Name: בידוד של התאים המוננובית מונמונומנט ללמוד Ex Vivo מולדת תגובות החיסונית ברקמת הלימפה של האדם Mucosal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: למדו שיטה לבידוד תאים מונונוקליאריים מבלוטות שקדיות לחקר תגובות חיסון מולדות ברקמות ריריות אנושיות. הטכניקה שומרת על שלמות התאים למחקר ex vivo ומספקת מודל רלוונטי יותר מתאי דם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה הזאת נתמכת על ידי הסוכנות הלאומית למחקר הלאומי של הסוכנות למען הפרקליט המחוזי (J-P. ח) לניסויים ומלגת N.B. (AAP 2017 166). נ מאשר תמיכה של anrs עבור ההתחברות (aap 2016 1), הארגון האירופי לביולוגיה מולקולרית embo עבור ההתחברות (LT 834 2017), תוכנית מימון ההפעלה "באושטיין" של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת Ulm (lsbn. 0147) ו הגרמני forschans544/1 1 gealllllllllllll

הדגימות לא נאספו במיוחד למטרות מחקר והמחקר אינו נחשב פולשני. עם זאת, איסוף השקדים האנושיים דורש אישור מוסרי של הרשויות הרלוונטיות המקומיות. במקרה שלנו, היא אושרה על ידי הגנת האגודה דה אישית (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). יתרה מזאת, הסכמה של כל מטופל או נציג משפטי מתבקשים להשיג נתונים אישיים של תורמים (למשל, מין, גיל, היסטוריה של דלקות ENT) שיכולות לסייע בפענוח תוצאות נסיוניות.
1. טיפול ברקמת המין האנושי
<ol><li>שים שקדים מכל תורם בבקבוקון 50 mL סטרילי אחד המכיל 25 מ"ל PBS 1x ותחבורה בטמפרטורת החדר (RT) למעבדה על פי המלצות הרשות (להשתמש בשלוש רמות של הגנה: בבקבוקונים, תיבת בטיחות, ושקית). הערה: ההליך כולו צריך להתבצע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2. יש לטפל בכל היצורים האנושיים בזהירות כאשר הם לא היו מוסמכים בעבר ועשויים להכיל סוכנים מדבקים.</li>
	<li>
נקה את כל הכלים בין כל שימוש.
	<ol>
<li>לאחר השימוש, לפרק את מסננת התא ולשמור עם כל המכשירים האחרים (למשל, pestle מלקחיים) באמבטיה המכילה פתרון חומרי ניקוי (1/10 אבקת נפח ב H2O) לילה.</li>
		<li>מצחצח כל כלי כדי להסיר את הרקמה ולשטוף עם מים צלולים.</li>
		<li>יבש כל החלקים היטב, ולאחר מכן להכין את מסננת התא (85 mL, 37 מ"מ בקוטר) על ידי הצבת רשת שינוי 60 פלדה על גבי רשת של 10 רשת שינוי פלדה ולסגור היטב את הטבעת.</li>
		<li>מניחים את כל הכלים בשקיות סטרילי וחיטוי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. חיתוך רקמת המין האנושי ובידוד התאים המונציריים (TMCs)
<ol><li>מניחים את התא מסננת על 1 150 x 25 מ"מ2 (SPL150) מאכל תרבות התא ואת כל המכשירים ב SPL150 אחר כדי לשמור אותם סטרילי.</li>
	<li>להעביר את השקדים מן הבקבוקון לתוך מסננת התא באמצעות מלקחיים סטרילי. גם לשפוך את כל ה-PBS, אשר מכיל כמה תאים שגרזו את השקדים. במקרה הצורך, להוסיף יותר PBS לטבול את הרשת. הערה: הרקמה צריכה להיות שקועה כל הזמן. כדי להימנע מייבוש</li>
	<li>מסירים רקמה מדממת, עקובה מדם ופיברואיד בעזרת מלקחיים ואזמל. הערה: שקדים הוסרו מילדים אינם זקוקים לשלב זה.</li>
	<li>חותכים את הרקמות לחתיכות קטנות של פחות מ 0.5 ס מ בקוטר באמצעות האזמל ואת הפינצטה מעוקל. חותכים את כל הרקמה כך חתיכות קטנות יכול להיות שקוע כל הזמן.</li>
	<li>מניחים כמה חתיכות של רקמה בתוך מסננת התא ומגרדים אותם על הרשת עם מברשת זכוכית עד שרק שכבה דקה באמת של משתית לבן שרידים. להסיר ולמחוק את הסטרומה כדי למנוע סתימת הרשת.</li>
	<li>לאחר כל הרקמות כבר סחוט דרך הרשת, להשתמש בצינורות 10 מ"ל כדי להעביר את כל ההשעיה התא על הרשת ולגרד אותו פעם אחת האחרונה.</li>
	<li>העבר את המתלה לתא עם מתלה 10 מ ל לתוך בקבוקון סטרילי. שטוף את הרשת ואת מסננת התא עם PBS 1x. תן השעיה התא מנוחה 5 דקות ב RT על הספסל. שלב זה מאפשר את המשקעים ואת הזרע של שאריות משתית, תאים מתים, וכל דנ א שוחרר, ויהיה להקל על השלב הבא.</li>
	<li>מניחים הנפה סטרילית 70 יקרומטר על גבי בקבוקון חדש 50 mL (להסיר בזהירות מן המעטפה) ובעדינות להעביר את התא הבולם על זה עם מעטפת 10 mL. אין לערבב את ההשעיה, כי גלולה היא לעתים קרובות נוכח. אם המכתש הוא סתום, השתמש בגב של קצה סטרילי 1 mL לשרוט את התאים שוקת המסננת. שנה את הסננת בתדירות הנדרשת.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 250 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה על ידי ערבוב בעדינות את הבקבוקון, ואז להשעות מחדש את התאים ב 35 mL של PBS.</li>
	<li>במבחנה חדשה, מקום חדש 70 יקרומטר הנפה על גבי ולהעביר את ההשעיה התא על זה עם פיפטה 10 mL. אם המכתש סתום, השתמש בטכניקה המפורטת בשלב 2.7.</li>
</ol>3. בידוד של ה-TMCs באמצעות הדרגה של צפיפות התא
הערה: ניתן להשתמש ב-TMCs לאחר שלב 2.10. עם זאת, כדי לקבל פתרון תא ברור יותר להסיר פסולת תא אחרים כל התאים האדומים, מומלץ לבצע צפיפות תא הדרגתי בידוד של תאים mon, ברור.
<ol><li>הוסף 15 מ ל של הצפיפות מעבר הצבע בינונית (d = 1.076 g/mL) בבקבוקון חדש 50 mL. יוצקים את הפתרון TMCs על גבי בינוני מעבר הצבע, להיות זהיר כדי למזער את ערבוב של ההשעיה עם המדיום מעבר הדרגתי צפיפות.</li>
	<li>צנטריפוגה את הפתרון ב 1,000 x g עבור 30 דקות ב-RT עם האצת ולנתק.</li>
	<li>להסיר עם הצינורות 10 מ ל ולמחוק את השכבה העליונה (מכיל בעיקר PBS 1x) מבלי להפריע את הממשק בין TMCs לבין המדיום הצפיפות מעבר הצבע. הערה: TMCs מכיל מספר נמוך של אריתרופוציטים, ולכן הפתרון ברור. כך, הממשק בין הפתרון של TMCs ב-PBS ואת מעבר הצבע הבינוני בצפיפות יכול להיות קשה לדמיין. לפיכך, תאים ניתן להשעות מחדש ב-RPMI 1640 שיושלם עם 20 מ"מ HEPES (ללא FBS) לפני מעבר הדרגתי צפיפות מבוצע.</li>
	<li>הסר את TMCs עם עצה סטרילית 1 mL ומקום בבקבוקון 50 mL חדש.</li>
	<li>לשטוף את התאים על ידי הוספת 50 mL של PBS המכיל 2% סרום העוברי (FBS) ו 2 מ"מ EDTA ו צנטריפוגה את הצינור ב 250 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' כדי להסיר את טסיות הנותרים.</li>
	<li>חזור על שלב 3.5, אבל לצנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>הכנת התרבות בינונית (R10) על ידי להשלים את RPMI 1640 עם 10% חום מופעל FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, ואת פתרון אנטיביוטי (100 U/mL penicליום ו 100 μg/mL סטרפטומיצין).</li>
	<li>השהה מחדש את ה-TMCs ב-10 מ ל של R10 וספור את התאים. בממוצע, טכניקה זו תשואות 5 x 108-2 x 109 tmcs לכל זוג של שקדים. התאים יכולים לשמש כעת עבור חקירות כמו PBMCs מכל הדם (למשל, טיהור של סוג תא ספציפי, התרבות התא, cy, זרם הציטוזה, RT-qPCR, קופא, וכו ').</li>
	<li>
במקרה הצורך, הקפא את התאים לשימוש נוסף באמצעות טכניקות סטנדרטיות להקפאה של התא הראשי.
	<ol>
<li>ספור את מספר התאים.</li>
		<li>צנטריפוגה את התאים. ותסיר את הסופרנטאנט מפזר את הגלולה במספיק 100% FBS עבור ריכוז סופי של 1 x 108 תאים/mL, ולאחר מכן להוסיף את אותו כמות של 80% fbs + 20% dmso פתרון. התאים יהיו לאחר מכן ב 5 x 107 תאים/mL. שלב זה צריך להתבצע ב-4 ° c והפתרון FBS ו-DMSO צריך להישמר ב -4 ° c לפני השימוש.</li>
		<li>פזר 1 מ ל של פתרון התא לתוך קריוצינורות ולשים אותם במיכל קפוא איטי שהיה ב 4 ° c לילה כדי לשלוט על קצב הקיפאון של התא. מניחים אותו ב-80 ° c.</li>
		<li>כדי להפשיר את התאים, הניחו את הקריובקבוקונים באמבט חם ב-37 ° c לכמה שניות עם עצבנות מתמדת. ברגע התאים מתחילים להפשיר, להעביר אותם 49 mL של R10 וצנטריפוגה להסיר DMSO. ספור את התאים והשתמש בהם כ-PBMCs. הערה: למרות הקפאת והפשרה TMCs יסיר פסולת, זה גם יפגע כמה סוגי תאים נדירים. אם הגושים או פסולת נוכחים לאחר הפשרה, עדיף לעבור את ההשעיה התא באמצעות מסננת 70 יקרומטר סטרילי לפני השימוש בו.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. פנוטיפים לגבי מחשבי TMCs מאת זרם הציטוטרי
<ol><li>לאחזר 5 x 106 תאים מהפתרון הקודם עבור כל התערובת נוגדן פאנל כי צריך להיבדק ומקום בצינור 5 מ ל cy, לנסות. אחזר 1 x 106 תאים עבור הפקד הבלתי מוכתם.</li>
	<li>לשטוף את התאים PBS ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. השהה אותם מחדש ב-500 μL של PBS (1 x 106 תאים/mL) ו דגירה עם כתם הכדאיות עבור 30 דקות ב 4 ° c בחושך.</li>
	<li>הוסף 5 μL חום האדם המופעל בסרום AB לכל 100 μL של ההשעיה של התא ו מודטה עבור 15 דקות ב 4 ° c בחושך.</li>
	<li>שטוף את התאים ב-PBS + 2% FBS + 2 מ"מ EDTA (לשטוף מאגר) ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>השהה מחדש את ה-TMCs ב-500 μL של מאגר הכביסה המכיל את הנוגדנים כמפורט בטבלה 1. ממחקון את התאים במשך 30 דקות ב -4 ° c בחשכה.</li>
	<li>שטוף את התאים בתוך שטיפת מאגר וצנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. השהה מחדש את מחשבי ה-TMCs ב-500 μL של PBS המכיל 0.5% מהפאראפורמלדהיד. המשיכו בחשכה ב -4 ° c עד הרכישה באמצעות הזרימה של הציטומה. הערה: . מסוכן ביותר השתמש בפתרון מסחרי מוכן לשימוש כדי להכין את הפתרון של 0.5% בחצי הכיוון החצי.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>נוגדן</td>
			<td>שיבוט</td>
			<td>פלואורוכרום</td>
			<td>חברה</td>
		</tr>
<tr>
<td>חי מת</td>
			<td></td>
			<td>BV405</td>
			<td>תרמופישר מדעי</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>SP34-2</td>
			<td>V500</td>
			<td>מיניגן</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>SK1</td>
			<td>אמציאן</td>
			<td>מיניגן</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BW135/80</td>
			<td>ויאובה</td>
			<td>מילטניי ביוטק</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>מיניגן</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>HI30</td>
			<td>PerCP-cy 5.5</td>
			<td>BD</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>HD237</td>
			<td>ECD</td>
			<td>בקמן קולטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD20</td>
			<td>מיכל בן-עמי</td>
			<td>אלקסה פלואור 700</td>
			<td>מיניגן</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>PE-cy7</td>
			<td>מיניגן</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>APC</td>
			<td>מיניגן</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD16</td>
			<td>שלמה כהן</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>מיניגן</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>MEM188</td>
			<td>PE</td>
			<td>מיניגן</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD123</td>
			<td>מיכל כהן</td>
			<td>PE</td>
			<td>מיניגן</td>
		</tr>
<tr>
<td>BDCA-1</td>
			<td>L161</td>
			<td>פסיפיק כחול</td>
			<td>מיניגן</td>
		</tr>
<tr>
<td>BDCA-3</td>
			<td>AD5-14H12</td>
			<td>מיכל הג</td>
			<td>מילטניי ביוטק</td>
		</tr>
<tr>
<td>BDCA-4</td>
			<td>AD5-17 F6</td>
			<td>APC</td>
			<td>מילטניי ביוטק</td>
		</tr>
<tr>
<td>א. ל. ד</td>
			<td>G646-6</td>
			<td>PerCP-cy 5.5</td>
			<td>מיניגן</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11c</td>
			<td>3.9</td>
			<td>אלקסה פלואור 700</td>
			<td>מדעי הביולוגיה</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1: רשימת נוגדנים לאפיון תאים על ידי שטהזרימה.
5. דוגמה להפעלת TMCs ומדידה של הפקת ציטוקין
<ol><li>לדלל את TMCs ב R10 בינונית כדי לקבל ריכוז של 2 x 106 תאים/mL.</li>
	<li>הפץ 400,000 TMCs ב 200 μL של R10 בלוח 96 התחתון עגול היטב.</li>
	<li>כדי להפעיל את התאים, להוסיף 5 μg/mL של הTLR7/8 אגוניסט (R848) בלילה.</li>
	<li>לצנטריפוגה את הצלחות ולאחזר את TMCs ' supernatant ולהקפיא אותו לניתוח נוסף. הייצור cytokine יהיה מוערך באמצעות חרוז מבוססי החיסונית אומר לכמת ציטוקינים מסיסים מרובים בו באמצעות cytokine זרימה בעקבות פרוטוקול של היצרן.</li>
	<li>העריכו את יכולת הכדאיות של התאים באמצעות שיטת הכדאיות של התא הזורח בעקבות פרוטוקול היצרן. בקצרה, להוסיף 60 μL של פתרון הכדאיות של התא לבארות ולמדוד האור בתוך 10 דקות (הרכישה עבור 1 s/טוב).</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+History+of+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses+and+Man%3A+A+History+of+Interactions%22%5BJournal%5D)">A History of Cell Culture.</a> Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).</li>
<li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+%28strain+HeLa%29+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li>
<li>Jones, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Record+of+the+first+physician+to+see+Henrietta+Lacks+at+the+Johns+Hopkins+Hospital%3A+History+of+the+beginning+of+the+HeLa+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).</li>
<li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Testing+of+Candidate+Topical+Microbicides+for+Anti-Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Activity+and+Tissue+Toxicity+in+a+Human+Cervical+Explant+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li>
<li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Colorectal+Explant+Culture+to+Evaluate+Topical+Microbicides+for+the+Prevention+of+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li>
<li>Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Vivo+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue+and+Female+Genital+Mucosa+with+Human+Immunodeficiency+Virus+1+and+Histoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57013(2018).</li>
<li>Elmore, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Histopathology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 687(2006).</li>
<li>Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cells+as+Targets+of+Vaccines+and+Adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Immunopotentiators+in+Modern+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants.</a> Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).</li>
<li>Bachert, C., Möller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+Tonsille+als+MALT+%28mucosa-associated+lymphoid+tissue%29+der+Nasenschleimhaut%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngo-Rhino-Otologie%22%5BJournal%5D)">Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut.</a> Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).</li>
<li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+the+tonsils%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Immunology of the tonsils.</a> Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).</li>
<li>Perry, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specialised+structure+of+crypt+epithelium+in+the+human+palatine+tonsil+and+its+functional+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance.</a> Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).</li>
<li>Cesta, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Structure%2C+Function%2C+and+Histology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).</li>
<li>Kaditis, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obstructive+sleep+disordered+breathing+in+2-to+18-year-old+children%3A+diagnosis+and+management+TASK+FORCE+REPORT+ERS+STATEMENT%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT.</a> European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).</li>
<li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAART+reduces+death+ligand+but+not+death+receptors+in+lymphoid+tissue+of+HIV-infected+patients+and+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).</li>
<li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+IFN-alpha+and+TRAIL%2FDR5+in+lymphoid+tissue+of+progressor+versus+nonprogressor+HIV-1-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).</li>
<li>Smith, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+TLR7-mediated+type+I+IFN+signaling+in+pDCs+through+CXCR4+engagement-A+new+target+for+lupus+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment.</a> Science Advances. 5 (7), eaav9019(2019).</li>
<li>Lucas-Hourani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pyrimidine+biosynthesis+pathway+suppresses+viral+growth+through+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678(2013).</li>
<li>Kleiveland, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Impact+of+Food+Bioactives+on+Health%22%5BJournal%5D)">Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).</li>
<li>Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDCA-1%2B%2C+BDCA-2%2B+and+BDCA-3%2B+dendritic+cells+in+early+human+pregnancy+decidua%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua.</a> Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).</li>
<li>Papaioannou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Dependent+Changes+in+the+Size+of+Adenotonsillar+Tissue+in+Childhood%3A+Implications+for+Sleep-Disordered+Breathing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing.</a> The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

השקדים האנושיים מייצגים מודל אינטגרטיבי ופיזיולוגי ex vivo ללמוד תגובות החיסונית מולדת בממשק רירית, משום שהם לחקות את התפקיד של איבר הלימפה המשני. מעניין, הרכב הסלולר של TMCs דומה ל-PBMCs וכולל את כל אוכלוסיות התאים הגדולות, למרות שהאחוז שלהם יכול להיות שונה מ-PBMCs מדם (איור 1). אוכלוסיות נוספות ניתן למצוא גם, כמו כל התגובות החיסונית מבוצעים ברקמות (רירית או איברי הלימפה משני) ולא בדם.
השימוש ברקמות הגוף האנושי כמו גם בשימוש בתרבית תאים או בתאי דם לכל אחד מהם יש ...

מחקרים על איברי האנוש מוגבלים בשל נגישות, כמו גם סיבות אתיות ברורות. עם זאת, הם חיוניים כדי להבין באופן מלא את המורכבות של הביולוגיה האנושית. תרבויות של תאים מבודדים (התרבויות הראשיות או קווי התא) הם מערכת סטנדרטית בלימודי התא בביולוגיה בשל זמינותם. בעוד תרביות תאים מבודדים אפשרו תגליות מצטיינים, השימוש קווי התא הגיע על בדיקה מקרוב יותר כי הם לא לחקות באופן מלא vivo ביולוגיה איברים. עם זאת, התרבות של תאים תלת מימדיים או explants רקמות הוא מורכב מאוד4,5,6. אכן, פיסת רקמה או איבר הוא הטרודוגני מאוד כי הרכב התא שלה שונה בהתאם לוקליזציה ברקמה. לפיכך, שימוש בקוביות רקמה דורש ניתוח של משכפל טכני וביולוגי רבים, המוביל לצורך של מספר רב של תורמים או חולים.
רירית הקשורים רקמות הלימפה (מאלט) דומים מבחינה מבנית לבלוטות הלימפה אבל יש פונקציות ייחודיות, כי התפקיד העיקרי שלהם היא להסדיר חסינות רירית7. בניגוד לבלוטות הלימפה, אשר ממוקמות בדרך כלל במרחק מסוים מן הרקמות, מאלט ממוקמים בדרך כלל מיד מתחת האפיתל של רקמת רירית. באופן היסטולוגית, הם מורכבים בעיקר של ריכוזים גבוהים של B ו-T תאים, אבל גם אנטיגן הצגת תאים כגון מקרופאגים ותאים דנדריטים. מאלט מהווה כ 50% של רקמת הלימפה בגוף האדם. מאלט מחולקת לתשע קבוצות בהתאם למיקומם: גולט (בטן-), BALT (ברונזה-), NALT (אפי), CALT (לחפון), LALT (גרון), מלח (עור-), VALT (vulvo-), O-בירה (מאורגן), ו D-בירה (מתפזרת) O-מאלט מורכב בעיקר של השקדים של הטבעת הטונשית של וואלדאייר והוא מאלט הנגיש ביותר8,9. אכן, השקדים הממוקמים בoropharynx מהווים את המכשול העיקרי המגן על העיכול והדרכי הנשימה (פוטנציאל) פולשנית מיקרואורגניזמים10. בנוסף, השקדים מכוסים על ידי קשקש משובח שאינו keratinizing אפיתל, נתמך על ידי כמוסה של רקמת חיבור המכיל כלי דם, עצבים, ו lymphatics, מתן גישה קלה לתאים החיסוניים11,12. יתר על כן, ניתוח שקדים, הפעולה הכירורגית של הסרת השקדים, הוא הליך נפוץ ביצוע על ילדים לאחר נשימה שינה מחוסר סדר, הפיכת שקדים רקמות זמין בקלות13 בהגדרות פיסיולוגיים.
שקדים לאפשר את המחקר של תגובת התא החיסונית בפתווגיות מעורבים חסינות רירית. אכן, ב-hiv זיהום, כי השקדים מורכבים ריכוז גבוה של תאים חיסוניים, הם היעד העיקרי של שכפול נגיפי, אך גם לייצר כמות גדולה של ציטוקינים שאינם מזוהים במחזור14,15. במדינות קבועות, אוכלוסיות נדירות של תאים מולדים כמו נמצאים ברקמות רירית שונים, כולל השקדים, אבל הם למעשה נעדרים מדם.
לפיכך, תאים מונוליטיים משקדים (TMCs) הם מודל רלוונטי ומורכב יותר מאשר PBMCs והוא יכול לענות על שאלות עמוקות יותר. מצד שני, השימוש הרחבות רקמות יכול להיות מורכב ולא תמיד רלוונטי למחקרים חיסוניים מולדים. כך, הקמנו מודל לחקור הפעלה חיסונית רירית באמצעות tmcs16. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד יעיל של TMCs מן השקדים האנושיים הטריים. שיטה זו מאפשרת התאוששות של מספר רב של תאים חיסוניים תוך שמירה על היושרה שלהם למחקרים vivo ex.

<table><tbody><tr><td>רשת פלדה 10 רשתות - 1910 ומיקרו; m</td><td>Dutscher</td><td>198586</td><td>להכניס למסננת התא רשת פלדה Cellector</td></tr><tr><td>60 רשתות - 230 ומיקרו; m</td><td>Dutscher</td><td>198591</td><td>להכניס למסננת התאים Cellector</td></tr><tr><td>70 & micro; m מסנני תאים ClearLine לבנים</td><td>Dutscher</td><td>141379C</td><td></td></tr><tr><td>Anios Excell D חומר ניקוי</td><td>Dutscher</td><td>59852</td><td>תמיסת אנטיביוטיקה דטרגנטים</td></tr><tr><td>, 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>100 U/mL Penicilium ו-100 &mu; g/mL Streptomycin - להוספה למצע התרבית</td></tr><tr><td>BD FalconTM צינורות תחתונים עגולים, 5 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>צינורות FACS</td></tr><tr><td>מסננת תאים מסננת, 85 מ"ל וקוטר 37 מ"מ</td><td>Dutscher</td><td>198585</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo (CTG) בדיקת כדאיות תאים זוהרים</td><td>Promega</td><td>G7572</td> בדיקת <td>כדאיות</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים Falcon 50 מ"ל</td><td>Dutscher</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מעוקלת</td><td>Dutscher</td><td>711200</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Sa Salt (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>ללא סידן ומגנזיום</td></tr><tr><td>EnVision</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>מודד את הזוהר</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td></td><td></td><td>להוספה למדיית</td></tr><tr><td>התרבית תוויות פלואורסצנטיות נוגדנים</td><td>ראה טבלה 1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עלי זכוכית</td><td>Dutscher</td><td>198599</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 מ')</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630056</td><td>שימוש בחממה</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> של 20 מ"מ <tr><td>LEGENDplex פאנל תגובה אנושי נגד וירוס</td><td>BioLegend</td><td>740390</td><td>בדיקה חיסונית מבוססת חרוזים</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>StemCell</td><td>7801</td><td>מדיום שיפוע צפיפות</td></tr><tr><td>מיכל Mr. Frosty מיכל Thermo</td><td>Fisher</td><td>5100-0001</td><td>מיכל הקפאה איטית</td></tr><tr><td>פירס 16% פורמלדהיד (w/v), ללא מתנול</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Resiquimod (R848)</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-r848</td><td>TLR7/8 אגוניסט</td></tr><tr><td>RPMI-1640 צלחת</td> תרבית תאים בינונית <td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>SPL, 150 מ"מ x 25 מ"מ (SPL150)</td><td>Dutscher</td><td>330009</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי סטרילי N&deg; 23</td><td>Dutscher</td><td>132523</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBiads פיצוי חרוזים</td><td>תרמו פישר</td><td>01-2222-41</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td>להכנת מאגר כביסה ב-PBS</td></tr></tbody></table>

בידוד של התאים המוננובית מונמונומנט ללמוד ex vivo מולדת תגובות החיסונית ברקמת הלימפה של האדם mucosal

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

לימוד תאים בודדים מרקמות הלימפה הקשורות רירית (מאלט) מאפשר הבנה של תגובת תאים חיסוניים בפתווגיות מעורבים חסינות רירית, כי הם יכולים לדגמן אינטראקציות מארח הפתוגן ברקמה. בעוד תאים מבודדים נגזר מרקמות היו המודל הראשון של תרבות התא, השימוש שלהם הוזנח כי רקמות יכול להיות קשה להשיג. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מסבירים כיצד בקלות לעבד ולהתרבות התאים המוננוציליים של האדם (tmcs) מפני השקדים האנושיים בריאים כדי לחקור את התגובות החיסונית מולדים על ההפעלה, מחקה זיהום נגיפי ברקמות רירית. בידוד של TMCs מן השקדים הוא מהיר, כי השקדים בקושי יש אפיתל כל התשואה עד מיליארדי כל סוגי התא החיסונית העיקריים. שיטה זו מאפשרת זיהוי של הייצור cy, באמצעות מספר טכניקות, כולל חיסוני, qPCR, מיקרוסקופ, זרימה cy, ועוד., בדומה לשימוש בתאים היקפיים ברורים (PBMCs) מהדם. יתרה מזאת, TMCs מראים רגישות גבוהה יותר לבדיקות סמים מאשר PBMCs, אשר צריך להיחשב עבור רעילות בעתיד. כך, התרבויות vivo tmcs לשעבר הם מודל רירית קלה ונגישה.

לראשונה אפיינו את הפרופיל החיסוני של תאים נוכח בתרבות וניתח את כמות TMCs. . בעזרת השקדים והטטוטונסות כפי שמוצג באיור 1, כל סוגי התא החיסונית העיקריים הקיימים pbmcs מהדם היו מייצגים tmcs מן השקדים. עם זאת, ב-TMCs התדירות של כל סוגי התאים, למעט תאים B, היו נמוכים מ-PBMCs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60914/60914fig1.jpg"> איור 1: פנוטיפים של TMCs בשקדים.</stron...

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מסבירים כיצד בקלות לעבד ולהתרבות התאים באופן ברור מבני אדם בריאים שעברו ניתוח שקדים ניתוחים חלקיים כדי לחקור את התגובות החיסונית מולדים על ההפעלה, מחקה זיהום נגיפי ברקמות רירית.

בידוד של התאים המוננובית מונמונומנט ללמוד Ex Vivo מולדת תגובות החיסונית ברקמת הלימפה של האדם Mucosal

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

תאי מונונוקלאר שקדים רלוונטיים ומורכבים יותר מתאי דם, ובידודם מאפשר לחקור את תגובת תאי החיסון בפתולוגיות הכוללות חסינות ריר. הטכניקה שהקמנו מאפשרת התאוששות של מספר רב של תאים חיסוניים מרקמה ריר תוך שמירה על שלמותם למחקרי אקס ויוו. השיטה היא פשוטה למדי, אבל השקדים צריכים להיות מטופלים במהירות ובזהירות על מנת למקסם את התשואה.להעביר את רקמת השקדים האנושית למעבדה כמתואר בטקסט כתב היד. לאחר מכן, מניחים את מסננת התא על צלחת תרבות 150 על 25 מילימטר. מניחים את כל כלי הניתוח בצלחת אחרת כדי לשמור אותם סטריליים.כל הדגימות העיקריות שלך צריך להיות מטופל בזהירות כפי שהם לא היו מוסמכים בעבר עשוי להכיל סוכנים זיהומיות. ואז לשפוך את PBS מן הבקבוקון לתוך מסננת, כי זה יכיל כמה תאים כי יש יציאה השקדים. באמצעות מטלאים סטריליים, להעביר את השקדים מן הבקבוקון לתוך צלחת התרבות באמצעות מטלאים סטריליים.במידת הצורך, הוסף PBS נוסף כדי לטבול את הרשת. הניתוח ייקח בערך 45 דקות לכל שקדים. זה חיוני כי במהלך תקופה זו השקדים שקועים כדי להבטיח כדאיות טובה ותפוקת התא.הסר רקמה מדממת שרירן צרוב באמצעות ממטרות ואזמל. בעזרת האזמל והפינצטה המעוקלת, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות בקוטר של פחות מחצי סנטימטר. חותכים את כל הרקמה, כך חתיכות קטנות ניתן לטבול בכל עת.מניחים כמה חתיכות של רקמה מסננת התא. מגרדים אותם לרשת עם עלה זכוכית עד שנותרה רק שכבה דקה מאוד של סטרומה לבנה. הסר ומחק את הסטרומה כדי למנוע סתימת הרשת.לאחר מכן השתמש פיפסה 10 מיליליטר כדי להעביר את ההשעיה התא לרשת ולגרד אותו בפעם האחרונה. לאחר מכן, השתמש פיגט 10 מיליליטר כדי להעביר את ההשעיה התא לתוך בקבוקון סטרילי. לשטוף את הרשת ואת מסננת התא עם PBS פעם אחת, ולהעביר את PBS לבקבוקון גם.לפני שתמשיך לתת את ההשעיה התא לנוח על הספסל במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מניחים מסמר 70 מיקרומטר סטרילי על גבי בקבוקון חדש של 50 מיליליטר. מעבירים בעדינות את ההשעיה של התא אל המסמר עם פיפסה של 10 מיליליטר.אם המנזר סתום, השתמש בחלק האחורי של קצה פיפיאט סטרילי של מיליליטר כדי לגרד את התאים דרך המנזר. שנה את המסנב לעתים קרובות ככל הנדרש. צנטריפוגה התאים ב 250 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה, השלך את העל-טבעי. להשעות מחדש את גלולה על ידי הקשה בעדינות על הבקבוקון, ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב 35 מיליליטר של PBS. כדי להשלים את השלב הראשון של בידוד התאים, מניחים מסמרון חדש של 70 מיקרומטר על גבי בקבוקון חדש ומעבירים אליו את מתלי התא עם פיפיאט של 10 מיליליטר.כדי להשיג פתרון תא ברור יותר, התחל בהוספת 15 מיליליטר של מדיום הדרגתי בצפיפות לבקבוקון חדש של 50 מיליליטר. יוצקים את פתרון TMC על גבי המדיום הדרגתי צפיפות, נזהר למזער את הערבוב. לאחר מכן, צנטריפוגה הפתרון ב 1000 פעמים g במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם האצה ובלם כבוי.לאחר הסרת הבקבוקון מהצנטריפוגה, השתמשו בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להסיר ולהשליך את השכבה העליונה. אל תפריע לממשק בין ה- TMCs לבין מדיום מעבר הצבע של הצפיפות. לאחר מכן הסר את TMCs עם קצה פיפטה סטרילי אחד מיליליטר ולהעביר אותם לבקבוקון חדש 50 מיליליטר.כדי לשטוף את התאים, תחילה להוסיף 50 מיליליטר של PBS המכיל 2%סרום בקר עוברי ו 2 מילימולרי EDTA. ואז צנטריפוגה הצינור ב 250 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים שוב, אבל הפעם צנטריפוגה הצינור ב 400 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.הכן את מדיום תרבות R10 על ידי השלמת RPMI 1640 עם FBS מושבת בחום של 10%, 2 מילימולרים L-גלוטמין, ואת הפתרון האנטיביוטי. להשעות מחדש את TMCs ב 10 מיליליטר של R10. אז תספור את התאים.ניתן להשתמש בתאים באופן מיידי או להקפיא אותם לשימוש עתידי כמתואר בכתב היד. TMCs היו מוכתמים, דגירה עם נוגדנים, מאופיין באמצעות ציטומטריה זרימה. TMCs הכילו את כל סוגי תאי החיסון העיקריים הקיימים בתאים חד-גרעיניים היקפיים מדם, PMBC מקוצר.עם זאת, התדרים של כל סוגי התאים, למעט תאי B, היו נמוכים יותר ב- TMCs מאשר במחשבים אישיים. כדי לחקור את הפעלת התא בייצור ציטוקינים, TMCs היו מגורה בן לילה עם R848 resiquimod. TMCs, התווה בכחול, הפיק את כל הציטוקינים שנבדקו למעט IFN Lambda 2/3 ו IL-8, אם כי הייצור היה נמוך יותר מאשר PBMCs, התווה בירוק.עליות קיפול השוואת גירוי R848 ללא גירוי נרשמות באדום. גושי רקמה מטוהרים ומבודדים, כחולים ושקדים, כתומים, היו מגורים במשך 24 שעות עם שפעת A וירוס, IAV. ייצור IFN זוהה ב- TMCs אך לא ב- supernatant של גושי הרקמות המציין כי מתפוצצי רקמות אינם המודל הטוב ביותר לחקר הפרשת ציטוקינים והפעלת תאים.לאחר הדגירה מראש עם התרופה הרעילה C1 וגירוי עם R848, TMCs ו- PBMCs הומתו על הכדאיות. TMCs היו רגישים יותר ל- C1. זה מרמז כי תרופות חדשות בטיפולים עתידיים צריך להיבדק בתאים מרקמות, לא רק על קווי תאים, PBMCs, או מתפוצץ רקמות. הליך זה מאפשר לנו להשתמש TMCs כמו PBMCs מדם שלם ולבצע את אותם ניסויים הסלולר כגון טיהור של סוג תא מסוים, תרבות התא, ציטומטריה זרימה או הקפאה.בידודים של TMCs מאפשר לאפיין טוב יותר, במודל רלוונטי, את התגובה החיסונית באיברים לימפואידיים משניים בפתולוגיות הכוללות חסינות ריר.

isolation-tonsillar-mononuclear-cells-to-study-ex-vivo-innate-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטות לבחון את תרומתם של האף והלוע הקשורים רקמות lymphoreticular (NALT) על המערכת החיסונית האף מערכתית של עכברים לחיסונים אפי מתוארים. אנחנו מדגימים ניתוח לבסס מודל NALT תלוי...

לבחון את תפקידה של רקמות האף והלוע הקשורים Lymphoreticular (NALT) בתגובות עכבר לחיסונים

יש התעניינות הולכת וגובר בהבנת הפונקציות החיסוניות של אוכלוסיות מסוימות של תאים בתיקונים של Peyer (PPS), אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים כרוכות בכך. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לניתוח cytometric זרימה וcryosections PP לimmunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

בידוד של תאי סטרומה של בלוטות הלימפה הוא הליך רב-שלבי הכולל עיכול אנזימטי ופירוק מכני להשגת תאי רשתית פיברובלסטיים, תאי לימפה ותאי אנדותל בדם. בהליך המתואר, עיכול קצר משולב עם פירוק מכני אוטומטי כדי למזער את פירוק סמני פני השטח של תאי סטרומה של בלוטות לימפה קיימות.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

שקדים פלטינים הם מקור עשיר ללימפוציטים B ו-T. כאן אנו מספקים פרוטוקול קל, יעיל ומהיר לבידוד לימפוציטים B ו-T מהשקדים הפלאטיניים האנושיים. השיטה המתוארת הותאמה במיוחד למחקרים על האטיולוגיה הנגיפית של דלקת שקדים המכונה דלקת שקדים.

פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

הקמנו טכניקה הבידוד, אפיון פנוטיפי ופונקציונלי ניתוח של תאים חיסוניים מן החניכיים בעכברים.

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

יש עניין גובר באפיון הכמותי של לימפוציטים במעי עקב ההכרה הגוברת בכך שתאים אלה ממלאים תפקיד קריטי במגוון מחלות מעיים ומערכתיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד אוכלוסיות תאים בודדים מתאי מעי דק שונים לאפיון ציטומטרי זרימה לאחר מכן.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את התאים המונונרורים השוכנים בתוך המעי הגס של הנקודתיים על ידי העיכול אנזימטית של הרקמה באמצעות קולגן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל של תאים מוניוצלולים וכתוצאה מכך השעיית תא בודד אשר בתורו יכול לשמש עבור immunophenotyping קלדה חזקה.

בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז

תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 (ILC2s), המעורבים בדלקת מסוג 2, משתתפים בעיקר בתגובה לזיהום הלמינת'ס, מחלות אלרגיות, הומאוסטזיס מטבולי ותיקון רקמות. במחקר זה מודגם הליך לבידוד ILC2s מרירית האף וזיהוי הביטוי של CD226.

בידוד תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 מרירית האף של העכבר כדי לזהות את הביטוי של CD226

למדו שיטה לבידוד תאים מונונוקליאריים מבלוטות שקדיות לחקר תגובות חיסון מולדות ברקמות ריריות אנושיות. הטכניקה שומרת על שלמות התאים למחקר ex vivo ומספקת מודל רלוונטי יותר מתאי דם.

בידוד של התאים המוננובית מונמונומנט ללמוד Ex Vivo מולדת תגובות החיסונית ברקמת הלימפה של האדם Mucosal

גלה סרטונים נוספים