הוסף 20 מ ל BS אם צפיפות התא גבוהה יותר או שווה ל-4 x 105/mL כדי לקבל נפח סופי של 30 מ"ל, או להוסיף רק 10 מ ל BS אם צפיפות התא היא פחות מ 4 x 105/ml כדי לקבל נפח סופי של 20 mL.</li>
	<li>צלחת שניים או שלושה מצופה מראש 100 מ"מ מנות פטרי עם 10 מ ל של השעיית תאים. מודטה באינקובטור מחולל לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2.</li>
	<li>לנקות את ההריסות מן הצלחות פטרי על ידי רענון כל BS בינונית 2 h מאוחר יותר. הערה: בדוק את התרבות תחת המיקרוסקופ לפני ואחרי ניקוי כדי לוודא צפיפות התא ויעילות של הסרת פסולת.</li>
	<li>דגירה עבור 2 ימים ב BS בינונית בחממה לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2. הערה: בחנו את התרבות שמתחת למיקרוסקופ. המפגש אמור להיות 70% עד 80%.</li>
</ol>9. ייצור OCM
הערה: בצע את השלבים הבאים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
<ol><li>הכיני NB-B27low בינונית לפי שולחן 2.</li>
	<li>חידוש בינוני התרבות עם 10 מ ל מדיום חם NB-B27low. דגירה עבור 2 ימים בתוך מחולל החממה ב 37 ° c תחת 5% CO2.</li>
	<li>לקצור את OCM, כלומר, supernatant המכיל גורמים מופרש OL. סינון-לחטא ocm באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר. הערה: אחסן OCM ב -4 ° c עבור מקסימום 2 חודשים.</li>
</ol>10. תוספת OCM
הערה: יש לבצע את הצעדים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים. OCM ניתן להוסיף מטוהרים היפוקמאל תרבויות עצב מוכן על פי הפרוטוקול הבא14, ומושגת על ידי הוספת, 24 שעות לאחר בידוד, סוכני anti-mitotic ומקבל 5-fluorאודלדין (5 μm) עבור 36 h.
<ol><li>ב 3 DIV, להסיר את כל בינוני תרבות העצב המכיל anti-mitotic סוכנים ולהוסיף 500 μL של חדש חם OCM.</li>
	<li>לחדש חצי בינוני כל 3 ימים עם חם תוצרת NB-B27. הערה: ניתן לשמור על תרבויות כאלה עד 21 DIV.</li>
</ol>11. הוספת מטהר לתרבות הנוירונים
הערה: בצע את השלבים הבאים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים. ניתן להוסיף כלים לתרביות מטוהרים היפוקמאל באותו אופן כפי שמתואר לעיל.
<ol><li>הכינו מדיום לשיתוף התרבות לפי שולחן 3.</li>
	<li>לאחזר את התרבות OL ב 70% כדי 80% זרימה. לשטוף עם 2 מ"ל של חם 1x PBS.</li>
	<li>כדי לנתק את התאים, הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין לצלחת פטרי 100 מ"מ.</li>
	<li>מודטה עבור 5 דקות בחממה לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2.</li>
	<li>הוסף 2 מ ל של DMEM-10% FCS כדי לחסום את התגובה האנזימטית. לקצור את הסופרנטנט המכיל תאים השושלת OL.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 423 x g עבור 5 דקות ב RT. בזהירות להסיר supernatant ולהשעות את הגלולה התא במדיום התרבות המשותף חם כדי לקבל ריכוז של 1.25 x10 תאים/ mL.</li>
	<li>הוסף OL לתרבות הנוירונים מטוהרים היפוקמאל על ידי הסרת 200 μL של בינוני תרבות העצב והוספת 200 μL של התא ההשעיה לכל טוב (2.5 x 104 תאים/גם) של צלחת 24.</li>
	<li>לרענן חצי מדיום שיתוף התרבות כל 2-3 ימים. הערה: ניתן לשמור על תרבויות שיתוף עד 24 DIV.</li>
</ol>

<ol><li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acquisition+of+myelin%3A+a+success+story%5BTitle%5D)+AND+%22Novartis+Foundation+Symposium%22%5BJournal%5D)">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li>
<li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li>
<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li>
<li>Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li>
<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li>
<li>Frühbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604(2013).</li>
<li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993(2014).</li>
<li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222(2015).</li>
<li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+in+the+Central+Nervous+System%3A+Structure%2C+Function%2C+and+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li>
<li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li>
<li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte%2C+Astrocyte%2C+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development%2C+Damage%2C+and+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).</li>
<li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li>
<li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+steps+of+oligodendrogenesis%3A+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li>
<li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li>
<li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li>
<li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573(2019).</li>
<li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li>
<li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression%3A+in+vitro+models+of+proliferation%2C+differentiation+and+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li>
<li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li>
<li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li>
</ol>

לאף אחד מהמחברים אין אינטרסים מתחרים או אינטרסים סותרים.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לקבל מועשר ביותר oligodendroglial היוחסין תרבויות תאים מתרבויות גליה מעורבים, מותאם מתוך שיטה שפורסמה בעבר16, ואת הייצור הבא של מדיום ממוזג. טכניקה זו רועדת לא יקר, ניתן לחזור שלוש פעמים והוא אופטימלי להשיג כמות גבוהה של מטוהרים מטוהר, כמו תאים התרבותי בבונשטיין-סאטו (BS) בינוני המכיל PDGFα מתרבים. התאים glial מוכנים באמצעות מוחין של חולדות Wistar ב P2, נקודת זמן שבה רוב המכריע של התאים הoligodendroglial השושלת הם pre-oligodendrocytes הפוך להביע NG2 ו O4<sup clas...

Oligodendrocytes הפוך (OLs) הם תאים גליאל של מערכת העצבים המרכזית (CN) היוצרים גלישת מיאלין סביב axons. OLs מקורם אוליגודנדרוציטים התאים הקודמי (OPCs) אשר מתרבים בתוך האזורים החדרית של ה-CN העובריים ולאחר מכן להעביר ולהבדיל ל-OLs בוגרת לחלוטין (כלומר, מיאלין ויוצרים תאים)1. OPCs הם שופע במהלך התפתחות מוקדמת, אבל גם להתמיד במוח המבוגר שבו הם מייצגים את האוכלוסייה הגדולה מתרבים תאים2. אחד משני מספר אקסונים בחלקים שאינם להתרגש (כלומר, internodes), ואת הקצה של כל לולאה מיאלין מתחבר אקסונים להרכיב את מתחם פרבודאל אשר חיוני עבור תכונות בידוד של מיאלין1,3. בין הפרפרדות ישנם פערים קטנים ללא מיאלואידית המכונים הצמתים של רנייה. צמתים אלה עשירים בערוצי נתרן מגודרת מתח (ניווט), המאפשר התחדשות והתפשטות מהירה של פוטנציאל הפעולה באמצעות הולכה המלח4. זה אינטראקציה הדוקה גם מאפשר לתמיכה באנרגיה סיבי באמצעות ספיגה עצבית של לקטט מ-OLs5,6.
ההבשלה של תאים oligodendroglial השושלת ואת תהליך מיאלונציה מוסדר בחוזקה על ידי האינטראקציות שלהם עם נוירונים7. אכן, OLs ו-OPCs, בשם גם NG2 תאים, לבטא מערך של קולטנים עצביים, והוא יכול לקבל קלט מפני הנוירונים והדיכוי הדיכוי, המאפשר להם לחוש פעילות עצבית שיכולה לעורר את התפשטות שלהם ו/או בידול לתאים מיאלואידית2. בתורו, opcs/OLs להפריש מיקרושלפוחיות וחלבונים לתוך החלל מתוך מסחטות אשר בלבד או סינגיסיסטי מתווך neuromodulative ופונקציות נוירוגינים8,9,10,11,12. עם זאת, מנגנונים מולקולריים שליטה על מצבים מרובים של אינטראקציות בין תאי השושלת oligodendroglial ונוירונים עדיין להיות מפוענח לחלוטין.
כמו-כן, במספר מצבים פתולוגיים, מושפעות בעיקר, ובכך מטרידים את האינטראקציה שלהם עם נוירונים. למשל, טרשת נפוצה (MS), תפקוד נוירולוגי נגרמת על ידי deמיקוד מוקד ב-cn, משני לאובדן OLs שיכול להוביל לנזק סיבי הצטברות נכות קשורה. מחדש יכול להתרחש, אם כי לא מספיק ברוב המקרים13. התקדמות בעשור האחרון, בשל התפתחות של טיפולים חיסוני, יש להפחית את שיעור הנסיגה אבל לקדם את השרידים מיאלונציה כדי לצאת הצורך בלתי מתקיים. ככזה, הבנה טובה יותר של התפקידים, פונקציות והשפעות הוא עניין מיוחד לפיתוח של טיפולים חדשים לספקטרום רחב של תנאי ה-CN.
כאן, אנו מתארים את שיטות הטיהור והתרבות של הולים. הדבר מאפשר בדיקה מדויקת של מנגנונים פנימיים המסדירים את התפתחותם ואת הביולוגיה. בנוסף, מאוד מועשר בתרבויות מסוג OLs מאפשרים ייצור של בינוני ממוזג (OCM), אשר ניתן להוסיף לתרבויות נוירונים מטוהרים כדי לקבל תובנה לתוך ההשפעה של גורמים מופרשים על פיזיולוגיה נוירואליות וקישוריות. יתר על כן, אנו מתארים כיצד ליישם במערכת תרבות שיתוף מחוץ לגוף החברה שבו מטוהרים oligodendrocytes הפוך ונוירונים משולבים יחד, המאפשר לטפל במנגנון הוויסות (re) מיאלונציה.

<table><tbody><tr><td>תוסף 5-fluorodeoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-תמיסת גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 100% </td><td>Sigma</td><td>32221-M</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 70%</td> <td>VWR Chemicals</td><td>83801.360</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>סיגמא</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>NeuroBasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>פפאין</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חומצה פוספט ללא סידן ומגנזיום</td><td>ThermoFisher</td><td>A1285601</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילנימין (PEI)</td> <td>Sigma</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborate decahydrate</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>Bottenstein-Sato (BS) media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin Human</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>BSA (אלבומין סרום בקר)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-13A</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>פרוגסטרון</td><td>סיגמא</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>פוטרסין דיהידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סלניט</td><td>סיגמא</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (מלח נתרן 3,3',5-טריודו-L-תירונין)</td><td>סיגמא</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>T4 ( L-תירוקסין)</td><td>סיגמא</td><td>T1775</td><td></td></tr><tr><td><חזק>קו-תרבית מדיה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אפו-טרנספרין אנושית</td><td>סיגמא</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>B27 תוסף</td> תזונה <td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>סיגמא</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>BSA (אלבומין סרום בקר)</td><td>סיגמא</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>סרולופלסמין</td><td>סיגמא</td><td>239799</td><td></td></tr><tr><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>סיגמא</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל-L-ציסטאין</td><td>סיגמא</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NeuroBasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>פרוגסטרון</td><td>סיגמא</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>פוטרסין</td><td>סיגמא</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי CNTF</td><td>סיגמא</td><td>450-13</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סלניט</td><td>סיגמא</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (מלח נתרן 3,3',5-טריודו-L-תירונין)</td><td>סיגמא</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>ויטמין B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 ומיקרו; m פילטר</td><td>Sartorius</td><td>514-7010</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>Terumo</td><td>1611127</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחת פטרי</td><td>Dutscher</td><td>193100</td><td></td></tr><tr><td>צינור 15 מ"ל</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td>734-1867</td><td></td></tr><tr><td>צינור 50 מ"ל</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td>734-1869</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 מ"מ</td><td>Dutscher</td><td>067003</td><td></td></tr><tr><td>70 & מיקרו; m filter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ משקפת</td><td>אולימפוס</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים גדולים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>סוואן-מורטון</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים קטנים</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>כף כירורגית קטנה</td><td>בר נאור בע"מ</td><td>BN2706</td><td></td></tr><tr><td>T150 ס"מ2 בקבוק עם מכסה פילטר</td><td>Dutscher</td><td>190151</td><td></td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Wistar עכברוש</td><td>Janvier</td><td>RjHAn:WI</td><td></td></tr></tbody></table>

דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

במערכת העצבים המרכזית, oligodendrocytes הפוך ידועים בתפקידם ב אקסון מיאלונציה, האיצה את התפשטות הפוטנציאל של הפעולה באמצעות הולכה מוכרת. יתר על כן, מספר גדל והולך של דיווחים מראים כי oligodendrocytes הפוך אינטראקציה עם נוירונים מעבר מיאלואידית, בעיקר באמצעות הפרשה של גורמים מסיסים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המאפשר טיהור של תאים oligodendroglial היוחסין מתרבויות התאים גליה גם מכיל האסטרוציטים ותאי microglial. השיטה מסתמכת על לילה רועד ב 37 ° c, אשר מאפשר התנתקות סלקטיבית של תאים oligodendroglial ותאי microglial, ואת חיסול של מיקרוגלייה על ידי הדבקה דיפרנציאלית. לאחר מכן נתאר את התרבות של oligodendrocytes הפוך וייצור מדיום ממוזג (OCM). כמו כן, אנו מספקים את קינטיקה של טיפול OCM או oligodendrocytes הפוך נוסף על נוירונים מטוהרים היפוקמאל בניסויים שיתוף תרבות, לימוד אינטראקציות אוליגודנדרוציטים-נוירונים.

בפרוטוקול זה, תאים השושלת OL מטוהרים מתרבויות גליה על ידי ניעור האסטרוציטים ו microglia. טוהר הבדיקה פנוטימית של תרבויות OL יכול להיות מוערך על ידי הכתמים עם סמנים גליה15. ניתוח הביטוי של סמנים שונים עולה כי תרבויות OL היו בעיקר pre-OLs עם 90% ± 4% של O4+ תאים, 85% ± 7% NG2+ תאים, ו 4.7% ± 2.1% של plp+ תאים, בעוד 7.2% ± 2.5% של תאים היו gfapו אסטרוציטים (ממוצע ± ש גויטיין, n = 3; איור 2). בנו...

להלן, אנו מציגים שיטה יעילה לטיהור של oligodendrocytes הפוך וייצור של מדיום אוליגודנדרוציטים ממוזג שניתן להשתמש בהם לניסויים בשיתוף התרבות.

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

אנו מתארים שיטה יעילה של טיהור ותרבות של תאי שושלת אוליגודנדרוליאליים. זה מאפשר לטפל במנגנונים המולקולריים השולטים בידול אוליגודנדרוציטים והאינטראקציות שלהם עם נוירונים במהלך תהליך ההיסוס. טכניקת טלטול זו אינה יקרה והיא אופטימלית להשגת כמות גבוהה של אוליגודנדרוציטים.תרבויות כאלה מאפשרות את הייצור של oligodendrocyte מותנה בינוני ותרבויות שיתוף של אוליגודנדרוציטים עם נוירונים. טרשת נפוצה היא מחלה הנגרמת על ידי דה-מיאלינציה מוקדית במערכת העצבים המרכזית, משנית לאובדן אוליגודנדרוציטים. תרבות אוליגודנדרוציטים מספקת כלי להבנה טובה יותר כיצד לקדם מייאלציה מחדש.רק תרבות התאים האוליגודנדרוליאלית יכולה לספק תובנות על מנגנונים פנימיים המסדירים התפתחויות וביולוגיה של אוליגודנדרוציטים. תרבויות שיתוף עם נוירונים מאפשרים לקבל תובנה לגבי ההשפעות שלהם על הפיזיולוגיה העצבית. כדי להתחיל, השתמש במקלעות מעוגלים כדי לשמור על ראש החיה ברמת העיניים.השתמש במספריים כירורגיים קטנים כדי לבצע חתך קטן בבסיס הגולגולת לחתוך את הגולגולת בעקבות קו האמצע של המוח. השתמש מדפים בעדינות לקלף את שני החלקים של הגולגולת מקו האמצע. השתמש בכף כירורגית קטנה כדי להסיר את המוח מחולל הראש.שים את המוח בצלחת פטרי 60 מילימטר המכיל קרח קר PBS גלוקוז על קרח. צפייה תחת מיקרוסקופ סטריאו, להשתמש במטסים עדין כדי להסיר את המוח הקטן, גזע המוח, ואת נורות הריח מן ההמיספרות המוחיות. השתמש במטסים עדין כדי להפריד בין שתי ההמיספרות המוחיות.השתמש מטסים בסדר לקלף את קרום ההריון. שים את קליפת המוח בצלחת פטרי 60 מ"מ על קרח. במכסה המנוע לזרימת למינאר, השתמש באזמל חד כדי לקצוץ דק את קליפות המוח.מעבירים את הרקמה הטחון לצינור 50 מיליליטר המכיל מדיום עיכול אנזימים. אינקובט במשך 30 דקות באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי להסיר בעדינות את מדיום עיכול האנזים תוך הקפדה כי רקמת קליפת המוח נשאר בתחתית הצינור.השתמש במיקרופיפט P1000 כדי להוסיף מיליליטר אחד של סרום עגל עוברי DMEM 10% ולתפור בעדינות את הרקמה. השתמש במסנן 70 מיקרון ובוכנה של מזרק של מיליליטר אחד כדי לסנן את רקמת קליפת המוח לצינור של 50 מיליליטר. יש לשטוף את שאריות הרקמה על קיר הצינור הפנימי של הצינור בן 50 המיליליטר מספר פעמים עם סרום עגל עוברי DMEM 10%.מלאו את הצינור של 50 מיליליטר בסרום עגל עוברי DMEM 10%. צנטריפוגה ב 423 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא עם שני מיליליטר של DMEM 10% נסיוב עגל עוברי.בעדינות triturate גלולת התא עם micropipette P1000 ולאחר מכן, עם מיקרופיפט P200. לדלל את ההשעיה התא עם אמצעי האחסון המתאים של DMEM 10%סרום עגל עוברי. צלחת חמישה מיליליטר של ההשעיה התא על בקבוק T-150 בצפיפות של אחד פעמים 10 לתאים החמישי לס"מ מרובע.הוסיפו 20 מיליליטר של סרום עגל עוברי DMEM חם 10% לכל בקבוק T-150. דגירה באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לאחר טלטול המדגם לילה ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס, לקצור את העל טבעי בבקבוק המכיל בעיקר תאי שושלת oligodendrocyte, אלא גם, כמה תאים microglial, צלחת אותו על מנות פטרי מצופה 100 מילימטר.הדגירה את מנות פטרי במשך 15 דקות באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. זה מאפשר הסרה של תאים microglial באמצעות הידבקות מהירה דיפרנציאלית על פני המנה. בינתיים, מלאו כל בקבוק T-150 ב-25 מיליליטר של מדיום תרבות חם ומוכן טרי ודגירה באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני עד לרעידות השניות.לאחר מכן, מעבירים את העל-טבעי ממנות פטרי למנות פטרי חדשות שאינן מצופות באורך 100 מ"מ כדי לאפשר הידבקות בתאי מיקרו-גליאליים שיורית. הדגירה את מנות פטרי במשך 15 דקות באינקובטור לח ב 37 צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. מוציאים את העל-טבעי מכל שתי מנות פטרי, המכילות תאי שושלת אוליגודנדרוציטים שאינם חסידים, ומעבירים אותו לצינור של 50 מיליליטר.השליכו את מנות פטרי מצופות במיקרוגליה. צנטריפוגה הצינורות במשך חמש דקות ב 423 פעמים g. בזהירות להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא עם מיליליטר אחד של מדיום בוטנשטיין-סאטו.בריכת כל כדורי בצינור 50 מיליליטר משותף ולהתאים את עוצמת הקול ל 20 או 30 מיליליטר בהתאם לצפיפות התא עם מדיום Bottenstein-Sato. צלחת שתיים או שלוש מנות פטרי 100 מ"מ מראש עם 10 מיליליטר של ההשעיה התא. דגירה באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני.שעתיים לאחר מכן, נקה את הפסולת ממנות פטרי על ידי רענון כל מדיום בוטנשטיין-סאטו. אינקובט במשך יומיים במדיום באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לאחר יומיים, לבחון את התרבות תחת מיקרוסקופ.במכסה המנוע לזרימה למינארית, בתנאים סטריליים, לחדש את מדיום התרבות עם 10 מיליליטר של MPB-27 בינוני חם. אינקובט במשך יומיים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. כדי לקצור את OCM, לאסוף את העל טבעי המכיל אוליגודנדרוציטים מופרש גורמים.המסנן מעקר את ה- OCM באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. בפרוטוקול זה, תאי שושלת אוליגודנדרוציטים טוהרו מתרבויות גליה על ידי טלטול אסטרוציטים ומיקרוגליה. ניתוח של הביטוי של סמנים שונים הצביע על כך שתרבויות אוליגודנדרוציטים היו בעיקר טרום אוליגודנדרוציטים עם 90 פלוס או מינוס 4% של תאים חיוביים O4, 85 פלוס או מינוס 7%NG2 תאים חיוביים, ו 4.7 פלוס או מינוס 2.1% של תאים חיוביים PLP, בעוד 7.2 פלוס או מינוס 2.5% מהתאים היו אסטרוציטים חיוביים GFAP.OCM המיוצר מתרבויות כאלה נוספו בשלושה ימים במבחנה לתרבויות נוירון ההיפוקמפוס מטוהרים. טיפול זה מקדם קיבוץ של חלבונים לנטל. מיאלינציה של נוירונים בהיפוקמפוס נחקרו באמצעות תוספת של אוליגודנדרוסטיות ב 14 ימים במבחנה.בין 20 ל -24 ימים במבחנה, כתמים חיסוניים של סמני מיאלין, כגון חלבון בסיסי מיאלין, אפשרו הדמיה של מקטעי מיאלין וצמתים של Ranvier. Core PBS חשוב להסרת קרום ההת קרום. ניקוי מהיר הוא קריטי עבור oligodendroctyes הכדאיות ומימוש החוזקות של הזרימה להחיל עם פיפטה.מדיום מותנה אוליגודנדרוציטים ניתן להוסיף תרבויות עצביות כדי לקבל תובנה על ההשפעה של oligodendroctyes מופרש גורמים על פיזיולוגיה עצבית. תרבויות שותף של אוליגודנדרוסטיות עם נוירונים יכולות להתבצע גם כדי ללמוד את תהליך ההיריון.

generation-oligodendrocytes-oligodendrocyte-conditioned-medium-for-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מתאר שיטות להפיק אוכלוסיות מועשר Murine של תאים מבשר oligodendrocyte (OPCs) בתרבות העיקרי, אשר להבדיל לייצר oligodendrocytes בוגרת (OLS). בנוסף, דו"ח זה מתאר את טכניקות כדי לייצר Murine myelinating שיתוף תרבויות על ידי זריעת OPCs העכבר על המיטה neurite של הגב עכבר שורש עצב הגנגליון (DRGNs).

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

ראשוני, תאים אנושיים עובריים מופקים ממוח, multipotential progenitor...

מערכת מוליד-נגזר Oligodendrocyte תרבות ממוח העוברי של אדם

סרטון זה מדגים פרוטוקול מפורט לבידוד דפנות החדר הצידי ממוחו של עכבר בוגר וביצוע דיסוציאציה אנזימטית של רקמות להשגת תאים בודדים. תאים אלה נתונים לאחר מכן לתנאי תרבית ספציפיים המשפרים באופן סלקטיבי את התפשטות תאי גזע עצביים ומקדמים את התמיינותם לתרביות משותפות של אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים.

השגת תרבית אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים מעורבת מתאי גזע עצביים של עכברים בוגרים

סרטון זה מדגים את הקמתה של תרבית משותפת של תאי עצב המושרים על ידי בני אדם (iNs) ותאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים מושרים (iOPCs). iNs מעורבבים עם iOPCs בתרבית משותפת ולאחר מכן מודגרים כדי לתמוך בהבשלה של iNs לנוירונים ו- iOPCs לאוליגודנדרוציטים. תאי עצב יוצרים קשרים סינפטיים עם תאי עצב ואוליגודנדרוציטים אחרים, בעוד שאוליגודנדרוציטים מפתחים מעטה מיאלין סביב אקסוני הנוירונים.

שיטת תרבית משותפת למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

הסרטון מדגים פרוטוקול להבחנה של תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (OPC) לאוליגודנדרוציטים וגרימת מיאלינציה בתרבית משותפת עם נוירונים של גנגליון שורש גבי (DRG). ה-OPCs מומרים עם וקטורים לנטי-ויראליים המקודדים חלבון איתות המווסת את המיאלינציה. ה-OPCs המומרים מתורבתים יחד עם נוירוני DRG כדי להעריך את ההתמיינות לאוליגודנדרוציטים ואת המיאלינציה הנגרמת על ידי חלבון איתות.

בדיקת מיאלינציה הנגרמת על ידי התמרה חוץ גופית עבור תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים

סרטון זה מדגים את הייצור של תווך מותנה אוליגודנדרוציטים (OCM) מתאי שושלת אוליגודנדרוציטים על ידי הדגשה שלהם כדי להגביר את שחרורם המולקולרי למדיום. התווך הזה, שעשיר בגורמי גדילה, ציטוקינים ומולקולות ביו-אקטיביות אחרות, יכול להתווסף לתרביות נוירונים כדי לקבל תובנה לגבי ההשפעה של גורמים המופרשים על-ידי אוליגודנדרוציטים על הפיזיולוגיה והקישוריות העצבית.

שיטה ליצירת מדיום מותנה אוליגודנדרוציטים

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (OPC) מקליפת המוח של גור העכבר.

בידוד וטיפוח תאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים מקליפת המוח של גור עכבר

תאים גלובואידים הם מאפיין פתולוגי מגדיר של מחלת קראב, לויקודיסטרופיה שכיום חסר טיפול יעיל לטווח ארוך. פיתחנו מודל תרבית תאים כדי לחקור את הביולוגיה המולדת והפוטנציאל הפתוגני של מיקרוגליה מופעלת והפיכתם לתאים גלובואידים.

במבחנה דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בLeukodystrophy הסלולרי Globoid

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המציעים בסיס גמיש ואסטרטגי למניפולציה ויראלית של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים כדי לבטא יתר על המידה חלבונים מעניינים על מנת לחקור באופן ספציפי את תפקידם באוליגודנדרוציטים באמצעות מודל מבחנה של מיאלינציה של מערכת העצבים המרכזית.

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל במבחנה מבחני myelination

האינטראקציות הנוירוניות-גליאליות בניוון עצבי אינן מובנות היטב בשל כלים ושיטות לא מספקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים ממוטבים להשגת תאי עצב מושרים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומספקים דוגמאות לערכים של שיטות אלה בהבנת תרומות ספציפיות לסוג התא במחלת אלצהיימר.

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

אנו מתארים את הייצור של תרבויות מעורבות של אסטרוציטים ותאי מבשר אוליגודנדרוציטים הנגזרים מתאי גזע עצביים עובריים או בוגרים המתבדלים לאוליגודנדרוציטים בוגרים, ומודלים במבחנה של גירויים מזיקים. הצימוד עם טכניקת סינון תוכן גבוהה מבוססת תא בונה מערכת סינון סמים אמינה וחזקה.

בידול וניתוח התבגרות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים שמקורם בתאי גזע עצביים

למד שיטה יעילה לטיהור תאי אוליגודנדרוציטים וייצור תרבית מותנית לחקר מנגנוני מיאלינציה ואינטראקציות עם נוירונים. שיטה זו תורמת להבנת תהליכי שיקום מיאלין במחלות דמיאלינציה.

דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף

גלה סרטונים נוספים